Name: generation of orthotopic pancreatic tumors and ex vivo characterization of tumor-infiltrating t cell cytotoxicity
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity at JoVE.com

היינו רוצים להודות לשירות טכנאי בעלי חיים וד ר Alzbeta Talarovicova (בארטס מכון לסרטן, המלכה מרי אוניברסיטת לונדון, לונדון, בריטניה) על עזרתם במהלך ניתוח אורתוטופית. אנחנו רוצים גם להודות לד ר ג'ניפר מורטון (מכון ביטלסון לחקר הסרטן, גלאזגו, בריטניה) על הדרכתו בטכניקה כירורגית, ד ר. כריסטינה Ghirelli (בארטס מכון לסרטן, המלכה מרי אוניברסיטת לונדון, לונדון, בריטניה) על העצה שלה על עיכול הגידול וד ר. פביאן מקלאנאהאן (בארטס מכון הסרטן, המלכה מרי אוניברסיטת לונדון, לונדון, בריטניה) לעצתה אנחנו גם רוצים להודות למועצת המחקר הרפואי (MRC), סרטן הלבלב מחקר קרן (PCFR) ו סרטן השחלות פעולה אשר מימנה את המחקר הזה.

. למחברים אין מה לגלות

במודלים vivo של סרטן הלבלב לספק כלים יסולא בפז כדי להבין התקדמות המחלה להעריך מטרות therapeutics חדש3. המודל האורטו-מודל בפרט הוא מודל חסכוני ומאפשר לשימוש הניתן להחלה בקבוצות גדולות של עכברים בו4,27. המודל האורתוקפית מספק גם את מיקרו הסביבה קנצוני ואת המערכת החיסונית שלם לצמיחת הגידול, מה שהופך אותו מתאים יותר מאשר תת עורית ו pdx-מודלים. עם זאת, מצאנו כי כמה אלמנטים של חדירה חיסונית יכול להיות שונה בין מודל אורתובנושא ועכברים KPC, הדגם murine הזהב בתקן10. אחת הסיבות לכך יכול להיות גידול גידול מואץ לראות במודל הנושא. הבדלים נוספים בצפיפות קבוצות המשנה של התא החיסונית תוארו בין הנושא אורתולבין דגמי תת עורית3,28. לכן, למרות מודל KPC הטרנסגניים יקר יותר משתנה6, ממצאים המפתח צריך להיות מאומת בקבוצה קטנה של עכברים kpc במידת האפשר.
הכנת תאים סרטניים עבור ניתוח אורתוטופית הוא צעד קריטי בפרוטוקול. תאים תמיד צריך להיות בשלב היומן של צמיחה mycoplasma-וללא זיהום. ניתוח אורתוטופית צריך להידחות אם יש חששות לגבי צמיחת תאים סרטניים. השימוש קרום המרתף משפר את שיעור הגידול בשיעור על הזרקת תאים ללא זה29 ומפחית את דליפת התא ובכך התפשטות הצפק27. עם זאת, ברגע השעיה קרום המרתף, תאים סרטניים צריך להיות מוזרק במהירות (בתוך 2 שעות) כדי למנוע אובדן התאים. מספר התאים הסרטניים הדרושים כדי ליצור גידולים הוא עשוי להיות מתאים בתור תא, ומגוון של מספרי תאים יש לבדוק (למשל, מ 100 – 100,000) אשר עשוי גם לקבוע את הזמן כדי להגיע נקודת הקצה. סביר להניח שיהיה שוליים של שגיאה בעת הכנת 1,000 תאים לכל עכבר להזרקה; לכן, אם נדרשים ימים מרובים של ניתוח, הטיפול בקבוצות צריך להתפשט באופן שווה על פני ימים כדי לשלוט באפקטי אצווה. רוב הצעדים הכירורגית ניתן לשנות בהתאם להעדפות; עם זאת, הטיפול חייב להילקח לא להפריע קרום המרתף בעת החלפת הלבלב בחלל הבטן או לסגור את הקיר הצפק. במרתף ממברנה דליפה יכול לגרום לצמיחה תא הגידול על הקיר הצפק, אשר בצורה מהירה והוא יכול לגרום להקריב את החיה מוקדם יותר.
באופן אידיאלי, גידולים בלבלב צריך להיות מתעכל במהירות לאחר הקציר ומוכן vivo לשעבר גירוי מיידי. עם זאת, זה לא יכול להיות אפשרי אם יש אצווה גדולה של גידולים לקצור, במקרה זה גידולים יש לשמור על קרח מתעכל בקבוצות. סוג, ריכוז ואורך של חשיפה לאנזימי העיכול כל הוכחו להשפיע על מספר רב של מולקולות פני השטחעל התאיםהחיסוניים 30,31,32. זמן העיכול הוא גם קצר במכוון כדי להגביל את מוות התאים33. תאים מתעכל ניתן לקפוא למטה בהקפאה בינונית לאחסון לטווח ארוך; עם זאת, אובדן תאים מסוימים יתרחשו בעת הפשרה. תהליך העיכול יכול להיות פחות מיטבי אם חתיכות הגידול אינן מספיק לקוביות לפני הדגירה הקוביואז וזה יהיה ברור כמו חתיכות הגידול קשה יישאר במסנן לאחר העיכול. את הריכוז הקולגן יכול להיות הוריד אם העבודה עם הלבלב בריא או גידולים בשלב מוקדם; דוחות על חילוץ תאים בריאים ductal הלבלב להשתמש ריכוזים נמוכים משמעותית34. מידה גבוהה של מוות של תאים אפיתל היא להיות צפוי במהלך העיכול; עם זאת, תאים חיסוניים צריך לסבול את התהליך היטב. שיטות חלופיות קיימות כדי לבודד תאים אפיתל קיימא עבור צמיחה אורגאיד35 או כדי לשמר את ארכיטקטורת הרקמה36.
שינויים בפרוטוקול גירוי ניתן לעשות בקלות, בהתאם לקריאה הרצויה התא החיסונית ניתח (למשל, מקרופאגים או B תאים). השימוש של הפאן הגירוי ריאגנטים PMA/איקונמיצין לא להפלות TCR-אנטיגן ספציפיות, מה שהופך אותו שימושי כאשר האנטיגן אינו ידוע. עם זאת, הייצור של IFNɣ קשורה היטב עם התחייבות TCR37 , הן IFNɣ ו-TNFα הייצור הם קריטיים בתגובות pdac antitumoral וסרי38. הגירוי PMA/איקונמיצין משקף את הקיבולת המקסימלית של תאי T כדי לייצר ציטוקינים, אשר עשוי או לא יכול להיות מיוצר על ידי תאי T בתוך מיקרוסביבה הגידול. ניתן למדוד ייצור אנדוגני ללא צורך בגירוי; עם זאת, רמות עלולות להיות נמוכות או בלתי מורגשת. ישנן שיטות חלופיות כדי לעורר תאים T: anti-CD3/28-מצופה חרוזים, אשר גם לא דורשים אנטיגן או אכן אוכלוסיות אחרות של תאים חיסוניים. היתרון של שיטה זו הוא לאפשר כימות הייצור cy, על ידי מערכות המשנה של תא T ספציפיים ללא צורך בשיטות הפרדה. סימנים אחרים של רעילות ציטובית (granzyme B ו-ניקובים A), פעילות (IL-2) או דיכוי חיסוני (IL-10) ניתן גם להוסיף21. עם זאת, הזרימה באיכות גבוהה cy, לנסות נוגדנים אינם זמינים כדי לזהות את כל ציטוקינים וגורמי עניין. לכן, אם יש יישומים אחרים כגון אליסה נדרש את הגירוי ניתן לבצע ללא הכללת brefeldin A/monensin, ומאפשר ציטוקינים לשחרר את הסופרנטאנט. עם זאת, של הערה, זה יהיה לאפשר את הגרסה הכוללת ציטוקינים שחרור וזה לא יהיה אפשרי כדי לקבוע אילו אוכלוסיות תאים תרמו.
IFNγ הפקה היא תכונה דומיננטית של תגובת תא T antitumoral, משמש לעתים קרובות כתחליף tcr-אנטיגן זיהוי37,38. אחרים בשיטות vivo כי באופן מדויק יותר להגדיר התשובות ספציפיים אנטיגן לנצל את התאים הסרטניים להביע אנטיגן ידוע, כגון Ovalbumin או SV40. אנטיגן אוניברסלי לאחר מכן ניתן להשתמש לשעבר vivo כדי לבדוק זיהוי תא T או בשילוב עם עכבר מארח tcr-מוגבלת. לחילופין, כאשר האנטיגן אינו ידוע, כימות של הרחבת שבטים של תא T ניתן לבצע על ידי רצף בצובר-tcr, או לאחרונה תא יחיד tcr רצף39,40. כדי להבין באופן מלא את המצב של תגובת תא T intrאטומוראלית, סמנים הרומז על תשישות או קולטנים מעכבות צריך גם להיות נמדד כולל: CTLA-4, PD-1, לג -3, TIM3, 2B4. כמו גם סמנים של התאים של אפקטור T (CD44 hi, CD62lo) ופעילות ההתרבות, Ki67+ או csfe דילול41,42,43,44. באופן כללי, המודל האורתוקפית מספק פלטפורמה שימושית כדי לבדוק במהירות אסטרטגיות טיפוליות, בפרט כי יכול לווסת את תגובת T-cell האנטי מוסרית, כי ניתן לאימות על הקבוצה קטן יותר של transgenic, KPC, עכברים.

שיטה זו פרטים, מתחילתו-to-סיום, הליך כירורגי ליצירת הלבלב אורתודפט גידולים באמצעות כמות מינימלית של חומר הסלולר ואת הדיסוציאציה המהירה הבאה של גידולים הוקמה עבור הניתוח cy, לנסות לזרום מקיף של אוכלוסיות תאים החיסונית, כולל ניתוח vivo ex של פונקציית תא T.
לבלב הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) הוא קרצינומה אגרסיבית עם רק 8% מהחולים ששרדו 5 שנים1. ככל פחות מ -20% מהחולים זכאים לניתוח כירורגי2, דגימות מטופלים טריים אינם נגישים בקלות למחקר ובכך במודלים vivo לספק כלים חיוניים כדי לחקור את המחלה. ישנם מודלים murine מרובים של pdac: הנושא, תת עורית, הטרנסגניים, ורידי והחולה מבע (pdac), תיאר בהרחבה כאן3. המודל האורטו-מגנטי המתואר כאן מאפשר הזרקה של תאים בתחביר PDAC לתוך הלבלב של עכברים אימונומוסמכים. ניתן לבצע זאת בקבוצות גדולות של עכברים מסוג פראי או מוטציה, ובכך מספק מודל חסכוני ועקבי להשוואת הסוכנים הטיפוליים. וחשוב מכך, המודל מספק את הסביבה קנצוני מיקרו עבור צמיחת תאים סרטניים, גרורות בידינו ואחרים4 לאתרים רלוונטיים קלינית (למשל, כבד), מה שהופך אותו רלוונטי יותר קלינית מאשר הדגמים תת עורית או כימית המושרה. אורתוטופית גידולים להציג תכונות מפתח של PDAC, כגון תגובה desmoplastic חזקה עם שפע של הפיברוולים ומטריצות מטריקס התצהיר5. המודלים הטרנסגניים של PDAC הם התקן זהב של מודל murine ואת הנפוץ ביותר הוא מודל KPC, אשר מביע מוטציה קראסG12D/+ ו Trp53R172H/+ מתחת ללבלב ספציפי pdac-1- היצור מיזם6. KPC נוספים ואחרים בדגמי vivo pdac נבדקים כאן7. עכברים KPC באופן ספונטני לפתח גידולים בלבלב עם התקדמות המחלה כי בנאמנות משכפל תכונות של האדם PDAC6. עם זאת, באשר לכל הדגמים הטרנסגניים, תוכנית הרבייה הוא יקר, התקדמות הגידול הוא משתנה ולכן דורש לעתים קרובות כורים גדולים של עכברים. PDX מודלים להשתמש בתאי הגידול נגזר החולה או חתיכות אשר גדלו לאחר מכן או אורתולמריחה או לעתים קרובות יותר תת-עורי בעכברים החיסונית. דגמי xenograft מספקים כלים שימושיים לסינון תרכובות טיפוליות ולחשבון עבור טרוגניות המטופל. עם זאת, הם אינם מספקים מיקרוסביבה חיסונית מלאה, ובכך להגביל את היישומים שלהם8,9.
הוקמה לאחר, בגידולים אורתודפית בדרך כלל לקחת בסביבות 1 חודש או יותר כדי לגדול (בהתאם לקו התא בשימוש) וטופס גידולים גדולים שניתן ליצור בקלות על-ידי אולטרסאונד או MRI כדי לעקוב אחר ההתקדמות ולקבוע את יעילות הטיפול4,5,10. עם זאת, פעם בצמיחה אקספוננציאלית, השלב האחרון של גידול הגידול יכול להיות מהיר, כך רוב הטיפול משטרי החלו יחסית מוקדם (למשל, 14 ימים)11,12. המערכת החיסונית משחק תפקיד קריטי בפיתוח הגידול, כולל PDAC, אשר מאופיין בגידול חיסוני מדכאים לחדור עם העיר היחסית של התאים T ונוכחות תכופים של תאים מיאלואידית13. נוכחות גבוהה של תאים T ב pdac לאחד פרוגנוזה טובה יותר14,15. עם זאת, כמו סוכנים בודדים, מעכבי המחסום החיסונית להקל על דיכוי חיסוני התא, כגון anti-ctla-416 ו anti-PD-L117, לא הראו תועלת קלינית בחולים pdac, סביר להניח בגלל הכולל תא T תגובתיות הוא נמוך מאוד. עם זאת, הסוכנים כי התגובות תא T הממשלה, כגון anti-CD40, יכול להתגבר על anti-PD-L1/ctla-4 התנגדות18,19 ו החיסון עם מג-שדרתי הפרשה החיסון pdac (gvax) יכול להגדיל את החיסוני של pdac גידולים20, המציין כי שיפור התגובות התא t טפסים
קריטי תגובה תא T antitumoral היא ההכרה של אנטיגנים הנגזרים מהגידול דרך קולטן T-cell (TCR) והייצור הבאים של ציטוקינים ציטוטוקסיים וגרגרים. בעוד אנטיגן תא T-זיהוי יכול להיקבע על ידי רצפי TCR, גישה זו היא יקרה זמן רב. עם זאת, כימות של קבוצות משנה של תאים החדירה הגידול מספק אינדיקציה טובה של תגובה אנטי-tumoral. בדיקה נוספת של פעילות תא T ex vivo במונחים של degranulation ייצור ציטוקין וגורמים ציטוטוקסיים אחרים מספק ניתוח פונקציונלי עמוק יותר. זה אומר שניתן לבצע על דגימות גידולים טריים ופרמטרים רבים של הפונקציה תא T ניתן למדוד במהירות על ידי הזרמת cy, לנסות.
תאים CD8+ ו CD4+ T לייצר ציטוקינים כגון IFNγ ו-tnfα כדי לספק תגובה חיסונית21. IFNɣ גורם MHCI upregulation על תאים היעד, גורם בידול וגיוס של תאים חיסוניים ואיידס מוות תאים. IFNγ הייצור על ידי CD8+ T תאים מאופיין היטב להיות חלק מתגובה antitumoral ו התואם רגרסיההגידול 22,23. Tnfα הוא עוד ציטוקינים proinflammatory המיוצר על ידי שני CD8+ ו CD4+ T תאים. היא מגבירה את ההפעלה התלויה ב-TCR ואת התפשטות תאי ה-T, ומסייעת לתגובת האנטי-טומוראלית. עם האירוסין TCR, ציטוטוקסיים CD8+ T תאים יכול לעבור degranulation שם מראש בנוי הפרשה ליזוזומים המכילים מולקולות ציטוטוקסיים משתחררים לתוך סינפולוגית החיסונית לגרום השפלה תא היעד21. מולקולות אלה כוללות ניקובים, חלבון הנקשר קרום התא היעד, ויוצרים נקבוביות כי לאחר מכן לשבש את שלמות הממברנה ולאפשר דיפוזיה21 או endocyציטוזה24 של מולקולות מתוזיות אחרות, כגון granzyme B, ישירות לתוך הציטופלסמה של תא היעד. Granzyme B הוא פרוטאז המשמש השפלה של חלבונים מרובים בתוך תא היעד, המוביל למוות תאים21. שחרורו של מולקולות כאלה דורש אקסוציטוזה של אנדוזומים אל פני השטח התא, שם סמן אנדוזוממית CD107a (הידוע גם בשם המנורה -1) הוא שולב באופן מידי לתוך קרום התא25.
המדידה של הפרשת ציטוקין על ידי תאי T מחייבת את הבידוד שלהם על-ידי מיון תאים בסיוע זרימה או הפרדה מבוססת חרוז, אשר לא ניתן לבצע בקלות על מספר רב של דגימות בו זמנית. עם זאת, מדידה של ציטוקינים תאיים אינו דורש שום צעדים טרום בידוד ניתן לבצע בקלות על מספר דגימות בבת אחת, ומאפשר גישה תפוקה גבוהה יותר. כמו ציטוקינים מופרש במהירות על ידי תאי T, רמות תאיים יכול להיות בלתי ניתן לגילוי ולכן תא T דורש גירוי כדי להגדיל את הייצור cy, הבזקין הבסיס. כדי להעריך את הייצור אנטיגן מונחה ציטוקין, אנטיגן המזוהה על ידי TCR חייב להיות מוצג לתא T על ידי APC מוכן בתוך מבחנה. במקרים שבהם האנטיגן אינו ידוע, נדרשת גישת גירוי רחבה. גירוי tcr יכול להיות מחקה באמצעות anti-CD3/28 חרוזים המספקים הן הפעלה tcr והן גירוי משני, אשר משרה ייצור ציטוקינים והתפשטות. עם זאת, חלופה חסכונית יותר היא השימוש PMA ו ionomycin, אשר ביחד להפעיל בהרחבה מסלולים איתות המובילים סינתזה ושחרור של ציטוקינים תאיים. באופן ספציפי, PMA מפעילה חלבון קינאז C (PKC) ואיקונמיצין מעלה Ca תאים2 + יונים, המוביל איתות תא מוגבר. על מנת לשמר את התוכן התאיים של ציטוקינים, גירוי זה יכול להיות משולב ביעילות עם מעכבי התחבורה חלבון brefeldin A ו monensin, אשר לחסום חלבונים ב-Golgi ובכך למנוע שחרור מסחטות. השימוש ב-PMA/ionomycin הוא שיטה מבוססת היטב לעירור תאי T ויש קשר חזק בין ציטוקינים שפורסמו ומשוטי-תאיים26. גירוי של תאים T עם PMA ו ionomycin גם מגביר את הסחר העצמי לקרום התא ולכן CD107a הופך משולב על פני השטח התא לפני ממוחזרים לתא. על ידי כלילת נוגדן anti-CD107a במהלך הגירוי, אפשר להשתמש בו כסמן של פעילות degranulation25.
שיטה זו מעכל במהירות את הגידולים כדי לספק השעיה לתא אחד. בשלב זה, אוכלוסיות בודדות יכולות להיות מוכתמות במישרין לצורך זרימה cy, או מטוהרים על-ידי שיטות במורד הזרם: מיון תאים בסיוע זרימה או הפרדת חרוזים מגנטית. הכנת השעיית תא בודד לניתוח cy, מאפשר ניתוח בתפוקה גבוהה של אוכלוסיות מרובות של תאים חיסוניים וסמנים פנוטיפ שלהם, מתן כימות מדויקת של מספר התא החיסונית והפנוטיפים.
בסופו של דבר, פרוטוקול העיכול המתואר כאן מונע הפסד של פני השטח תא ושומר על הכדאיות של התא החיסונית, המאפשר לתאי החיסון לעבור שלבי טיהור תא נוסף ותרבות כנדרש. עם זאת, שיטה זו לא נבדקה לגבי הנובעות תאים אפיתל מעיכול זה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W9500T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m pore-size cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 mm Clay Adams clips</td>
			<td>VetTech Solutions</td>
			<td>IN015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD107a PE (clone 1D4B)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121612</td>
			<td>1:100 to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>Use at final dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>46-0032</td>
			<td>Use at final dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4 FITC (clone GK1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041</td>
			<td>Use at final dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103140</td>
			<td>Use at final dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100738</td>
			<td>Use at final dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>505826</td>
			<td>Use at final dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>506314</td>
			<td>Use at final dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354248</td>
			<td>Aliquot on ice and store in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4970-03</td>
			<td>1x Final concentration PMA 0.081 &#956;M, ionomycin 1.34 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay Adams Autoclip Applier</td>
			<td>VetTech Solutions</td>
			<td>IN015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay Adams Autoclip remover</td>
			<td>VetTech Solutions</td>
			<td>IN015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type V from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td>2 mg/mL in media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td>Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Dye 506 (FVD506)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0866</td>
			<td>Use at 1:200 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf-serum (FCS)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>A15-104</td>
			<td>10% in RPMI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 700 series, 25 &#956;L volume, 22s gauge needle bevel tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10100332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-8824-00</td>
			<td>Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>PAA</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 units/mL Penicillin, 100 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4980-03</td>
			<td>1x Final concentration Brefeldin A 10.6 &#956;M, monensin 2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.10</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution 10x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>594-18C</td>
			<td>Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-bottomed 96 microwell plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Cotton Tipped Applicators - 6 inch x 100</td>
			<td>Medisave</td>
			<td>UN982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottomed 96 microwell plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>735-0184</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of orthotopic pancreatic tumors and ex vivo characterization of tumor-infiltrating t cell cytotoxicity

במודלים vivo של סרטן הלבלב לספק כלים לא יסולא בפז לחקר הדינמיקה של המחלה, חדירה חיסונית ואסטרטגיות טיפוליות חדשות. מודל מורטין מוראו ניתן לבצע על כריות גדולות של עכברים המוסמכת בו, הוא זול יחסית ומשמר את הסביבה המיקרוגניטה רקמות. הקוונפיקציה של הסתננות תא T פעילות ציטוטוקבית בתוך גידולים אורתוטופית מספק מחוון שימושי של תגובה אנטי מוסרית.
פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה עבור הדור כירורגי של גידולים הלבלב אורתודפית על ידי הזרקה של מספר נמוך של תאי הגידול syngeneic מושעה 5 μL מרתף ממברנה ישירות לתוך הלבלב. עכברים הנושאים גידולים הנושא לקחת כ 30 ימים כדי להגיע לנקודת הקצה, בו גידולים בנקודה ניתן לקצור ומעובד עבור האפיון של פעילות החדירה לתאים T הגידול. העיכול אנזימטי מהירה באמצעות הקולגן ו DNase מאפשר השעיית תא יחיד להיות מופק גידולים. הכדאיות ואת סמנים משטח התא של תאים החיסונית שחולצו מן הגידול נשמרים; לכן, זה מתאים ליישומים מרובים במורד הזרם, כולל מיון תאים בסיוע זרימה של תאים חיסוניים עבור תרבות או הפקת RNA, זרימה cy, לנסות ניתוח של אוכלוסיות תאים החיסונית. כאן, אנו מתארים את הגירוי vivo ex של אוכלוסיות תא T עבור כימות תאיים (IFNγ ו-TNFα) ופעילות Degranulation (CD107a) כמדד של הרעילות הכוללת. מעכל הגידול המלא היו מגורה עם בפורבול מסתורי אצטט ו ionomycin עבור 5 h, בנוכחות של נוגדן anti-CD107a על מנת לupregulate הייצור ציטוקינים ו degranulation. התוספת של brefeldin A ו monensin עבור הגמר 4 h בוצע כדי לחסום את התחבורה החילוץ ולמקסם את גילוי ציטוקינים. מכתים נוסף ופנים-סלולריים של תאים התבצע לאחר מכן עבור ניתוח cy, היכן שיעור IFNγ+, tnfα+ ו CD107a+ CD4+ ו CD8+ T תאים היתה בכמת.
שיטה זו מספקת בסיס התחלתי לבצע ניתוח מקיף של מיקרואקולוגיה של הגידול.

לאחר הזרקת 1000 תאים TB32048 לתוך הלבלב, הגידולים האורתודפית לקחת כ 30 ימים כדי לפתח (איור 1A, B). במרתף ממברנה דליפה במהלך הניתוח יכול לגרום לגידולים גדולים להיווצר ישירות על הקיר הצפק, אשר בולט לעין דרך העור (איור 1ג). היינו מסירים את העכברים. האלה מהמחקר עם זאת, עם כישורי ניתוח טוב השכיחות של דליפה הוא ממוזער. הגידולים אורתודפית שנקטפו בנקודת הקצה יכול לצמוח בגודל משמעותי C57BL/6 עכברים מסוג פראי (איור 1ד). הגידולים שנקטפו אורתודהנושא דורשים עיכול ב-קולגן/DNase עבור 20 דקות כדי להשיג השעיה תא יחיד (איור 2). בשלב זה, תאים הנגזרים מהגידול יכול להיות מצופה בצלחת U-התחתית ב 2 x 106 תאים/גם. מספר מצופה תאים ניתן לשנות בהתאם לשכיחות של תאי T בתוך המדגם; מספר התא ניתן להוריד אם תאי T נמצאים בצפיפות גבוהה. שליטה הטחול או הלימפה דגימות יכול גם להיות מצופה בנקודה זו עבור גירוי. כל באר הוא מגורה עם PMA ו ionomycin עבור 5 h ואחרי 1 h הדגירה, brefeldin A ו monensin מתווספים כדי לחסום שחרור החילוץ של ציטוקינים (איור 2). לאחר הדגירה, הדגימות מוכתמות לקבלת אפיטסקופים וציטוקינים תאיים לניתוח על ידי הזרמת cy,מאיור 2.
דגימות של טחול וגידולים מעכברים נושאת הגידולים האורתודטופית נותחו על-ידי מיכל הזרימה. האסטרטגיה המסייעת בשימוש בניתוח cytometry לטחול וגידולים משום שאינו מניח פסולת באמצעות FSC-a, אס. אס. או, doublets על ידי FSC-A/FSC-H ו-אס. אס. סי-W, לאחר מכן תאים מתים או אפוטוטיים כחיובי לתיקון הכדאיותלתיקון(איור התאים החיסוניים מגודרת אז עלCD45 +, ו T תאים מגודרת עוד יותרCD3 + ממנו CD4+ ו CD8+ קבוצות מערכות מוגדרות (איור 3א). פלואורסצנטית פחות אחד (FMO) מבוצע כדי לקבוע את הרקע של זריחה עבור בקרת ומונפלדין A/monensin השליטה היחידה מבוצעת כדי לקבוע ייצור בסיס של ציטוקינים (איור 3ב-D).
עבור IFNγ, דגירה עם brefeldin א/monensin הביא לא להגדיל ב IFNγ על שליטה FMO בדגימות הטחול והגידול. עם זאת, התוספת של PMA ו ionomycin גדל את% של IFNɣ תאיים לזיהוי הן הטחול ואת הגידול הנגזר CD4+ ו CD8+ T תאים.
הטחול CD4+ ו CD8+ T תאים, משמש כפקד חיובי, יש ייצור IFNγ גבוה יחסית מאשר החדירה לקבוצות המשנה של תאים T, עם ממוצע של 6.60 ± 1.5% ו 12.97 ± 3.4% לעומת 4.81 ± 1.0% ו 4.13 ± 1.3%, המציינת שדיכוי חיסוני מתרחש בתוך הגידול (איור 3B ו- 4a). באמצעות אותה אסטרטגיה עבור TNFα, אנו מדמיינו כי אחוז גבוה של הטחול CD4+ T תאים חיוביים עבור tnfα (65.93 ± 2.3%), לעומת הגידול החדירה CD4+ T תאים (22.45 ± 5.4%). הטחול ואתהCD8 הגידול תאים T לייצר רמות דומות של tnfα (25.15 ± 3.7% ו 19.91 ± 5.1%, בהתאמה) (איור 3ג, איור 4ב).
לבסוף, CD107a הוא סמן אנדוזומבית כי הוא ביטא באופן מבוקר על פני התא במהלך האקסוציטוזה של גרגירים ציטוטוקסיים ו ציטוקינים, ככזה, הוא משמש סמן פונדקאית עבור רעילות ציטובית. היתרון של כתמים עבור CD107a במהלך הגירוי הוא כי כל משטח התא מבוטא הביע CD107a להילכד על ידי נוגדן פלורסנט. רמות הבסיס של CD107a מוצגות בברפלדין א/מוננסין רק תאים. עבור הטחול CD8+ T תאים, גירוי עם pma/ionomycin מגדיל את הרמה של CD107a זיהה, עם הupregulation החזק ביותר CD8+ תאים שהיו 23.95 ± 3.5% CD107a+, לעומת 5.8 ± 1.9% ב הגידול החדירה CD8+ תאים, המציין הטחול CD8+ היה שיעור גדול יותר של degranulation. מצד שני, הטחול ו-החדירה הגידול CD4+ הביע רמות דומות של CD107a 9.37 ± 1.5% ו 11.50 ± 1.8% (איור 3D ו- 4c).
באופן כללי תוצאות אלה להדגיש כי גידולים אורתוטופית ניתן להפיק מן ההזרקה של מספר נמוך מאוד (1,000) של תאים סרטניים לתוך הלבלב. גידולים אלה יכולים להיות מתעכל במהירות עבור בידוד של תאים T עבור גירוי vivo ex . זיהוי ציטוקינים תאיים אפשרי מדגיש את רמת הבסיס של דיכוי חיסוני החדירה תאים T, לעומת תאי T באיברי הלימפה משני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg"> איור 1: הדור של הלבלב אורתודפית גידולים. (א) לוח זמנים בניסויים vivo . (ב) המראה המקסקופי של גידולים אורתוסקופית בתוך חלל הבטן (משמאל) ולאחר כריתה (מימין) שבו הגידול המוצג נחתך לחצי. (ג) הוכחות לדליפת קרום המרתף במהלך הניתוח עלולה לגרום לגידולים להתפתח, הגלויים דרך העור (תצלום עליון) ולטופס על קיר הצפק (צילום תחתון). (ד) אורתוטופית הלבלב משקולות הגידול שנקטפו מעכברים שהגיעו נקודת הקצה (n = 22). כל נקודת נתונים מייצגת עכבר בודד, תרשים עמודות מראה ממוצע ± SEM. הנתונים באיור זה שונו מהעבודה שפורסמה בעבר10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg"> איור 2: סכמטית של עיבוד הגידולים האורתודפית עבור גירוי תא vivo T ex . לאחר הקציר, גידולים בלבלב מתעכל במהירות ב קולגן (2 מ"ג/mL) ו DNase (0.025 mg/mL) עבור 20 דקות ב 37 ° c. לאחר מכן, תאים מושעים מחדש ב-2 x 106/mL במדיה RPMI מלאה ומצופה בלוחית התחתית של U. קוקטייל גירוי של PMA ואיקונמיצין נוסף עבור 5 h, בשלב זה אנטי העכבר CD107a נוגדן ניתן גם להוסיף לתרבות. לאחר 1 h הדגירה חוסמי התחבורה תאיים, brefeldin A ו monensin, מתווספים. לאחר vivo לשעבר גירוי התאים מועברים לתוך צלחת v-התחתית לצביעת עם צבע הכדאיות לתיקון (ב-PBS) עבור 20 דקות 4 ° c. התאים נשטפים במאגר FACS ו-מודבטים ב anti-CD16/32 (בלוק FcR) עבור 15 דקות (ב FACS מאגר) ולאחר מכן מודנות עם פלורסנט מתוך מעלה-מצועם מעלה נוגדנים עבור 30 דקות נוספות (ב-FACS מאגר). תאים נשטפים שוב במאגר FACS ולהשעות מחדש במאגר קיבעון תאיים עבור 20 דקות. לאחר מכן, התאים נשטפים פעם אחת במאגר FACS ופעם אחת במאגר החדירות 1x. תאים מושעים מחדש עבור 1 h ב RT ב-פלורסנט תאיים-מצוח נוגדנים עבור 1 h (במאגר החדירות 1x). התאים נשטפים פעם אחת במאגר החדירות 1x ופעם אחת במאגר FACS לפני השעיית מאגר FACS לרכישה על cytometer הזרימה בתוך 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg"> איור 3: הזרימה cyvivo try ניתוח של לשעבר מגורה הטחול-ואת הגידולים הנגזרים תאים T. (א) הזרימהcy, try האסטרטגיה המשמשת הטחול (שליטה חיובית) ו אורתובנושא דגימות גידולים. התאים מפלים מפסולת באמצעות FSC-A/אס-אס-אס ותאים בודדים מבודדים עוד יותר באמצעות FSC-A/FSC-H ו-אס. אס. סי. תאים מתים או אפוטוטיים אינם נכללים באמצעות הכדאיות לתיקון-FVD506 ותאים חיסוניים מגודרת על ידי CD45+. לאחר הגדרת התאיםCD3 + T וערכות המשנה CD4+ ו-CD8+ . . המידע התקבל בשביל BD (ב) אסטרטגיית היציאה המשמשת לכמת IFNγ+ CD4+ ו CD8+ T תאים. פלורסנט פחות אחד (FMO) משמש על דגימות מגורה (PMA/ionomycin/ברפלדין A/monensin) כדי לקבוע את תאורת הרקע. ברפלדין A/monensin שליטה רק (B + M בלבד) משמש כדי לקבוע את הייצור ציטוקין בסיס. לאחר מכן משמש המדגם המלא לחישוב התאים% IFNγ+ T. (ג) האסטרטגיה לעבור המשמש לכמת TNFα+ CD4+ ו CD8+ T תאים. בקרת FMO משמשת על דגימות מוסטימולציה מלאה (PMA/איקונמיצין/ברפלדין A/monensin) כדי לקבוע את הזריחה ברקע. ברפלדין A/monensin שליטה רק (B + M בלבד) משמש כדי לקבוע את הייצור ציטוקין בסיס. לאחר מכן משמש המדגם המלא לחישוב התאים% TNFα+ T. (ד) אסטרטגיית היציאה המשמשת להגדרת תאים CD107a+ CD4+ ו-CD8+ T. בקרת FMO משמשת על דגימות מוסטימולציה מלאה (PMA/איקונמיצין/ברפלדין A/monensin) כדי לקבוע את הזריחה ברקע. ברפלדין A/monensin שליטה רק (B + M בלבד) משמש כדי לקבוע את הדמגרציות בסיס. לאחר מכן משמש המדגם המלא לחישוב התאים% CD107a+ T. כל הנתונים cy, לנסות להיות מנותח על FlowJo גירסה 10.6.1. הנתונים באיור זה שונו מהעבודה שפורסמה בעבר10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg"> איור 4: קוונפיקציה של vivo ex הטחול-ואת הגידול הנגזר פעילות תא T. החלק של CD4+ ו CD8+ T תאים חיוביים עבור (A) IFNγ+ (ב) tnfα+ ו (ג) CD107a+ היה ככמת בטחול (n = 4) וגידול (n = 7) של עכברים הנושאת הגידול אורתוטופית. כל נקודת נתונים מייצגת עכבר בודד וקווי שגיאה המציגים ממוצע ± SEM. משמעות סטטיסטית נבדקה באמצעות מבחן t שאינו משויך כאשר * = p < 0.05 ו * * * = p < 0.001. כל הנתונים נותחו באמצעות מנסרה 8. הנתונים באיור זה שונו מהעבודה שפורסמה בעבר10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity at JoVE.com

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity (Video) | JoVE

פרוטוקול זה מתאר את הדור כירורגי של גידולים הלבלב אורתודפית ואת העיכול המהיר של גידולים מבודדים מבודד מורטין הלבלב. לאחר העיכול, אוכלוסיות קיימא תאים החיסונית יכול לשמש ניתוח נוסף במורד הזרם, כולל לשעבר גירוי vivo של תאים T לאיתור ציטוקינים תאיים ידי הזרימה cy, try.

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי התחת איך סוכנים טיפוליים חדשניים או אסטרטגיות, להשפיע או להגדיל את התגובה תא T cytotoxic במהלך סרטן הלבלב. טכניקה זו מאפשרת גידולים להיות מתעכל במהירות מגורה במבחנה, המאפשר ניתוח של פרמטרים מרובים של תגובת תא T בו זמנית, אשר ניתן להתאים בקלות עבור יישומים אחרים. כדי להתחיל, להשתמש במדפים, להעביר את הגידול על צלחת פטרי.לאחסן חמישה מיליליטר של מדיום עיכול בצינור 50 מיליליטר על קרח כדי למנוע פעילות אנזימים להתחיל. קח aliquot קטן של פתרון זה, כדי לכסות את הגידול על צלחת פטרי. השתמש אזמל סטרילי ממטרים לחתוך את הגידול לחתיכות קטנות, בערך פחות משלושה מילימטרים אורך.לגרד את חתיכות הגידול לתוך הצינור, בעדינות להפוך את הצינור עד כל החלקים שקועים בתקשורת העיכול. מעבירים את הצינור למכשיר רועד למשך 20 דקות ב-37 מעלות לעיכול. ודא שכל חתיכות הגידול שקועות, ולא דבוקות לקצה הצינור.מיד לאחר שלב העיכול, מניחים את הצינור על הקרח כדי להאט את פעילות האנזים. הוסף EDTA כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מילימולר, בקצרה מערבולת המדגם לערבב על מנת להאט עוד יותר את פעילות האנזים. פתח את הצינור ולשטוף כל עיכול הגידול את המכסה של הצינור עם מדיום RPMI טרי.ואז להכין מסננת 70 מיקרון, למקם אותו על צינור פתוח 50 מיליליטר על קרח. הרטב מראש את המסנן עם בינוני. השתמשו מחדש בתאים המתעכלים ושטפו את דפנות הצינור באמצעות רצועה גדולה יותר באורך 25 מיליליטר.הפתיח הרחב יותר של הרצועה מאפשר לתקציר העבה לעבור בקלות. להעביר את כל העיכול על מסננת, באמצעות Stripette 25 מיליליטר. מועכים מעלה ומטה את הגידול על גבי המסנן באמצעות בוכנה מזרק מיליליטר אחד.לשטוף תאים ברציפות דרך מסננת עם RPMI. הקפד לשטוף עם מספיק כוח כדי לדחוף את התאים דרך. ממשיכים לשטוף עד שכל התאים עוברים דרך מסננת.צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 300 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס. בזהירות resuspend את גלולת התא, ולהשלים RPMI, ולהעביר ישירות דרך מסנן אחר כדי להסיר כל מטריצה חוץ תאית, או גושים תא גדולים שלא ניתן לעכל כראוי. אם אין צורך בגירוי, יש להכתים מיד את התאים המבודדים לניתוח ציטומטריית זרימה, או למצות אותם מחדש במדיום הקפאה של 10%DMSO ו-FBS, ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי לבצע גירוי, לספור תחילה את התאים. לדלל את התאים במדיום מלא כדי להשיג ריכוז של פעמיים עשר עד שש לכל 100 microliters. צלחת 100 microliters של תאים בכל באר של U-bottomed 96 צלחת היטב.הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום מלא, המכיל הכנה 2X של PMA, ו Ionomycin. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, אבל 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר מכן, ב 20 microliters של הכנה 10X של ברפלדין A, ו Monensin, ומדיה מלאה כדי להשיג ריכוז סופי של 1.06 micromolar, ו 2.0 micromolar, בהתאמה.תחזיר את הצלחת לאנקובטור לעוד ארבע שעות. לאחר הזרקת 1000 תאים TB32048 לתוך הלבלב, גידולים אורתוטופיים לקחת בערך 30 ימים לפתח. לאחר עיכול וגירוי של גידולים אורתוטופיים שנקטפו, התבצעה פלואורסצנטיות מינוס אחת כדי לקבוע פלואורסצנטיות ברקע עבור gating.וברפלדין א מונסין רק שליטה בוצעה כדי לקבוע ייצור בסיס של ציטוקיני. עבור דגירה אינטרפרון-גמא עם ברפלדין A ומונסין, הביא שום עלייה גמא אינטרפרון על בקרת FMO, הן טחול ודגימות גידול. עם זאת, התוספת של PMA ו ionomycin, גדל אחוז גמא אינטרפרון תאית לזיהוי הן טחול וגידול נגזר CD4 חיובי CD8 חיובי T תאים.לתאי T חיוביים ו-CD8 חיוביים של CD8, המשמשים כבקרה חיובית, יש ייצור גמא אינטרפרון גבוה יחסית, מאשר תת-קבוצות תאי T שחודרות לגידולים. ציון דיכוי חיסוני מתרחש בתוך הגידול. באמצעות אותה אסטרטגיה עבור אלפא TNF, אחוז גבוה של תאי T חיוביים CD4 הטחול היו חיוביים עבור אלפא TNF תאית.בהשוואה לתאי CD4 חיוביים שחודרים לגידולים. תאים T חיוביים CD8 חדירת ט, הפיק רמות דומות של אלפא TNF. ודא הגידול הוא קצוץ מספיק, כי כל החלקים שקועים בתקשורת העיכול.בעת ריסוך הגידול, הקפד להיות עדין, ולשטוף תאים דרך ביסודיות. ניתן לשלב את פרוטוקול עיכול הגידול עם מיון תאים בסיוע זרימה, כדי לטהר תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון לניתוח נוסף, פונקציונלי או ביטוי גנים. השתמשנו בשיטה זו כדי לאפיין כיצד תאי B מעצבים את התגובה החיסונית במהלך סרטן הלבלב, ויוצרים גידולים אורתוטופיים הן בנוקאאוט של תאי B והן בעכברים מרוקנים מתאי B.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors (Video) | JoVE

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer (Video) | JoVE

דגם פלורסנט Orthotopic עכבר של סרטן הלבלב

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy (Video) | JoVE

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells (Video) | JoVE

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells (Video) | JoVE

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models (Video) | JoVE

בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (Video) | JoVE

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform (Video) | JoVE

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer (Video) | JoVE

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture (Video) | JoVE

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...