Name: screening for thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase inhibitors
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Jane y Aatos Erkko y la BBSRC (BB/M021610) a Adrian Goldman, la Academia de Finlandia (no 308105) a Keni Vidilaseris, (no 310297) a Henri Xhaard, y (no 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, y los Fondos de Investigación de la Universidad de Helsinki a Gustav Boije af Genns. Los autores agradecen a Bernadette Gehl por su ayuda técnica durante el proyecto.

1. Preparación de proteínas
NOTA: La expresión y purificación de TmPPase se ha descrito en otros lugares13.
<ol><li>Preparar 10 ml de la solución tampón de reactivación que contiene 20 mM 2-(N-morpholino)ácido etanosulfónico (MES) pH 6,5, 3,5% (v/v) glicerol, ditiothreitol de 2 mM (TDT) y 0,05% de dodecil maltoside (DDM).</li>
	<li>Preparar 10 ml de la mezcla de reacción que contiene 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2, 333 mM KCl, y 67 m...

<ol>
	<li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+research+in+drug+discovery.">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li><li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets.">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li><li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+pyrophosphatases:+a+novel+drug+target+for+human+pathogens.">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li><li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrophosphate-Fueled+Na++and+H++Transport+in+Prokaryotes.">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li><li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H+-PPases:+yesterday,+today+and+tomorrow.">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vacuolar-H+-pyrophosphatase+(TgVP1)+is+required+for+microneme+secretion,+host+cell+invasion,+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii.">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li><li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice.">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li><li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity.">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li><li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor.">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li><li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H+-translocating+pyrophosphatase.">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li><li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+colorimetric+determination+of+phosphorus.">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li><li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited:+Opening+the+black+box.">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li><li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases.">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li><li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity.">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li><li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates.">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li><li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin.">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li><li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K++as+a+cofactor.">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li></ol>

Aquí informamos de un protocolo detallado para el cribado simple de inhibidores de la pirofosfatasa ligada a la membrana de T. maritima en un formato de placa de 96 pozos basado en Vidilaseris et al.14. Este protocolo es barato y se basa en ácido 12-fosfomolíbódico, que se forma a partir de ortofosfato y molibdato en condiciones ácidas y reducido a especies de fosfomolibdeno con un color azul distintivo12. Este método es preferido sobre otros protocolos, como...

Aproximadamente el 25% del total de proteínas celulares son proteínas de membrana y alrededor del 60% de ellas son dianas de fármacos1,2. Uno de los fármacos potenciales se dirige a3, pirofosfatasas ligadas a la membrana (mPPases), son las enzimas dimericas que bombean protones y/o iones de sodio a través de la membrana por hidrólisis de pirofosfato en dos ortofosfatos4. mPPases se pueden encontrar en varios organismos5 tales como bacterias, arqueas, plantas, y parásitos protistas, con la excepción de los seres humanos y animales4. En los parásitos protistas, por ejemplo Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii y Trypanosoma brucei,las mPPases son esenciales para la virulencia del parásito6 y el nocaut de esta expresión en los parásitos conducen a la falla en el mantenimiento del pH intracelular tras la exposición al pH básico externo7. Debido a su importancia y falta de proteína homóloga presente en los vertebrados, las mPPases pueden considerarse como posibles dianas farmacológicas para enfermedades protistales3.
El cribado in vitro de inhibidores de mPPase en este trabajo se basa en un sistema modelo TmPPase. TmPPase es un mPPase dependiente del bombeo de iones de sodio y iones de potasio de T. maritima y tiene su actividad óptima a 71oC8. Los beneficios de esta enzima son, por ejemplo, su facilidad en la producción y purificación, una buena estabilidad térmica y una alta actividad específica. TmPPase muestra tanto una alta similitud además de la conservación completa de la posición como la identidad de todos los residuos catalíticos al protista mPPases3,9 y a la estructura resuelta de Vigna radiata10 mPPase. Las estructuras disponibles de TmPPase en diferentes conformaciones también son útiles para el experimento de diseño de fármacos basado en estructuras (como cribado virtual y diseño de novo).
Aquí informamos de un protocolo detallado para el cribado de inhibidores de TmPPase en un formato de placa de pozo 96 (Figura 1). El protocolo se basa en el método colorimétrico de la reacción azul de molibdeno, que fue desarrollado por primera vez por Fiske y Subbarow11. Este método implica la formación de ácido 12-fosfomolíbdico a partir de ortofosfato y molibdato en condiciones ácidas, que luego se reduce para dar especies características de fosfomolibdeno de color azul12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive sealing sheet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium heptamolybdate tetrahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F1412481 636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95212-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite 96Well Multidish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1167431000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)</td>
			<td>Nippon genetics</td>
			<td>FG-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecyl maltoside (DDM)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B2010-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1009901001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidodiphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0631-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-Phosphatidyl choline from soybean lecithin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>429415-100GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8147330500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplate 96-Well PCR Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MLL9651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10680879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nepheloskan Ascent (Type 750)</td>
			<td>Labsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6 software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QBT2 Heating block</td>
			<td>Grant Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium meta-arsenite</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>12897692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Pi)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate dibasic</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71501-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71404-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase inhibitors

Las pirofosfasiasas ligadas a la membrana (mPPases) son enzimas dimericas que se producen en bacterias, arqueas, plantas y parásitos protistas. Estas proteínas clan el pirofosfato en dos moléculas de ortofosfato, que se combina con el bombeo de protones y/o iones de sodio a través de la membrana. Dado que no se producen proteínas homólogas en animales y humanos, los mPPases son buenos candidatos en el diseño de posibles objetivos farmacológicos. Aquí presentamos un protocolo detallado para detectar inhibidores de mPPase utilizando la reacción azul de molibdeno en un sistema de placa de pozo 96. Utilizamos mPPase de la bacteria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como enzima modelo. Este protocolo es simple y económico, produciendo un resultado consistente y robusto. La medición de la absorbancia tarda sólo una hora en completar el protocolo de ensayo de actividad desde el inicio del ensayo hasta la medición de absorción. Dado que el color azul producido en este ensayo es estable durante un largo período de tiempo, los ensayos posteriores se pueden realizar inmediatamente después del lote anterior, y la absorbancia se puede medir más tarde para todos los lotes a la vez. El inconveniente de este protocolo es que se hace manualmente y por lo tanto puede ser agotador, así como requerir buenas habilidades de pipeteo y mantenimiento del tiempo. Además, la solución de arsénito-citrato utilizada en este ensayo contiene arsnito sódico, que es tóxico y debe tratarse con las precauciones necesarias.

En este protocolo, se probaron ocho compuestos (1-8)(Figura 2A)junto con IDP, un inhibidor común de las pirofosfalasas, como un control positivo. Cada compuesto se probó a tres concentraciones diferentes (1 M, 5 m y 20 m) en triplicado. El flujo de trabajo del cribado se muestra en la Figura 1,a partir de la preparación de muestras y reactivos hasta la medición de absorbancia a 860 nm.
Al final de este protocolo, tras la adición ...

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Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Aquí presentamos un método de cribado para inhibidores de la pirofosfatasa ligada a la membrana (de Thermotoga maritima)basado en la reacción azul de molibdeno en un formato de placa de 96 pocillos.

Detección de inhibidores de la pirofosfatasa ligadas a la membrana Thermotoga maritima

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Nuestro protocolo funciona como una herramienta para encontrar compuestos que inhibe la desactividad de la pirofosfatasa ligada a la membrana. Y estos inhibidores se pueden utilizar en el tratamiento de varias enfermedades parasitarias. Este protocolo es barato y simple produciendo color estable durante mucho tiempo sin mostrar ninguna interferencia en presencia de alta concentración de fosfolípidos necesaria para la reactivación de enzimas.Preparar 10 mililitros de la solución tampón de reactivación, que contiene 20 milimolar M-E-S a PH 6.5, 3.5% de volumen por volumen de glicerol, dos mililitrolares D-T-T y 0.05%D-D-M. Preparar 10 mililitros del mezclador de reacción, que contiene 200 tris de milimolar clorhidrato a ocho PH. Cloruro de magnesio de ocho milimolares, cloruro de potasio 333 milimolar y cloruro de sodio 67 milimolar.Preparar 30 miligramos por mililitro liposomas para la reactivación de enzimas. En primer lugar, añadir 10 mililitros de 20 milimolar de clorhidrato de tris a PH ocho, con un D-T-T mililar a 0,3 gramos de alfa fosfatidilcolina L de soja. Ponga el liposoma en hielo y sonicar con un segundo post-intervalos durante un minuto.Haga una pausa durante un minuto y repita hasta que la solución se vuelva amarilla transparente. Aliquot los liposomas en 100 microlitros, congelar el nitrógeno líquido y almacenar a 80 grados Celsius negativos hasta que se utilice. Para reactivar la enzima, descongele la solución liposoma a temperatura ambiente.Mezclar 40 microlitros de la solución liposoma con 22,5 microlitros de 20%D-D-M. Mantener la mezcla a 55 grados centígrados durante 15 minutos. Y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.A continuación, agregue 36,5 microlitros de la solución de búfer de reactivación. Mezcle y agregue un microlitro de proteína concentrada para hacer una concentración total de 0,13 miligramos por mililitro. A continuación, transfiera 20 microlitros de la enzima reactivada a 1480 microlitros de la mezcla de reacción.Mezclar suavemente y usar inmediatamente. En primer lugar, disolver los compuestos en D-M-S-O para hacer soluciones de stock de 50 milimolar en 200 microlitros. Para compuestos solubles, diluya la solución de stock con agua a un mililitro en microtubos, para dar dos, 10 y 100 micromolares.Para cada dilución, vórtice la solución compuesta para una mezcla adecuada. Después de eso, compruebe si hay divergación de compuestos, y utilizando una pipeta multicanal, dispensar 75 microlitros de la mezcla de reacción en cada pozo en una placa de 96 pozos. Agregue 75 microlitros de cada compuesto y agua como control en triplicado, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.Mida cada pocóter a 300 voltios utilizando un neflómetro de microplaca. Para preparar la solución de citrato de arsenita, pesa cinco gramos de arsenita sódica y cinco gramos de citrato de trisódico dihidrato, disuelve ambos compuestos en 100 mililitros de agua. A continuación, añadir cinco mililitros de ácido acético glacial.Mezclar y añadir agua a 250 mililitros, almacenar a temperatura ambiente protegido de la luz. A continuación, preparar la solución A añadiendo 10 mililitros de hielo frío 0,5 ácido clorhídrico molar a 0,3 gramos de ácido ascórbico Disolver el ácido ascórbico por vórtice. Prepare la solución B añadiendo un mililitro de agua helada a 70 miligramos de tetrahidrato de amonio tetrataomolybdate, y vórtice para disolver.Almacene la solución A y B sobre hielo. Para preparar el estándar de fosfato con una concentración de cero, 62,5, 250 y 500 micromolares para calibración. Agregue cero microlitros, 12,5 microlitros, 50 microlitros y 100 microlitros de 5 fosfato disódico milimio dihidrato a cuatro microtubos que contienen 370 microlitros de la mezcla de reacción.Re cubra hasta un mililitro con agua. Ahora agregue un mililitro de solución B a 10 mililitros de solución A, mezcle a mano y almacene la solución en hielo. Usando una pipeta multicanal, agregue 40 microlitros de cero, 62.5, 250 y 500 micromolares de fosfato estándar a los scripts de tubo en triplicado.A continuación, añada 25 microlitros de solución compuesta y 15 microlitros de la mezcla de solución M-P-P-A de cada tubo. Excepto los tubos que contienen fosfato estándar. Selle las tiras de tubo con una lámina de sellado adhesiva.Corte la hoja de sellado para separar cada tira de tubo. A continuación, preinscinda la muestra durante cinco minutos a 71 grados centígrados. Coloque la muestra en el bloque calefactor con intervalos de 20 segundos entre cada tira.Para cada tira, abra el sellado adhesivo. Usando una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de dos dibásicas de pirofosfato sódico molar. Y mezcle en pipeteando arriba y abajo durante cinco veces.Selle la tira de tubo de nuevo con el mismo sellado. Incubar de nuevo a 71 grados centígrados durante cinco minutos. Después de eso, coloque las muestras en el aparato de enfriamiento con un intervalo de 20 segundos entre cada tira.Dejar enfriar durante cinco minutos y luego centrifugar cada tira brevemente para decantar las gotas de agua debajo de la hoja de sellado. Vuelva a colocar la tira en el aparato de refrigeración, retire el sellado y déjelos enfriar durante otros cinco minutos. A continuación, agregue 60 microlitros de la solución A y B, mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante cinco veces, y mantenga las tiras de tubo en el aparato de enfriamiento durante 10 minutos más.En una campana de humo, agregue 90 microlitros de la solución de citrato de arsenita y manténgalo a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Para producir un color azul estable. Dispensar 180 microlitros de cada mezcla de reacción en una microplaca de poliestireno transparente de 96 pocillos.Utilice un espectrofotómetro de microplacas para medir la absorbancia de cada pozo a 860 nanómetros. En este protocolo, ocho compuestos fueron probados junto con I-D-P, un inhibidor común de la pirofasfatasa como un control positivo. Después de la adición de la solución A y B, y citrato de arsenita, un color azul en 30 minutos de incubación a temperatura ambiente.Las tres concentraciones de compuestos no inhibidores, mostraron la misma intensidad de color azul. Así como E-1 a E-3 sin ningún inhibidor. La gráfica de la actividad enzimática contra la concentración de cada compuesto probado, muestra que el compuesto con actividad de inhibición formó un ajuste de curva no lineal.La gráfica de I-D-P como control positivo, muestra claramente una disminución en la actividad a concentraciones más altas. La curva de inhibición para los compuestos uno, cinco, seis, siete y ocho. Muestra concentraciones inhibitoras medias a 1,7 micromolares, 21,4 micromolares, 58,8 micromolares, 239,0 micromolares y superiores a 500 micromolares, respectivamente.Recuerde prepararse, la solución M-P-P-A. Justo antes del comienzo del ensayo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Investigación

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Cristalografía de rayos X para estudiar la transición del estado oligomérico de la Thermotoga maritima M42 Aminopeptidasse TmPep1050

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