Name: generation of orthotopic pancreatic tumors and ex vivo characterization of tumor-infiltrating t cell cytotoxicity
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity at JoVE.com

ونود ان نشكر دائره الفنيين الحيوانيين والدكتور الزبيتا تالاروفيتشي (معهد بارتس للسرطان ، جامعه الملكة ماري في لندن ، لندن ، المملكة المتحدة) علي مساعدتهم خلال جراحه العظام. ونود أيضا ان نشكر الدكتورة جنيفر مورتون (معهد بيرسون لبحوث السرطان ، غلاسكو ، المملكة المتحدة) لتوجيهها في التقنية الجراحية ، الدكتورة كريستينا غيللي (معهد بارتس للسرطان ، جامعه الملكة ماري في لندن ، لندن ، المملكة المتحدة) لنصيحها بشان هضم الأورام والدكتور فأبيان ماككلاهان (معهد بارتس للسرطان ، جامعه الملكة ماري في لندن ، لندن ، المملكة ونود أيضا ان نشكر مجلس البحوث الطبية ، وصندوق بحوث سرطان البنكرياس (PCFR) والعمل سرطان المبيض الذين مولوا هذا البحث.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

في نماذج الجسم الفيفو من سرطان البنكرياس توفير أدوات لا تقدر بثمن لفهم تطور المرض وتقييم المداواة الجديدة الأهداف3. نموذج المجسم علي وجه الخصوص هو نموذج فعاله من حيث التكلفة واستنساخه التي يمكن تطبيقها في أفواج كبيره من الفئران في وقت واحد4,27. كما يوفر نموذج المجسم البيئة المجهرية والنظام المناعي السليم لنمو الورم ، مما يجعله أكثر ملاءمة من النماذج تحت الجلد والطراز PDX. ومع ذلك ، وجدنا ان بعض عناصر التسلل المناعي يمكن ان تختلف بين نموذج الجهاز التقويمي والفئران الفيلق ، ونموذج murine الذهب القياسية10. أحد الأسباب لهذا يمكن ان يكون نمو الورم المتسارع ينظر في نموذج الهجاء. وقد تم وصف المزيد من الاختلافات في كثافة الخلايا المناعية الفرعية بين المجسمات والنماذج تحت الجلد3,28. ولذلك ، وعلي الرغم من ان نموذج الفيلق المحور وراثيا أكثر تكلفه ومتغير6، ينبغي التحقق من النتائج الرئيسية في مجموعه صغيره من فئران فيلق حماية كوسوفو حيثما أمكن ذلك.
يعد اعداد الخلايا السرطانية للجراحة التقويمية خطوه حاسمه في البروتوكول. يجب ان تكون الخلايا دائما في مرحله السجل من النمو والميكوبلازما-وخاليه من العدوى. يجب تاجيل الجراحة التقويمية إذا كان هناك اي مخاوف بشان نمو الخلايا السرطانية. استخدام غشاء الطابق السفلي يحسن معدل حدوث الورم علي الخلايا بالحقن دون ذلك29 ويقلل من تسرب الخلايا التالي انتشار البريتوني27. ومع ذلك ، مره واحده معلقه في غشاء الطابق السفلي ، يجب حقن الخلايا السرطانية بسرعة (في غضون 2 ساعة) لتجنب اي فقدان الخلايا. من المرجح ان يكون عدد الخلايا السرطانية المطلوبة لتوليد الأورام معتمدا علي الخلايا ، وينبغي اختبار مجموعه من أرقام الخلايا (علي سبيل المثال ، من 100 – 100,000) والتي قد تحدد أيضا الوقت اللازم للوصول إلى نقطه النهاية. فمن المرجح ان يكون هناك هامش خطا عند اعداد 1,000 خلايا لكل ماوس للحقن. لذلك ، إذا كانت هناك حاجه لعده أيام من الجراحة ، يجب ان ينتشر علاج المجموعات علي قدم المساواة عبر الأيام للسيطرة علي الآثار الدفعيه. يمكن تعديل معظم الخطوات الجراحية اعتمادا علي تفضيلات; ومع ذلك ، يجب الحرص علي عدم إزعاج غشاء الطابق السفلي عند استبدال البنكرياس في تجويف البطن أو إغلاق الجدار الصفاقي. يمكن ان يسبب تسرب غشاء القبو نمو الخلايا السرطانية علي الجدار الصفاقي ، والتي تشكل بسرعة ويمكن ان يؤدي إلى الاضطرار إلى التضحية الحيوانية في وقت سابق.
ومن الناحية المثالية ، ينبغي هضم أورام البنكرياس بسرعة بعد الحصاد واعدادها لتحفيز الجسم السابق علي الفور. ومع ذلك ، قد لا يكون هذا ممكنا إذا كان هناك دفعه كبيره من الأورام للحصاد ، في هذه الحالة يجب ان تبقي الأورام علي الجليد وهضمها علي دفعات. وقد تبين ان نوع وتركيز وطول التعرض لانزيمات الجهاز الهضمي تؤثر علي عدد كبير من جزيئات السطح علي الخلايا المناعية30،31،32. ال [هضم تيم] أيضا عمدا قصيرة ان يحد خليه موت33. يمكن تجميد الخلايا المهضومة في وسط التجميد للتخزين علي المدى الطويل. ومع ذلك ، فان بعض فقدان الخلايا تحدث عند الذوبان. عمليه الهضم يمكن ان تكون اقل من الأمثل إذا قطع الورم ليست مكعبات بما فيه الكفاية قبل حضانة كولاجيناز وهذا سيكون واضحا كما ستبقي قطع الورم الثابت في تصفيه بعد الهضم. يمكن خفض تركيز كولاجيناز إذا كان يعمل مع البنكرياس الصحي أو الأورام في مرحله مبكرة. تقارير عن استخراج خلايا الاقنيه البنكرياس صحية استخدام تركيزات اقل بكثير34. وهناك درجه عاليه من الموت الخلايا الظهاريه المتوقع خلال الهضم; ومع ذلك ، يجب ان تتسامح الخلايا المناعية العملية جيدا. توجد طرق بديله لعزل الخلايا الظهاريه القابلة للحياة للنمو العضوي35 أو للحفاظ علي الانسجه المعمارية36.
ويمكن اجراء تعديلات علي بروتوكول التحفيز بسهوله ، اعتمادا علي القراءة المطلوبة والخلية المناعية تحليلها (علي سبيل المثال ، الضامة أو الخلايا B). استخدام الكواشف عموم التحفيز نقدا/ionomycin لا يميز لتحديد TCR-antigen ، مما يجعلها مفيده عندما لا يعرف مستضد. ومع ذلك ، يرتبط إنتاج ifnɣ بشكل وثيق مع المشاركة TCR37 وكل ifnɣ وإنتاج tnfα حاسمه في الاستجابات روبوطيه pdac38. يعكس التحفيز الكهربي الكهربي/ionomycin القدرة القصوى للخلايا التائية لإنتاج السايتوكينات ، والتي قد تنتجها خلايا T داخل البيئة المجهرية للورم. ويمكن قياس الإنتاج الذاتي دون الحاجة إلى التحفيز ؛ ومع ذلك ، قد تكون مستويات اقل بكثير أو غير قابل للكشف. هناك طرق بديله لتحفيز الخلايا T: المضادة لCD3/28-الخرز المغلفة ، والتي لا تتطلب أيضا مستضد أو في الواقع غيرها من الخلايا المناعية السكان. والفائدة من هذه الطريقة هي السماح بالقياس الكمي لإنتاج السايسيسين بواسطة مجموعات فرعيه معينه من خلايا T دون الحاجة إلى أساليب الفصل. علامات أخرى من السمية الخلوية (granzyme ب و تثقيب A) ، والنشاط (IL-2) أو كبت المناعة (آيل-10) يمكن أيضا ان تضاف21. ومع ذلك ، لا تتوفر الأجسام المضادة عاليه الجودة لقياس التدفق الخلوي للكشف عن جميع السايتوكينات والعوامل ذات الاهميه. ولذلك ، إذا كانت هناك تطبيقات أخرى مثل اليسا المطلوبة التحفيز يمكن ان يؤديها دون ادراج brefeldin A/مونينسين ، مما يسمح بإطلاق السايسيسين في supernatant. ومع ذلك ، من الجدير بالذكر ان هذا سيسمح بالإفراج عن الخلية الكلية ولن يكون من الممكن تحديد اي من الخلايا المساهمة.
Ifnγ الإنتاج هو السمة المهيمنة لاستجابه الخلية T انتيتورال ، وغالبا ما تستخدم كبديل للاعتراف الاعتراف مستضد37،38. الأخرى في الكائنات المجرية التي تحدد بدقه أكثر الاستجابات الخاصة antigen استخدام الخلايا السرطانية التعبير عن مستضد معروفه ، مثل اوفالبومين أو SV40. يمكن بعد ذلك استخدام مستضد العالمية السابقة المجرية لاختبار التعرف علي الخلايا T أو في تركيبه مع الماوس المضيف المقيدة TCR. بدلا من ذلك ، حيث مستضد غير معروف ، يمكن اجراء القياس الكمي من التوسع الخلوية T بواسطة التسلسل tcr السائبة ، أو أكثر مؤخرا أحاديه الخلية التسلسل tcr39،40. لفهم تماما حاله استجابه الخلية T داخل الفم, علامات تدل علي الإرهاق أو مستقبلات المثبطة وينبغي أيضا ان تقاس بما في ذلك: CTLA-4, PD-1, تاخر-3, TIM3, 2B4. فضلا عن علامات الخلايا T المستجيب (CD44hi, CD62lo) والنشاط التكاثري, Ki67 + أو csfe التخفيف41,42,43,44. وعموما ، فان نموذج الهجاء يوفر منصة مفيده لاختبار الاستراتيجيات العلاجية بسرعة ، ولا سيما التي قد تعدل استجابه الخلايا التائية المضادة للفم ، والتي يمكن التحقق منها بعد ذلك علي مجموعه أصغر من المعدلة وراثيا ، الفيلق ، الفئران.

هذه الطريقة التفاصيل ، من البداية إلى النهاية ، والعملية الجراحية لتوليد أورام البنكرياس العظام باستخدام كميه الحد الأدنى من المواد الخلوية والتفكك السريع اللاحقة من الأورام الراسخة لتحليل التدفق الخلوي شامله لسكان الخلايا المناعية ، بما في ذلك تحليل ex الجسم الخليوي وظيفة
سرطان الغدة السرطانية في البنكرياس (PDAC) هو سرطاني العدوانية مع 8 ٪ فقط من المرضي الذين يعيشون 5 سنوات1. بما ان اقل من 20 ٪ من المرضي مؤهلون لاستئصال الجراحية2، عينات المريض الطازجة ليست متاحه بسهوله للبحوث ، التالي في نماذج الجسم الحيوي توفير الاداات الاساسيه للتحقيق في هذا المرض. هناك نماذج متعددة murine من PDAC: العظام ، تحت الجلد ، المحورة وراثيا ، الحقن الوريدي والمرضي المشتقة (PDAC) ، وصفت علي نطاق واسع هنا3. يسمح نموذج الهجاء الموصوف هنا بحقن خلايا PDAC المتزامنة في بنكرياس الفئران المناعية. وهذا يمكن ان يؤديها في أفواج كبيره من الفئران من النوع البري أو متحولة ، التالي يوفر نموذج فعاله من حيث التكلفة ومتسقة للمقارنة بين العوامل العلاجية. والاهم من ذلك ، فان نموذج الهجاء يوفر البيئة المجهرية لنمو الخلايا السرطانية وينتشر في ايدينا والآخرين4 إلى المواقع ذات الصلة سريريا (علي سبيل المثال ، الكبد) ، مما يجعلها أكثر ملاءمة سريريا من النماذج تحت الجلد أو المستحثة كيميائيا. تعرض الأورام التقويمية الملامح الرئيسية ل PDAC ، مثل تفاعل قوي من البلاستيك مع وفره من الخلايا الليفية وترسب مصفوفة خارج الخلية5. النماذج المحورة وراثيا من PDAC هي المعيار الذهبي للنموذج murine والأكثر شيوعا هو نموذج الفيلق ، الذي يعبر عن متحولة KrasG12D/+ و Trp53R172H/+ تحت البنكرياس الخاص pdac-1-cre المروج6. وتستعرض المؤسسة الاضافيه لفيلق حماية كوسوفو وغيرها من نماذج pdac هنا7. الفئران الفيلق تطوير تلقائيا أورام البنكرياس مع تطور المرض الذي يحاكي بإخلاص ملامح الإنسان PDAC6. ومع ذلك ، النسبة لجميع النماذج المحورة وراثيا ، وبرنامج تربيه مكلفه ، وتطور الورم هو متغير ، التالي غالبا ما يتطلب أفواج كبيره من الفئران. تستخدم نماذج PDX الخلايا السرطانية المشتقة من المريض أو القطع التي يتم زراعتها بعد ذلك اما بالتنظير أو في كثير من الأحيان جلد في الفئران المناعية. نماذج الطعم الغريب توفر أدوات مفيده لفحص المركبات العلاجية وحساب تغاير المريض. ومع ذلك ، فانها لا توفر بيئة مناعية كامله ، التالي الحد من تطبيقاتها8،9.
مره واحده المنشاة ، والأورام التقويمية عاده ما يستغرق حوالي 1 شهر أو أكثر لتنمو (اعتمادا علي خط الخلية المستخدمة) وتشكل الأورام الكبيرة التي يمكن ان تكون بسهوله التصوير بالموجات فوق الصوتية أو التصوير بالرنين المغناطيسي لتتبع التقدم وتحديد فعاليه العلاج4،5،10. ومع ذلك ، مره واحده في النمو المتسارع ، والمرحلة الاخيره من نمو الورم يمكن ان تكون سريعة ، لذلك بدات معظم نظم العلاج في وقت مبكر نسبيا (علي سبيل المثال ، 14 يوما)11،12. يلعب الجهاز المناعي دورا حاسما في تطوير الورم ، بما في ذلك في PDAC ، والذي يتميز بورم المناعة التسلل مع ندره نسبيه من الخلايا T وكثرة وجود خلايا النخاع13. وجود عال من [ت] خلايا في [بداك] يمنح تكهن جيده14,15. ومع ذلك ، كعوامل واحده ، ومثبطات نقاط التفتيش المناعية التي تخفف من كبت المناعة الخلية T ، مثل مكافحه CTLA-416 ومكافحه PD-L117، لم تظهر الفائدة السريرية في المرضي pdac ، علي الأرجح لان الخلية الكلية t التفاعلية منخفضه جدا. ومع ذلك ، فان العوامل التي الاستجابات الخلية الرئيسية T ، مثل المضادة لCD40 ، يمكن التغلب علي مكافحه PD-L1/ctla-4 المقاومة18،19 والتطعيم مع جنرال موتورز-السائل النخاعي-سيكريتينغ اللقاح pdac (gvax) يمكن ان تزيد من والاستمناع الأورام pdac20، مشيرا إلى ان
الحرجة لاستجابه الخلايا T انتيتورال هو التعرف علي المستضدات المشتقة من الورم عبر مستقبلات الخلايا التائية (TCR) والإنتاج اللاحق من السايتوكينات السامة للخلايا والحبيبات. في حين يمكن تحديد التعرف علي مستضد الخلية T بواسطة تسلسل TCR ، فان هذا النهج مكلف ويستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك ، القياس الكمي للورم التسلل الخلايا الفرعية T يوفر مؤشرا جيدا لاستجابه مضاده للتوشف. المزيد من الفحص لنشاط الخلية T ex الجسم الفيفو من حيث التحبيب ، وإنتاج السايتوكين وغيرها من العوامل السامة للخلايا يوفر تحليل وظيفي أعمق. ويمكن اجراء هذه الاختبارات علي عينات الأورام الطازجة والعديد من المعلمات من وظيفة الخلية T يمكن قياسها بسرعة عن طريق تدفق الخلوي.
CD8 + و الخلايا التائية + T تنتج السايتوكينات مثل Ifnγ و TNFα لتحفيز استجابه مناعية21. IFNɣ يحفز MHCI الحاملة علي الخلايا المستهدفة ، ويدفع التمايز وتجنيد الخلايا المناعية والإيدز موت الخلايا. Ifnγ الإنتاج بواسطة خلاياCD8 + T يتميز جيدا ليكون جزءا من استجابه انتيتورال ويرتبط مع الانحدار الورم22,23. TNFα هو السايسيسين التهابيه الأخرى التي تنتجها كل منCD8 + و الخلاياالتائية . فانه يعزز التنشيط المعتمدة علي TCR وتكاثر الخلايا T ، ومساعده الاستجابة المضادة للتوشف. عند مشاركه TCR ، يمكن للخلاياCD8 + T السامة للخلايا الخضوع لتحبيب ، حيث يتم تحرير الخلايا الشحمية التي تحتوي علي جزيئات سامه للخلايا في المشبك المناعي للتسبب في تدهور الخلايا المستهدفة21. وتشمل هذه الجزيئات تثقيب ، وهو البروتين الذي يربط إلى غشاء الخلية المستهدفة ، وتشكيل المسام التي ثم تعطيل سلامه الغشاء والسماح انتشار21 أو ندره المحببات24 من الجزيئات السامة للخلايا الأخرى ، مثل granzyme ب ، مباشره في سيتوتوبلاسما الخلية المستهدفة. غرانزيم B هو الانزيم البروتيني الذي يسن تحلل البروتينات المتعددة داخل الخلية المستهدفة ، مما يؤدي إلى وفاه الخلية21. ويتطلب الإفراج عن هذه الجزيئات كثرة التنظير الباطني علي سطح الخلية ، حيث يتم دمج علامة التنظير الباطني CD107a (المعروف أيضا باسم مصباح-1) بشكل عابر في غشاء الخلية25.
ويتطلب قياس إفراز السايسيسين بواسطة الخلايا التائية عزلها بواسطة فرز الخلايا بمساعده التدفق أو اختبارات الفصل القائمة علي الخرزة ، والتي لا يمكن تنفيذها بسهوله علي عدد كبير من العينات في وقت واحد. ومع ذلك ، فان قياس السايتوكينات داخل الخلايا لا يتطلب اي خطوات سابقه للعزل ، ويمكن تنفيذها بسهوله علي عينات متعددة في وقت واحد ، مما يسمح باتباع نهج الانتاجيه الأعلى. كما يفرز بسرعة السايتوكينات الخلايا T ، يمكن ان تكون المستويات داخل الخلايا غير قابل للكشف ، التالي فان خليه T يتطلب التحفيز لزيادة إنتاج السايتوكين القاعدية. لتقييم إنتاج السايسيسين التي يحركها مستضد ، يجب ان يتم تقديم مستضد المعترف بها من قبل TCR إلى الخلية T من قبل APC تستعد في المختبر. وفي الحالات التي لا تعرف فيها الخصوصية الخاصة بالمولد ، يلزم اتباع نهج محفز واسع النطاق. يمكن محاكاة التحفيز TCR باستخدام الخرز المضادة لCD3/28 التي توفر كلا من التنشيط TCR والتزاوج ، الذي يحفز إنتاج السايسيسين وانتشار. ومع ذلك ، فان البديل الأكثر فعاليه من حيث التكلفة هو استخدام النقد الذاتي و ionomycin ، الذي ينشط معا علي نطاق واسع مسارات الإشارات التي تؤدي إلى توليف وإطلاق السايتوكينات داخل الخلايا. علي وجه التحديد ، والنقد الخاص ينشط البروتين كيناز C (PKC) و ionomycin يثير الخلايا Ca2 + الأيونات ، مما يؤدي إلى زيادة الخلايا الإشارات. من أجل الحفاظ علي المحتوي داخل الخلايا من السايتوكينات ، يمكن ان يقترن هذا التحفيز بشكل فعال مع مثبطات البروتين والنقل brefeldin A و مونينسين ، والتي تمنع البروتينات في Golgi التالي منع الإفراج خارج الخلية. استخدام نقدا/ionomycin هو وسيله راسخة لتحفيز الخلايا T وهناك علاقة قويه بين الخلوية الصادرة وخلايا السايتوكينات26. التحفيز من الخلايا T مع نقدا و ionomycin أيضا يزيد من الاتجار يحلول إلى غشاء الخلية ، التالي CD107a يصبح بشكل عابر متكاملة علي سطح الخلية قبل أعاده تدويرها في الخلية. بما في ذلك الأجسام المضادة لCD107a اثناء التحفيز ، فمن الممكن استخدامه كعلامة من النشاط التحبيب25.
هذه الطريقة بسرعة بهضم الأورام لتوفير تعليق خليه واحده. عند هذه النقطة ، يمكن ان يكون السكان الفردية ملطخه مباشره لقياس التدفق الخلوي أو تنقيه بواسطة أساليب المصب: تدفق الخلايا بمساعده الفرز أو الفصل المغناطيسي حبه. اعداد تعليق خليه واحده لتحليل التدفق الخلوي يسمح تحليل عاليه الانتاجيه من العديد من الخلايا المناعية وعلامتاتها الظاهرية ، وتوفير كميات دقيقه من رقم الخلية المناعية والنمط الظاهري.
وأخيرا ، فان بروتوكول الهضم الموصوف هنا يمنع فقدان علامات سطح الخلية ويحافظ علي سلامه الخلايا المناعية ، مما يسمح للخلايا المناعية بالخضوع لمزيد من خطوات تنقيه الخلايا والثقافة حسب الحاجة. ومع ذلك ، لم يتم اختبار هذه الطريقة لاشتقاق الخلايا الظهاريه من هذا الهضم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W9500T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m pore-size cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm Clay Adams clips</td>
			<td>VetTech Solutions</td>
			<td>IN015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD107a PE (clone 1D4B)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121612</td>
			<td>1:100 to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>Use at final dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>46-0032</td>
			<td>Use at final dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4 FITC (clone GK1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041</td>
			<td>Use at final dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103140</td>
			<td>Use at final dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100738</td>
			<td>Use at final dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Use at final dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506314</td>
			<td>Use at final dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354248</td>
			<td>Aliquot on ice and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4970-03</td>
			<td>1x Final concentration PMA 0.081 &#956;M, ionomycin 1.34 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay Adams Autoclip Applier</td>
			<td>VetTech Solutions</td>
			<td>IN015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay Adams Autoclip remover</td>
			<td>VetTech Solutions</td>
			<td>IN015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type V from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td>2 mg/mL in media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye 506 (FVD506)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0866</td>
			<td>Use at 1:200 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf-serum (FCS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>A15-104</td>
			<td>10% in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 700 series, 25 &#956;L volume, 22s gauge needle bevel tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10100332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td>Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>PAA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 units/mL Penicillin, 100 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4980-03</td>
			<td>1x Final concentration Brefeldin A 10.6 &#956;M, monensin 2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution 10x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>594-18C</td>
			<td>Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottomed 96 microwell plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Cotton Tipped Applicators - 6 inch x 100</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>UN982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottomed 96 microwell plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>735-0184</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of orthotopic pancreatic tumors and ex vivo characterization of tumor-infiltrating t cell cytotoxicity

في نماذج الجسم الحيوي لسرطان البنكرياس توفير أدوات لا تقدر بثمن لدراسة ديناميات المرض, تسلل المناعي والاستراتيجيات العلاجية الجديدة. ويمكن اجراء نموذج المريدين العظام علي الأفواج الكبيرة من الفئران المناعية في وقت واحد ، غير مكلفه نسبيا ويحافظ علي البيئة المجهرية الانسجه المتشابهة. ويوفر القياس الكمي لتسلل الخلايا التائية والنشاط السام للخلايا داخل الأورام التقويمية مؤشرا مفيدا للاستجابة المضادة للفم.
يصف هذا البروتوكول منهجيه التوليد الجراحي لأورام البنكرياس التقويمية عن طريق حقن عدد قليل من الخلايا السرطانية المتزامنة التي أعيد تعليقها في غشاء الطابق السفلي 5 μL في البنكرياس مباشره. تاخذ الفئران التي تحمل الأورام التقويمية حوالي 30 يوما للوصول إلى نقطه النهاية ، وعندها يمكن حصاد الأورام ومعالجتها لتوصيف نشاط خلايا T التي تتسلل إلى الورم. الهضم الانزيمي السريع باستخدام كولاجيناز و DNase يسمح للتعليق خليه واحده ليتم استخراجها من الأورام. يتم الحفاظ علي مقومات البقاء وسطح الخلية من الخلايا المناعية المستخرجة من الورم. ولذلك ، فانه من المناسب للتطبيقات المتلقية للمعلومات متعددة ، بما في ذلك الفرز خليه بمساعده التدفق من الخلايا المناعية للثقافة أو استخراج RNA ، تحليل تدفق الخلوي لسكان الخلايا المناعية. هنا ، ونحن وصف التحفيز الجسم السابق من السكان الخلية T للقياس الكمي خلوية داخل الخلايا (Ifnγ و TNFα) والنشاط التحبيب (CD107a) كمقياس للخلايا الكلية. وقد تم تحفيز الأورام الكاملة بالورم مع خلات ميريستات الفطرية و ionomycin لمده 5 ساعات ، في وجود الأجسام المضادة لCD107a من أجل إنتاج اوبريجوليت السايسيسين والتحبيب. تم اجراء أضافه brefeldin A و مونينسين لنهائي 4 ح لمنع النقل خارج الخلية وتعظيم الكشف السايسيسين. ثم تم اجراء تلطيخ خارج وداخل الخلوية من الخلايا لتحليل التدفق الخلوي ، حيث تم تحديد نسبهifnγ +، tnfα + وCD107a + + وCD8 + T الخلايا. 
توفر هذه الطريقة قاعده انطلاق لاجراء تحليل شامل لبيئة الورم المجهرية.

بعد حقن 1000 الخلايا TB32048 في البنكرياس ، والأورام التقويمية تاخذ ما يقرب من 30 يوما لتطوير (الشكل 1ا ، ب). يمكن ان يسبب تسرب غشاء القبو اثناء الجراحة أوراما كبيره لتشكل مباشره علي الجدار الصفاقي ، والتي تظهر بشكل بارز من خلال الجلد (الشكل 1ج). سنزيل هذه الفئران من الدراسة ومع ذلك ، مع المهارات الجراحية الجيدة يتم تقليل حدوث التسرب. يمكن ان تنمو الأورام التقويمية التي تحصد عند نقطه النهاية إلى حجم كبير في C57BL/6 الفئران من النوع البري (الشكل 1د). أورام العظام المقطوعة تتطلب الهضم في كولاجيناز/DNase لمده 20 دقيقه من أجل تحقيق تعليق خليه واحده (الشكل 2). عند هذه النقطة ، يمكن ان تكون مطليه الخلايا المشتقة من الورم في لوحه U-القاع في 2 × 106 خلايا/حسنا. يمكن تغيير عدد الخلايا مطلي اعتمادا علي انتشار الخلايا T داخل العينة; يمكن خفض رقم الخلية إذا كانت الخلايا T في كثافة عاليه. السيطرة علي الطحال أو عينات العقدة الليمفاوية يمكن أيضا ان تكون مطليه في هذه المرحلة للتحفيز. يتم تحفيز كل بئر مع النقد الشخصي و ionomycin لمده 5 ساعات وبعد 1 ح الحضانة ، يتم أضافه brefeldin A و مونينسين من أجل منع الإفراج خارج الخلية من السايتوكينات (الشكل 2). بعد الحضانة ، يتم تلطيخ العينات للمرفه خارج الخلية والخلويات داخل الخلايا للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2).
تم تحليل عينات من الطحال والأورام من الفئران تحمل الأورام التقويمية عن طريق تدفق الخلوي. استراتيجية النابض المستخدمة في تحليل تدفق الخلوي للأورام الطحال والأورام التقويمية يستبعد الحطام باستخدام FSC-A ، SSC-a ، المشككين من قبل FSC-A/FSC-H و SSC-A/SSC-W ، ثم الخلايا الميتة أو ابوتوتيك ايجابيه لصبغ البقاء قابل للتثبيت (الشكل 3ا). ثم يتم بوابات الخلايا المناعية علي النحوCD45 +، والخلايا T بوابات اضافيه علي النحوCD3 + التي تم تعريفها منالمجموعاتالفرعية و CD8 + (الشكل 3ا). ويجري تنفيذ الفلورية ناقص واحد (FMO) لتحديد الفلورية الخلفية للنابضة و brefeldin A/مونينسين فقط يتم تنفيذ السيطرة لتحديد الإنتاج القاعدي من السايتوكينات (الشكل 3ب-د).
بالنسبة لifnγ ، ادي الاحتضان مع brefeldin A/مونينسين في اي زيادة في IFNγ فوق التحكم FMO في عينات الطحال والورم علي حد سواء. ومع ذلك ، فان أضافه النقد الذاتي و ionomycin زيادة ٪ من ifnɣ داخل الخلايا القابلة للكشف في كل من الطحال والأورام المشتقة من الخلايا التائية وCD8 + T.
الطحال و CD8 + T الخلايا ، وتستخدم كعنصر تحكم إيجابي ، لديها إنتاج ifnγ اعلي نسبيا من الأورام المتسللة الخلية T الفرعية ، مع متوسط 6.60 ± 1.5 ٪ و 12.97 ± 3.4 ٪ بالمقارنة مع 4.81 ± 1.0 ٪ و 4.13 ± 1.3 ٪ ، مما يدل علي كبت المناعة يحدث داخل الورم (الشكل 3B و 4a). باستخدام نفس الاستراتيجية ل TNFα ، ونحن تصور ان نسبه عاليه من الخلاياالطحال + t هي ايجابيه لل tnfα داخل الخلايا (65.93 ± 2.3 ٪) ، بالمقارنة مع الخلايا السرطانية التسلل الورم (22.45 ± 5.4 ٪). الطحال والورم التسلل الخلاياCD8 + T تنتج مستويات مماثله من tnfα (25.15 ± 3.7 ٪ و 19.91 ± 5.1 ٪ ، علي التوالي) (الشكل 3ج، الشكل 4ب).
وأخيرا ، CD107a هو علامة التنظير الداخلي التي يتم التعبير عنها عابرا علي سطح الخلية اثناء كثرة المحببات من الحبيبات السامة للخلايا و السايتوكينات ، علي هذا النحو ، يتم استخدامه كعلامة بديله للخلايا الخلوية. الفائدة من تلطيخ ل CD107a اثناء التنشيط ان كل [ترنسنتلي] [سل-سورفس] عبر عن CD107a سوفت كنت أمسكت بالفلوري-جسم مضاد. وتظهر المستويات القاعدية من CD107a في brefeldin A/مونينسين الخلايا المعالجة فقط. لخلاياCD8 + T الطحال ، والتحفيز مع قوه النقد الخاصة/ionomycin يزيد من مستوي CD107a الكشف ، مع اقوي الحامل فيCD8 + الخلايا التي كانت 23.95 ± 3.5 ٪CD107a +، مقارنه 5.8 ± 1.9 ٪ في الورم التسللCD8 + الخلايا ، مما يدل علي الطحالCD8 + كان معدل أكبر من التحبيب. من ناحية أخرى ، وأعرب عن الطحال والورمالتسلل + المستويات القابلة للمقارنة من CD107a 9.37 ± 1.5 ٪ و 11.50 ± 1.8 ٪ (الشكل 3د و 4c).
عموما هذه النتائج تسليط الضوء علي ان الأورام التقويمية يمكن ان تتولد من حقن عدد منخفض جدا (1,000) من الخلايا السرطانية في البنكرياس. ويمكن هضم هذه الأورام بسرعة لعزل الخلايا T لتحفيز الجسم السابق . الكشف عن السايتوكينات داخل الخلايا هو ممكن ويسلط الضوء علي المستوي القاعدي لكبت المناعة من الخلايا T التسلل ، بالمقارنة مع الخلايا T في الاجهزه اللمفاوية الثانوية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg"> الشكل 1: توليد أورام البنكرياس التقويمية. (ا) الجدول الزمني للتجارب في الجسم المجري . (ب) المظهر المجهري للأورام التقويمية داخل تجويف البطن (يسار) وبعد الاستئصال (يمين) حيث تم قطع الورم الظاهر إلى النصف. (ج) يمكن ان يؤدي الدليل علي تسرب غشاء القبو اثناء الجراحة إلى تطور الأورام التي تظهر من خلال الجلد (الصورة العلوية) والشكل علي الجدار الصفاقي (الصورة السفلية). (د) أوزان أورام البنكرياس التي يتم حصادها من الفئران التي وصلت إلى نقطه النهاية (ن = 22). كل نقطه بيانات يمثل الماوس الفردية ، شريط يظهر الرسم البياني يعني ± SEM. تم تعديل البيانات في هذا الرقم من العمل المنشور سابقا10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg"> الشكل 2: التخطيطي لمعالجه الأورام التقويمية لتحفيز الخلية السابقة الفيفو T. بعد الحصاد ، يتم هضم أورام البنكرياس بسرعة في كولاجيناز (2 مغ/مل) و DNase (0.025 mg/mL) لمده 20 دقيقه عند 37 درجه مئوية. بعد ذلك ، يتم أعاده تعليق الخلايا في 2 × 106/مل في وسائل الاعلام rpmi كامله ومطلي في لوحه القاع. يتم أضافه كوكتيل التحفيز من نقدا و ionomycin ل 5 ح ، وعند هذه النقطة المضادة للماوس CD107a يمكن أيضا ان تضاف إلى الثقافة. بعد 1 h حضانة حاصرات النقل داخل الخلايا ، brefeldin A و مونينسين ، تضاف. بعد [اكس] [ فيفو ] تنشيط الخلايا [ترنسفرد] داخل [ف-فلي] لوحه ل يصبغ مع ال [رسبل] بقاء صبغ (في [ببس]) ل 20 [مين] 4 [ك.]. يتم غسل الخلايا في المخزن المؤقت FACS وحضنت في المضادة لCD16/32 (FcR كتله) لمده 15 دقيقه (في المخزن المؤقت FACS) ومن ثم حضن مع الأجسام المضادة الفلورية مترافق خارج الخلية لمده 30 دقيقه أخرى (في المخزن المؤقت FACS). يتم غسل الخلايا مره أخرى في المخزن المؤقت FACS وأعاده التعليق في المخزن المؤقت للتثبيت داخل الخلايا لمده 20 دقيقه. بعد ذلك ، يتم غسل الخلايا مره واحده في المخزن المؤقت FACS ومره واحده في 1x العازلة تخلل. يتم أعاده تعليق الخلايا لمده 1 ساعة في RT في الأجسام المضادة الفلورية المترافقة داخل الخلايا لمده 1 ساعة (في المخزن المؤقت للتخلل 1x). يتم غسل الخلايا مره واحده في 1x المخزن المؤقت تخلل ومره واحده في المخزن المؤقت FACS قبل أعاده تعليق في المخزن المؤقت FACS للحصول علي تدفق المضخم الخلوي في غضون 24 ح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg"> الشكل 3: تحليل التدفق الخلوي للخلايا السابقة التي تحفز الطحال وخلايا T المشتقة من الورم. (ا) التدفق الخلوي الاستراتيجية المستخدمة في الطحال (السيطرة الايجابيه) وعينات الأورام التقويمية. يتم تمييز الخلايا من الحطام باستخدام FSC-ا/SSC-A ويتم عزل الخلايا المفردة باستخدام FSC-A/FSC-H و SSC-A/SSC-W. يتم استبعاد الخلايا الميتة أو ابوتوتيك باستخدام FVD506 الحيوية القابلة للتثبيت ويتم بوابات الخلايا المناعية بواسطةCD45 +. بعد هذاCD3 + Tخلايا و [كد] و [ CD8 + ] حددت مجموعات فرعيه. وقد تم الحصول علي البيانات علي مجموعه "فورنيسا". (ب) استراتيجية الصب المستخدمة لقياس الخلاياifnγ + + + و CD8 + T. يتم استخدام الفلورسنت ناقص واحد (FMO) السيطرة علي عينات حفزت بالبالكامل (سلطه النقد الخاصة/ionomycin/brefeldin A/مونينسين) لتحديد مضان الخلفية. ويستخدم التحكم في المونينسين فقط (B + M فقط) لتحديد إنتاج السايسيسين القاعدي. ثم يتم استخدام العينة المحفزة بالبالكامل لحساب الخلايا%ifnγ + T. (ج) استراتيجية الصب المستخدمة لقياس خلايا TNFα + CD8 + T. ويستخدم عنصر تحكم FMO علي عينات محفزه بالبالكامل (سلطه النقد الخاصة/ionomycin/brefeldin A/مونينسين) لتحديد الفلورية الخلفية. ويستخدم التحكم في المونينسين فقط (B + M فقط) لتحديد إنتاج السايسيسين القاعدي. ثم يتم استخدام العينة المحفزة بالبالكامل لحساب خلايا % TNFα + T. (د) استراتيجية الصب المستخدمة لتحديدخلايا CD107a + + + و CD8 + T. ويستخدم عنصر تحكم FMO علي عينات محفزه بالبالكامل (سلطه النقد الخاصة/ionomycin/brefeldin A/مونينسين) لتحديد الفلورية الخلفية. يتم استخدام التحكم بالمونينسين فقط (B + M فقط) لتحديد التحبيب القاعدي. ثم يتم استخدام العينة المحفزة بالبالكامل لحساب الخلايا%CD107a + T. تم تحليل جميع البيانات تدفق الخلوي علي FlowJo الإصدار 10.6.1. تم تعديل البيانات في هذا الرقم من العمل المنشور سابقا10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg"> الشكل 4: القياس الكمي لنشاط الخلايا التائية المستمدة من الطحال والورم. نسبه الخلاياالموجبة لCD8 + T الايجابيه ل (ا)ifnγ + (ب) tnfα + و (ج)CD107a + تم تحديدها كميا في الطحال (n = 4) والورم (ن = 7) من الفئران التي تحمل الورم. يمثل كل نقطه بيانات الماوس الفردية وأشرطه الخطا عرض يعني ± SEM. تم اختبار الاهميه الاحصائيه باستخدام اختبار t غير المقترن حيث * = p < 0.05 و * * * = p < 0.001. تم تحليل جميع البيانات باستخدام بريزم 8. تم تعديل البيانات في هذا الرقم من العمل المنشور سابقا10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity at JoVE.com

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity (Video) | JoVE

يصف هذا البروتوكول الجيل الجراحي لأورام البنكرياس التقويمية والهضم السريع لأورام البنكرياس المعزولة الطازجة. بعد الهضم ، يمكن استخدام الخلايا المناعية القابلة للاستمرار لمزيد من التحليل المصب ، بما في ذلك تحفيز الجسم الحيوي السابق للخلايا التائية للكشف عن الخلايا الخلوية عن طريق قياس التدفق.

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

يمكن استخدام هذه الطريقة في إجراء الأساليب الجديدة للعوامل العلاجية أو الاستراتيجيات، والتأثير على استجابة الخلايا التائية السامة للخلايا أثناء سرطان البنكرياس أو زيادة هذه الاستجابة. تسمح هذه التقنية بالأورام أن تكون سريعة الهضم وحفزها في المختبر ، مما يسمح بتحليل معلمات متعددة لاستجابة الخلية T في وقت واحد ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لتطبيقات أخرى. للبدء، استخدم ملقط، ونقل الورم على طبق بتري.تخزين خمسة ملليلتر من هضم المتوسطة في أنبوب 50 ملليلتر على الجليد لمنع نشاط انزيم بدء. تأخذ aliquot صغيرة من هذا الحل، لتغطية الورم على طبق بيتري. استخدام مشرط معقمة والملقط لقطع الورم إلى قطع صغيرة، ما يقرب من ثلاثة ملليمترات في الطول.كشط قطع الورم في الأنبوب ، وعكس الأنبوب بلطف حتى تغمر جميع القطع في وسائل الإعلام الهضم. نقل أنبوب على جهاز اهتزاز لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لهضم. تأكد من أن جميع قطع الورم مغمورة بالمياه، وغير ملتصقة بحافة الأنبوب.مباشرة بعد خطوة الهضم، وضع أنبوب على الجليد لإبطاء نشاط الانزيم. إضافة EDTA لتحقيق تركيز نهائي من 20 ملليمولار، ودوامة لفترة وجيزة العينة لخلط من أجل مزيد من النشاط الإنزيمات بطيئة. فتح أنبوب وشطف أي ورم هضم قبالة غطاء الأنبوب مع متوسطة RPMI الطازجة.ثم إعداد مصفاة 70 ميكرون، وضعه على أنبوب مفتوح 50 ملليلتر على الجليد. قبل الرطب مرشح مع المتوسطة. resuspend الخلايا المهضومة وغسل جانبي الأنبوب باستخدام Stripette 25 ملليلتر أو أكبر.يسمح الافتتاح الأوسع لممر Stripette بتمرير هضمة سميكة بسهولة. نقل كل من خلاصة على مصفاة، وذلك باستخدام Stripette 25 ملليلتر. الهريس صعودا وهبوطا الورم على رأس المرشح باستخدام مغمس حقنة ملليلتر واحد.غسل الخلايا باستمرار من خلال مصفاة مع RPMI. تأكد من أن يغسل مع ما يكفي من القوة لدفع الخلايا من خلال. استمر في الغسل حتى تمر جميع الخلايا عبر المصفاة.جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 300 مرة G، وأربع درجات مئوية. إعادة تعليق الخلية بعناية، واستكمال RPMI، وتمرير مباشرة من خلال مرشح آخر لإزالة أي مصفوفة خارج الخلية، أو كتل الخلايا الكبيرة التي لا يمكن إعادة تعليقها بشكل كاف. إذا لم يكن هناك حاجة إلى التحفيز ، على الفور وصمة عار الخلايا المعزولة لتحليل تدفق قياس الخلايا ، أو resuspend لهم في وسط تجميد 10 ٪ DMSO و FBS ، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.لإجراء التحفيز، عد أولاً الخلايا. تمييع الخلايا في المتوسط الكامل لتحقيق تركيز من 2x0 إلى 6 لكل 100 ميكرولترات. لوحة 100 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر من يو القاع 96 لوحة جيدا.إضافة 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل، التي تحتوي على إعداد 2X من PMA، والأيونوميسين. ضع الصفيحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية، ولكن 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. ثم، في 20 ميكرولتررس من إعداد 10X من Brefeldin A، وMoensin، ووسائل الإعلام كاملة لتحقيق تركيز نهائي من 1.06 ميكرومولار، و 2.0 ميكرومولار، على التوالي.ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة لمدة أربع ساعات أخرى. بعد حقن 1000 TB32048 الخلايا في البنكرياس، الأورام التقويمية يستغرق حوالي 30 يوما لتطوير. بعد الهضم وتحفيز أورام تقويم العظام المحصودة ، تم إجراء مضل ناقص واحد لتحديد الفلورس الخلفية للبوابات.وBrefeldin A Monensin فقط تم تنفيذ السيطرة لتحديد الإنتاج القاعدي من السيتوكينات. لاحتضان إنترفيرون غاما مع Brefeldin A و Monensin، أدى إلى أي زيادة في غاما إنترفيرون على السيطرة FMO، في كل من الطحال وعينات الورم. ومع ذلك، إضافة PMA والأيونوميسين، وزيادة النسبة المئوية من انترفيرون غاما داخل الخلايا يمكن الكشف عنها في كل من splenic والورم المشتقة CD4 إيجابية وCD8 الخلايا T إيجابية.Splenic CD4 إيجابية وCD8 الخلايا التائية الإيجابية, تستخدم كتحكم إيجابي, لديها أعلى نسبيا إنتاج غاما إنترفيرون, من الخلايا الفرعية التي تتسرب الورم. يشير إلى كبت المناعة يحدث داخل الورم. باستخدام نفس الاستراتيجية لـ TNF ألفا، كانت نسبة عالية من الخلايا T CD4 إيجابية splenic إيجابية لـ TNF ألفا داخل الخلايا.مقارنة مع الورم تسلل CD4 الخلايا التائية الإيجابية. Splenic والورم تسلل CD8 الخلايا التائية الإيجابية، أنتجت مستويات مماثلة من ألفا TNF. تأكد من أن الورم مفروم بما فيه الكفاية، وأن جميع القطع مغمورة في وسائل الهضم.عند تهرس الورم، تأكد من أن تكون لطيفة، وغسل الخلايا من خلال دقيق. يمكن دمج بروتوكول هضم الورم مع فرز الخلايا بمساعدة التدفق ، لتنقية المجموعات الفرعية الفردية من الخلايا المناعية لتحليل التعبيرات الإضافية أو الوظيفية أو الجينية. لقد استخدمنا هذه الطريقة لوصف كيفية تشكيل الخلايا B الاستجابة المناعية أثناء سرطان البنكرياس، وتوليد أورام العظام في كل من خروج المغلوب الخلية B والفئران ب الخلية المنضب.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors (Video) | JoVE

الجيل القادم التسلسل للكشف عن المنحى الطفرات في الأورام الصلبة والسائلة

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer (Video) | JoVE

فلوري مثلي نموذج الفأر من سرطان البنكرياس

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy (Video) | JoVE

السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells (Video) | JoVE

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells (Video) | JoVE

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models (Video) | JoVE

العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (Video) | JoVE

الموجات فوق الصوتية غرس العظام البنكرياس الاقنيه اللحمية

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform (Video) | JoVE

تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer (Video) | JoVE

زرع العظام لأورام الثدي كنماذج ما قبل السريرية لسرطان الثدي

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture (Video) | JoVE

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...