Name: reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation
Uploaded: 2020-11-07T13:00:00
Duration: 8 min 39 s
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Esta pesquisa foi financiada através de fundos do programa de transplante multi-órgãos da UHN e apoio do Toronto General e toronto western foundation.

Os autores não têm nada a revelar.

Modelos de transplante de fígado de animais de pequeno porte são importantes para entender a imunidade do transplante e identificar novas estratégias terapêuticas32. O modelo ideal de transplante de fígado animal replica todas as etapas do procedimento humano, incluindo a anastomose arterial. Pode ser desafiador interpretar resultados do modelo OLT de rato, já que a maioria das versões não incorpora um passo de anastomose HA, o que leva a maiores taxas de complicações e morbidade42. Alguns procedimentos de reconstrução têm utilizado a artéria renal, que requer a remoção do rim27. Este protocolo evita a remoção de órgãos, pois está além do que ocorre no procedimento humano.
Reconstruções arteriais também podem ser realizadas manipulando a aorta de rato31. No entanto, esses métodos requerem dissecção extensiva e fixação da aorta. Se o tempo do grampo for prolongado, o rato receptor terá resultados ruins relacionados à isquemia distal43. Em humanos, uma técnica cirúrgica LT envolve a ligadura e divisão da artéria gastroduodenal receptora (GDA). No entanto, as características fisiológicas e anatômicas dos roedores tornam o transplante usando essa técnica mais fisiologicamente desafiador e pode levar a complicações (ou seja, necrose do pâncreas e ductobiliar 35 e vazamento de bilia44). A reconexão arterial neste protocolo visa contornar esse desafio, manter o fluxo sanguíneo do ducto e melhorar o resultado do receptor.
O uso de uma manga e técnica de stent para reconstrução do rato HA foi descrito anteriormente27. Nesta técnica, um stent é usado como guia, e a artéria é reconstruída do tronco celíaco doador para o receptor comum HA. O HA comum do destinatário é então dissecado, e o GDA destinatário é amarrado27. Como resultado, o suprimento de sangue para a parte inferior do BD receptor e cabeça do pâncreas pode ficar comprometido. Acredita-se que a circulação colateral para esta área muitas vezes fornece fluxo sanguíneo inadequado para o ducto biliar. Por exemplo, este protocolo de teste prende o GDA receptor primeiro com um clipe microvascular e divide o BD do receptor. Com o GDA preso, o BD dividido não sangra. Após a remoção do grampo GDA, observa-se sangramento rápido do BD. Este protocolo, que mantém um bom fluxo para o ducto biliar receptor dividido, protege a fisiologia do tecido hepático receptor, fornecendo perfusão sanguínea hepática adequada e prevenindo lesões hepáticas hipoxicas pós-OLT.
Do lado do doador, o stent HA é inserido no tronco celíaco durante a preparação do enxerto com facilidade, criando um remendo do tronco celíaco, artéria gástrica esquerda e artéria esplênica. O stent pode ser inserido através da abertura ampla, o que é menos difícil do que tentar inserir o stent apenas no tronco celíaco. Descobriu-se que 24 G é um tamanho ideal para usar para o stent HA. O comprimento do stent deve ser de 1,0-1,5 mm de comprimento, pois age como um portão aberto para permitir que o HA adequado do receptor seja prontamente puxado para o HA comum do doador. Com atenção cuidadosa para onde a sutura de 10-0 ethilon é colocada, o sangue que flui através desta conexão nunca tocará diretamente no stent, e o HA adequado do receptor irá protegê-lo do interior, reduzindo o risco de complicações. É importante ressaltar que o HA do doador nunca é fixado para evitar o vasospasmo. O sucesso da reconstrução arterial é avaliado deixando o doador GDA aberto. A anastomose bem sucedida resulta em bom fluxo sanguíneo do doador GDA assim que a reconstrução é concluída.
Neste protocolo, semelhante a outros, a reconexão shvc é o passo mais lento e, em última análise, dita a duração da fase anheptica. À medida que a duração do tempo anháptico aumenta, o risco de lesão isquêmica e disfunção hepática aumenta45. Outro componente crítico dos modelos de ratos OLT são os tamanhos do enxerto, stents e algemas. Se o enxerto for muito pequeno, o enxerto pode torcer ou virar, obstruindo as conexões vasculares. O tamanho dos stents e algemas pode exigir ajustes de acordo com a idade, sexo, peso e tensão do rato. O tamanho das algemas utilizadas aqui foi escolhido como descrito anteriormente28, e foi utilizado um tamanho de manguito que controlava o tamanho do rato. Não houve sinais de angústia ou complicações (ou seja, congestionamento hepático, edema, ascites ou esplenomegalia) durante o período de seguimento (até o momento: mediana = 133 dias pós-operação, mínimo = 115 dias pós-operatório, máximo = 161 dias após a operação). Outros estudos para determinar o tamanho adequado de PV e IHVC para várias cepas de ratos que contabilizam idade e sexo são garantidos.
Este protocolo OLT de rato modificado usa algemas impressas em 3D para o PV e IHVC, conforme descrito anteriormente39,40. Os métodos existentes para conectar o PV e o IHVC incluem uma técnica de microsutura32,técnica de manguito46e técnica de tala temporária de microsutura47. A técnica de braçadeira impressa em 3D foi escolhida, pois permite que o tamanho da braçadeira seja padronizado de acordo com a cepa de rato e seja fácil de preparar e usar. Grandes quantidades de algemas com as mesmas dimensões podem ser impressas de uma só vez. A superfície externa da braçadeira tem duas ranhuras para ajudar a proteger os laços e evitar escorregar. Uma cauda também é incorporada ao design da braçadeira para permitir uma manipulação mais fácil da braçadeira. No geral, acredita-se que a incorporação de algemas impressas em 3D leva a altas taxas de sucesso e reprodutibilidade do procedimento OLT, encurtando o tempo anhático. Determina-se que essa técnica também encurta a curva de aprendizagem cirúrgica.
Em conclusão, o protocolo descrito estabeleceu um modelo mais semelhante ao transplante de fígado humano, incorporando uma etapa de reconexão arterial. Este protocolo pode ser adaptado para estudar muitos aspectos imunológicos e cirúrgicos do transplante hepático e pode servir de modelo para testar novas intervenções terapêuticas relevantes para o transplante.

A carga global de doença hepática continua a aumentar, com um aumento de 30% nas mortes relacionadas à doença hepática de 2005 a 20131,2. O transplante de fígado é frequentemente o único recurso para pacientes com doença hepática em estágio terminal. O fígado é o segundo órgão sólido mais transplantado, e o número de transplantes hepáticos realizados globalmente aumentou 7,25% de 2015 para 20161,2. Apesar de sua prevalência, as taxas de sobrevivência pós-transplante ficaram estagnadas3,,4,5. A taxa de sobrevivência do paciente de 15 anos é de 53%, e a taxa de sobrevivência do paciente de 20 anos pode ser tão baixa quanto 21%3,5. Embora existam novas iniciativas de imunobiologia que podem levar a novos tratamentos e melhores resultados clínicos, ainda não há um modelo animal de pequeno porte confiável para testá-los.
O modelo OLT de rato tem sido amplamente utilizado na investigação de transplante de fígado, incluindo rejeição6,7,8,9,10, tolerância imune11, lesão de isquemia-reperfusão transplante12,imunossupressão13, e lesão de árvore biliar14,15,,16,17. No entanto, uma desvantagem do modelo em sua forma atual é sua alta morbidade pós-operatória e mortalidade18,19. Trata-se de uma séria desvantagem que está em desacordo com a operação humana, e compromete a capacidade de tirar conclusões clinicamente relevantes do modelo20.
Além disso, uma grande proporção dessa morbidade pode ser atribuída a uma reconexão hepática ausente ou imperfeita (HA)18. Embora seja um passo crítico no transplante de fígado humano, as dificuldades técnicas tendem a comprometer a reconexão ha no modelo OLT de rato. Como resultado, a anastomose do ducto biliar (DMC) é tênue e resulta em altas taxas de vazamento de biliares e necrose BD21. Além da alta incidência de complicações biliares22, a ausência de entrada arterial altera a fisiologia do fígado do enxerto pós-transplante23, com hipóxia no enxerto hepático doador24 e dano hepático observado em lobos inflamados19,,25,26. Rat OLT sem reconexão arterial também tende a promover a fibrose27. O protocolo OLT de rato descrito abaixo aborda essas questões incorporando uma simples etapa de reconstrução de HA com ummétodoOLT de rato publicado anteriormente, resultando na preservação do parnchyma hepático e melhores taxas de sobrevivência.
O transplante hepático tem três fases: (1) extração do enxerto hepático do doador, (2) preparação do enxerto hepático doador e (3) substituição do fígado receptor pelo enxerto hepático. O procedimento envolve a manipulação de cinco estruturas anatômicas: vena cava suprahepática inferior (SHVC), veia portal (PV), veia vena inferior infrahpática (IHVC), artéria hepática (HA) e ducto biliar (DB).
OLT no rato foi introduzido pela primeira vez por Lee et al. usando anastomose de microsutura do SHVC, PV e IHVC, e uma técnica de pull-through para o BD29. Este modelo foi posteriormente melhorado através do uso da técnica de duas algemas em 197930. Desde então, várias técnicas alternativas foram propostas, com a maioria focando na anastomose venosa e utilizando uma técnica de duas algemas com algumas modificações31. Embora a anastomose HA tenha sido descrita anteriormente no modelo OLT de rato utilizando técnicas como microsutura, manguito e mangas intraluminares26,,31,,32,,33,34, essas técnicas muitas vezes requerem habilidades microcirúrgicas altamente treinadas, alteram significativamente a fisiologia do rato, e são dificultadas por trombose e/ou complicações biliárias27,,35.
Além disso, a escolha do procedimento cirúrgico também pode influenciar o tempo anhático (tempo desde a fixação pv até a reperfusão do enxerto através do PV reconstituído), o que é fundamental para o sucesso do transplante de fígado de rato. Especificamente, altas taxas de sobrevivência são observadas com tempos anhápticos de 15-20 min36, e 30 min é o limite superior para o sucesso37,38. Portanto, o objetivo deste método é implementar um modelo OLT de rato cirúrgico menos invasivo e mais facilmente adotável que seja capaz de reconectar a artéria hepática, promover a perfusão eficiente do fígado transplantado, manter o fluxo para o ducto biliar receptor e preservar a condição fisiológica do receptor.
Detalhado aqui estão todas as etapas deste protocolo revisado, incluindo a manipulação do tronco celíaco do fígado doador, bem como o uso de 1) um stent de 1,5 mm para realizar uma conexão de manga extraluminal com o receptor adequado HA, 2) uma sutura de corrida para a reconstrução do SHVC, 3) duas algemas plásticas impressas em 3D para reconstrução pv e IHVC39,,40, 4) uma reconexão de manga microvascular para o HA18,,27,,41 e 5) uma técnica de stent BD previamente descrita28. Duas etapas adicionais também estão incluídas: uma descarga fria via PV, e um regime antibiótico que se baseia em achados anteriores17. Este protocolo OLT otimizado minimiza complicações perioperatórias e morbidade e modela mais de perto o procedimento cirúrgico utilizado no transplante de fígado humano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-0 Ethilon</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>2830G</td>
			<td>10-0 Ethilon Black 1X5&#34; BV100-4 Taper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>B302995</td>
			<td>Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>B309628</td>
			<td>Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>B301031</td>
			<td>Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printed Cuff for IHVC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printed Cuff for PV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printed Holder for IHVC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printed Holder for PV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>B309657</td>
			<td>Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Sofsilk</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>GS-835</td>
			<td>Wx coded braided silk, 30&#34;, Suture 1-Needle 26 mm Length 1/2 Circle Taper Point Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Monocryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Y433H</td>
			<td>Undyed Monofilament 1X27&#34; TF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>B309646</td>
			<td>Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Silk</td>
			<td>Teleflex Medical</td>
			<td>103-S</td>
			<td>Black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 Prolene</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>2775G</td>
			<td>8-0 Prolene Blue 1X24&#34; BV130-5 EVP Double Armed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Micro Needle Holder Without Catch</td>
			<td>Aesculap Surgical Instruments</td>
			<td>FD231R</td>
			<td>Curved 120 mm, 4 3/4&#8243;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder, Extra Fine Jaws 8.0mm, Curved With Out Lock</td>
			<td>Rumex International Co.</td>
			<td>8-025T</td>
			<td>Small Size, Titanium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder, Fine Jaws 12.0mm, Curved With Out Lock</td>
			<td>Rumex International Co.</td>
			<td>8-021T</td>
			<td>Small Size, Titanium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 IN</td>
			<td>BD Angiocath / Autoguard</td>
			<td>382523</td>
			<td>22 G x 1.00&#34; (0.9 mm x 25 mm) Wingless catheter, 37 mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDPrecisionGlide Single-use Needles: Regular Bevel - Regular Wall.</td>
			<td>BD</td>
			<td>B305106</td>
			<td>PrecisionGlide stainless-steel needles with translucent, color-coded, polypropylene hubs. 22 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Syringe Needle 21G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td>Gauge 21, length 1.5 inch, hypodermic needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Syringe Needle 30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305128</td>
			<td>Gauge 30, length 1 inch, hypodermic needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Solution by Purdue Products LP</td>
			<td>Purdue Products Lp</td>
			<td>67618-150-17</td>
			<td>10% povidone&#8211;iodine topical solution USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine Injection BP 0.5%</td>
			<td>SteriMax Inc.</td>
			<td>DIN:02443694</td>
			<td>0.5% (100mg/20mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Tying Forceps</td>
			<td>Duckworth &#38; Kent</td>
			<td>2-501E</td>
			<td>6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 88mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td>FHC Inc.</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DK Iris Scissors (Curved)</td>
			<td>Duckworth &#38; Kent</td>
			<td>1-211B</td>
			<td>Blunt tips, cut length 4mm, tip to pivot length 11mm, round handle, length 107mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof (100%), USP, Decon Labs</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>2716</td>
			<td>Dilute to 70% with d2H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Adjustable Wire Retractor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17004-05</td>
			<td>Maximum spread: 3.5cm, Depth 5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer</td>
			<td>Harvard Appartus Limited</td>
			<td>34-1040SV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin LEO(heparin sodium)</td>
			<td>LEO Pharma Inc.</td>
			<td>DIN:00453811</td>
			<td>10,000 i.u./10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice-Pak</td>
			<td>Cryopak</td>
			<td>FIP88016</td>
			<td>4.00 in. x 7.00 in., thickness 1.50 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9%</td>
			<td>Piramal Healthcare Limited</td>
			<td>DIN: 02231929</td>
			<td>250 mL, Inhalation Anesthetic, NDC 66794-017-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Khaw Transconjunctival Adjustable Suture Control Forceps</td>
			<td>Duckworth &#38; Kent</td>
			<td>2-502N</td>
			<td>5mm highly polished tying platforms, straight shafts, flat handle, length 84mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Ringer&#39;s Injected USP, 1000mL</td>
			<td>Baxter Co.</td>
			<td>DIN: 00061085</td>
			<td>JB2324</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson Tying Forceps</td>
			<td>Duckworth &#38; Kent</td>
			<td>2-500E</td>
			<td>6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 90mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors - 14.5 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14024-14</td>
			<td>Straight Sharp/Blunt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Kitzmiller Clamp</td>
			<td>Scanlan</td>
			<td>3003-630</td>
			<td>Jaw length 23mm, Length 11cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope-Leica M525 F20</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven Gauze Sponges</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-028-556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar with Suture Cutter</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12002-14</td>
			<td>15 mm cutting edge, 2mm jaw surface - 14cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptixCare Eye Lube, 25gm</td>
			<td>OptixCare</td>
			<td>ES-KE8O-69U1</td>
			<td>Formerly Optixcare Surgical Eye Lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperacillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8396</td>
			<td>Penicillin analog</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan 3&#34; Standard Cotton Swab w/Wooden Handle</td>
			<td>Puritan Medical Products Company LLC</td>
			<td>803-WC</td>
			<td>Regular Cotton Tipped Applicator with Wooden Handle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Handled Needle Holder Straight w/ Lock</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12075-12</td>
			<td>Round handles allow easy fingertip adjustments - 12.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shea Scissors Curved Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14105-12</td>
			<td>Transplant scissors with light and delicate pattern - 12cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Serrefines Curved - 4mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18055-06</td>
			<td>Jaw length 4mm, Jaw width 0.75mm, Total length 16mm, Jaw pressure 125g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Serrefines Curved - 6mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18055-05</td>
			<td>Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 17mm, Jaw pressure 100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Serrefines Straight - 6mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18055-03</td>
			<td>Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 15mm, Jaw pressure 100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom, magnetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SurgiVet Vaporstick Anesthesia Machine</td>
			<td>General Anesthetic Services, Inc</td>
			<td>V7015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Localized Therapy</td>
			<td>Stryker</td>
			<td></td>
			<td>TP700 Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Pressure Pump</td>
			<td>Barnant Co.</td>
			<td>400-1901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors with Microserrations Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15070-08</td>
			<td>Cutting edge: 5mm, Tip diameter: 0.1mm - 8.5cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetergesic Buprenorphine</td>
			<td>Ceva Animal Health Ltd</td>
			<td>NAC No.:12380352</td>
			<td>0.324 mg/ml buprenorphine hydochloride Solution for Injection for Dogs and Cats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetroson V-10 Bipolar Electrosurgical Unit</td>
			<td>Summit Hill Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation

O modelo de transplante de fígado ortotópico de rato (OLT) é uma ferramenta poderosa para estudar a rejeição aguda e crônica. No entanto, não é uma representação completa do transplante de fígado humano devido à ausência de reconexão arterial. Descrito aqui é um procedimento de transplante modificado que inclui a incorporação da reconexão da artéria hepática (HA), levando a uma melhora acentuada nos resultados do transplante. Com um tempo anháptico médio de 12 minutos e 14 s, a reconexão ha resulta em melhor perfusão do fígado transplantado e aumento da sobrevida do receptor a longo prazo de 37,5% para 88,2%. Este protocolo inclui o uso de algemas e suportes impressos em 3D para conectar a veia do portal e a veia inferior infrahética cava. Pode ser implementado para o estudo de múltiplos aspectos do transplante hepático, desde resposta imune e infecção até aspectos técnicos do procedimento. Ao incorporar um método simples e prático de reconexão arterial utilizando uma técnica microvascular, este protocolo OLT de rato modificado imita de perto aspectos do transplante de fígado humano e servirá como um modelo de pesquisa valioso e clinicamente relevante.

Ao estabelecer um modelo OLT de ratos de anastomose não-HA usando um protocolodescrito anteriormente,nossa equipe observou taxas de sobrevivência de 50% e 37,5% em 21 dias e 60 dias após a operação, respectivamente. Embora as altas taxas de sobrevivência a longo prazo sem anastomose ha tenham sido relatadas por alguns grupos28,esses primeiros resultados destacam as desvantagens de não ter entrada arterial. Em contrapartida, o procedimento otimizado de reconexão ha aumentou significativamente a sobrevida a longo prazo de 37,5% para 88,2% (p = 0,015) (Figura 6).
A análise histológica de um subconjunto representativo de animais transplantados sem reconexão de HA (nos dias 6 e 13 pós-operação) mostrou sinais de lesão hepática hipóxica com necrose centrilobular(Figura 7). A necrose hepática extensiva esteve associada a níveis tremendamente elevados de aminotransferase de alanina (ALT) e aminotransferase aspartate (AST) nesses animais(Figura 7). Em contraste, ratos transplantados com reconexão ha não apresentaram sinais de lesão hepática, e a análise histológica revelou uma estrutura normal de parenchyma hepática com acini organizado, lobules (por exemplo, veia central e tríades portais com veia hepática), artérias e ducto biliar(Figura 7).
Embora o tempo anheptico médio ao longo de 23 operações separadas tenha sido aceitável (12 min e 14 s [± 78 s]), ainda é possível que a sobrevivência no modelo de reconexão não-HA possa eventualmente ser melhorada com o aumento da prática. No entanto, vale ressaltar que três dos quatro animais transplantados sem reconexão ha (que estavam sendo seguidos para sobrevivência a longo prazo) foram eutanizados devido à angústia nos dias 56, 96 e 111 pós-operação. Além disso, a análise histológica dos fígados revelou alterações reativas após lesão hepática hipoxica, incluindo proliferação de ducto biliar marcado, fibrose periportal e inflamação, e parênquim hepático distorcido (Figura Suplementar 2). A presença de características morfológicas de lesão hepática hipóxica corroboram os achados de que a reconexão ha é importante para a perfusão hepática eficiente e função normal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig1.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do desenho da braçadeira impressa em 3D para veia portal e veia inferior infrahética cava. O primeiro empate é apertado na ranhura (ii) mais próxima da alça (iii), e o segundo empate é apertado na ranhura (i) mais distante da alça. Os diâmetros externos são (iv) 2,38 mm para a veia portal (PV) e 2,15 mm para a veia inferior infrahética cava (IHVC). Os diâmetros interiores são (v) 1,74 mm para o PV e 1,38 mm para o IHVC. Os comprimentos são (vi) 2,60 mm para o PV e 2,15 mm para o IHVC (especificações exatas para todos os materiais impressos em 3D podem ser encontrados em Materiais Suplementares). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig2.jpg"> Figura 2: Inserção do stent da artéria hepática no enxerto. (A) A extremidade de abertura do tronco celíaco (i) é ampliada cortando a artéria esplênica à artéria gástrica esquerda, o que expõe a bifurcação do HA comum. (ii) O stent BD é amarrado antes da extração do fígado de rato doador. (iii) A braçadeira PV e (iv) manguito IHVC são inseridas e amarradas dobrando as extremidades dos vasos sobre a braçadeira. (B) (i) Para inserir o stent HA, o HA comum exposto é esticado várias vezes com fórceps. (C) (i) O stent HA é colocado com segurança no HA comum e empatado com 8-0 Prolene. (D) (i) O stent HA é lavado com (ii) solução de lactato de Ringer (BD = ducto biliar, IHVC = veia cava inferior infrahética, HA = artéria hepática). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig3.jpg"> Figura 3: Conexão vena cava inferior infraháptica usando suporte impresso em 3D. (A) O (i) PV está conectado utilizando a mesma técnica da conexão IHVC. O enxerto é (ii) fixado acima do (iii) manguito IHVC. A abertura do IHVC do destinatário é (iv) suturada nas laterais da abertura para um suporte impresso em 3D para mantê-lo estendido. Uma seda 7-0 solta está amarrada ao redor do receptor IHVC. (B) A braçadeira do enxerto IHVC é (i) inserida dentro do receptor IHVC. A gravata solta está agora apertada. (C) O grampo é removido, e (i) o suporte impresso em 3D é destacado com tesoura. (D) Uma seda adicional (i) 7-0 é amarrada em torno da conexão se não for segura, mas tipicamente uma gravata é suficiente (PV = veia portal, IHVC = veia inferior infrahóptica cava). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig4.jpg"> Figura 4: Conexão de manga microvascular da artéria hepática. (A) (i) O stent BD não está conectado ao destinatário. (ii) O stent HA é colocado no enxerto, que está ligado ao (iv) ha do receptor adequado. (iii) O PV está conectado. (B) 10-0 ethilon com uma (i) agulha curva é desenhada através do stent HA para os lados da extremidade de abertura ha receptor. (C) O ethilon 10-0 é puxado de volta através do stent HA; portanto, o HA adequado do destinatário é puxado através do stent como uma manga. (D) (i) Um empate com 10-0 ethilon é feito uma vez que o HA adequado do destinatário é puxado para dentro do stent para a porção que primeiro corre através do stent HA. (E) Mostrado aqui é um esquema da anastomose HA descrito em (B), (C), e (D) (BD = ducto biliar, HA = artéria hepática, PV = veia portal). *A extremidade de abertura do tronco celíaco é ampliada cortando a artéria esplênica na artéria gástrica esquerda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig5.jpg"> Figura 5: Conexão do ducto biliar usando dois stents. (A) (i) O stent do enxerto BD é inserido no BD receptor com o auxílio do (ii) stent vagamente amarrado na abertura do BD do receptor. (iii) O PV está ligado antes da conexão BD, que está localizada atrás do BD. (B) O stent no final do BD do destinatário é removido e usado como uma abertura ampliada para (i) inserir o stent BD amarrado ao enxerto. (C) A gravata que está prendendo livremente o stent receptor é agora usada para amarrar a conexão, e (i) outra seda 7-0 é usada para manter firmemente o stent no lugar para evitar escorregar ou torcer do stent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig6.jpg"> Figura 6: Sobrevivência por cento de transplante. Transplante ortotópico de fígado de rato sem reconexão ha (n = 8) e com reconexão HA (n = 17). Os animais são acompanhados de perto após o transplante para sinais de insuficiência hepática e/ou infecção por pelo menos 60 dias. Ratos que não apresentaram complicações após a cirurgia foram considerados sobreviventes (*p = 0,015, conforme calculado pela estimativa de Kaplan-Meier [teste de classificação longa]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60628/60628fig7.jpg"> Figura 7: Avaliação histopatológica do fígado. Seções representativas de hematoxilina e eosina em animais (A) sem e (B) com religação da artéria hepática (HA) nos dias 6 e 13 após transplante de fígado (LTx). (C) Parenchyma hepático normal mostrando tríade portal (veia portal, artéria e ducto biliar), lobules incluindo veia central e acini. Hepatócitos ao lado da tríade portal são hepatócitos da zona 1; hepatócitos próximos à veia central dentro dos lobulos são hepatócitos da zona 3; e hepatócitos entre as zonas 1 e 3 são hepatócitos da zona 2 (ALT = alanina aminotransferase, AST = aspartate aminotransferase, CV = veia central). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60628/60628suppfig1.jpg"> Figura suplementar 1: Dimensões de stent e manguito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628suppfig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60628/60628suppfig2.jpg"> Figura suplementar 2: Avaliação histopatológica hepática mostrando interrupção do parênquim hepático. Seções representativas de hematoxilina e eosina em animais sem reconexão ha nos dias 54, 96 e 111 após LTx. Por favor clique <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/60628suppfig2large.jpg" target="_blank">aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Material Suplementar 1: Porta cuff 200g - suporte 2.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary1.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material Suplementar 2: Manguito cava 200g - suporte 2.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary2.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material suplementar 3: Retrátil hepático 200g. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary3.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material Suplementar 4: Suporte traseiro - 1.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary4.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material Suplementar 5: Cava 150g - 2.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary5.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material Suplementar 6: Porta 1.4.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary6.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material suplementar 7: Braço titular McGil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary7.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material Suplementar 8: Porta mini braço LAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary8.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material suplementar 9: Holder e braço macio parte 1.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary9.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>
Material Suplementar 10: Base do titular - 3.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60628/supplementary10.stl" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).</a>

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Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

O objetivo deste estudo é modificar o modelo de transplante de fígado ortotópico de ratos para representar melhor o transplante de fígado humano e melhorar a sobrevivência do receptor. O método apresentado restabelece o fluxo arterial hepático conectando a artéria hepática comum do fígado doador à artéria hepática adequada do fígado receptor.

Complicações reduzidas após reconexão arterial em um modelo de rato de transplante de fígado ortotópico

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...

O modelo de transplante de fígado ortotópico de ratos é uma ferramenta poderosa para estudar múltiplos aspectos do transplante hepático. De uma resposta imune sobre a infecção, para aspectos técnicos do procedimento. As principais vantagens dessa técnica são que ela pode reduzir complicações, representando melhor o transplante de fígado e melhorar a sobrevivência do receptor.Este protocolo modificado de transplante hepático ortotópico de ratos imita de perto aspectos do transplante de fígado humano e servirá como modelo de pesquisa variável e clinicamente relevante. Esperamos que através da demonstração visual, os espectadores possam aprender todos os detalhes e encurtar a curva de aprendizado para dominar a habilidade de microcirurgia necessária para essa técnica. Depois de injetar 300 unidades internacionais de sódio heparina na veia cava inferior intrahpática de um rato anesthetizado de 12 a 14 semanas, faça uma incisão de cinco milímetros abaixo da bifurcação do ducto biliar, e insira o stent do ducto biliar no ducto biliar comum.Fixar o stent com uma ligadura de seda 7-0, um milímetro acima da incisão, e uma ligadura 10 milímetros abaixo da bifurcação. Corte o ducto biliar entre os dois laços e exponha a artéria hepática adequada. Divida a artéria gastroduodenal entre duas ligaduras de seda 7-0, e exponha a artéria gástrica esquerda, artéria esplênica e tronco celíaco.Em seguida, corte a artéria gástrica esquerda, artéria esplênica e tronco celíaco entre as amarras da artéria. Use uma seringa de 20 mililitros equipada com uma agulha calibre 21,5 para injetar lentamente 20 mililitros de quatro graus Celsius A solução de lactato de Ringer na veia portal. Para preparar o fígado doador, abra a bifurcação do tronco celíaco, a artéria esplênica e a artéria gástrica esquerda para formar um manguito de manga arterial maior e insira o stent arterial de 1,5 milímetros de comprimento 24 milímetros na artéria hepática comum do doador através do punho.Em seguida, fixar o stent com um 8-0 ligadura de polipropileno e lave o stent com a solução de lactato de Ringer. Depois de expor a veia portal de um receptor de rato de 12 a 14 semanas, divida o ducto biliar receptor a 0,5 centímetros abaixo de uma bifurcação de ladrilho, e insira um stent do ducto biliar no ducto biliar comum distal. Exponha as artérias hepáticas esquerda, média e direita e amarre os vasos distal à bifurcação hepática da artéria.Corte as artérias perto do fígado acima das amarras e coloque um longo pedaço fino de gaze atrás da super hepática veia cava inferior. Coloque um suporte de vena cava intraháptica impresso em 3D atrás da cava vena intrahpática e use uma sutura de monofilamento não absorvível Tenno para costurar as extremidades da alça impressa 3D juntas. Amarre livremente uma ligadura de seda 7-0 abaixo do suporte impresso em 3D entre a veia intrahpática cava e a veia portal, e aperte a veia intraháptica cava logo acima da veia renal direita abaixo do suporte de cava impresso em 3D.Fixar a veia do portal logo acima da veia pilêmica e abaixo do suporte PV impresso em 3D. Usando uma seringa de três mililitros com uma agulha calibre 27 presa, lave dois mililitros de 37 graus Celsius A solução de lactato de Ringer através da bifurcação da veia portal, e fixar a veia super hepática cava acima do fígado com um grampo kitzmiller. Em seguida, corte abaixo do grampo o mais próximo possível do fígado e corte acima dos suportes impressos em 3D tanto para a veia portal quanto para a veia cáptica inter hepática cava para remover o fígado receptor.Para transplante de fígado doador, oriente cuidadosamente o fígado doador dentro da cavidade corporal do receptor de tal forma que uma anastomose de paralelepípedo superior possa ser criada. Insira a braçadeira de portal do doador na veia do portal do receptor e aperte a gravata de seda 7-0. Remova o grampo atrauático da cava vena super hepática e remova o clipe microvascular para a veia portal.Depois de re-perfumar o fígado com sangue quente, insira o receptor intraháptico vena cava no receptor intrahepático vena cava e proteja o vaso com a gravata de seda 7-0. Em seguida, remova o clipe de vena cava intraháptica do doador antes de remover o clipe do receptor. Para realizar uma anastomose arterial, corte a porção do tronco celíaco do doador que se estende além do stent, e aperte a artéria hepática adequada do receptor.Corte a gravata no final e qualquer tecido extra ao redor do vaso. E use a solução de lactato de Ringer para lavar os lúmens das extremidades do doador e do vaso receptor. Usando uma agulha curva, coloque uma sutura de 10-0 ethilon através do aspecto esquerdo da artéria hepática do doador, 2,5 milímetros acima do orifício distal do stent, e saia pela extremidade do stent.Transfixe a artéria hepática adequada do receptor 0,5 milímetros abaixo do orifício do vaso do lado esquerdo da embarcação, para o lado direito da artéria. Coloque a próxima sutura através da parede direita da artéria hepática do doador de dentro para fora, a uma distância do orifício de stent idêntico ao ponto original, e puxe para cima nas duas extremidades do monofilamento nãoabsorbável 10-0 para deslizar o receptor artéria hepática adequada para cima, e para o stent da artéria hepática hepática. Em seguida, amarre o monofilamento 10-0 nãoabsorbável consigo mesmo sobre a artéria hepática do doador.Lave os dutos biliares do receptor e do doador e insira o stent dos dutos biliares do doador no ducto biliar receptor. Em seguida, aperte a gravata que foi previamente colocada ao redor do ducto biliar receptor. Neste experimento representativo, o modelo de transplante de fígado ortopédico da artéria não hepática demonstrou taxas de sobrevivência de 50 e 37,5%, em 21 dias e 60 dias, após a operação, respectivamente.Em contrapartida, o procedimento otimizado de reconexão da artéria hepática aumentou significativamente a sobrevivência a longo prazo. A análise histológica de um subconjunto representativo de animais transplantados sem reconexão da artéria hepática revelou sinais de lesão hepática hipóxica com necrose lobular central, nos dias seis e treze pós-transplante. A necrose hepática extensiva foi associada a níveis tremendamente elevados de imunotransferidos de alanina e amino transferase aspartate nesses animais.Em contraste, ratos transplantados com reconexão da artéria hepática não apresentaram sinais de lesão hepática e análise histológica revelou uma estrutura normal de parenchyma hepática, com acini organizado, lobulos, artérias e ductos biliares. Além disso, a análise histológica dos fígados de ratos modelo de reconexão da artéria não hepática revelou alterações reativas após lesão hepática hipóxica. Incluindo proliferação de ducto biliar de mercado, fibrose e inflamação do portal peri, e parenchyma hepático distorcido.Este protocolo pode ser adaptado para estudar muitos aspectos imunológicos e cirúrgicos do transplante hepático e pode servir como modelo para testar novas intervenções terapêuticas relevantes para o transplante.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Transplante ortotópico de aorta: um modelo de rato para estudar o desenvolvimento de vasculopatia crônica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Medicina

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Desenvolvimento de bronquiolite obliterante em um modelo murino de transplante de pulmão ortotópico

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Transplante hepático ortotópico experimental em ratos

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Surgical Procedures for a Rat Model of Partial Orthotopic Liver Transplantation with Hepatic Arterial Reconstruction

Procedimentos cirúrgicos para um modelo de rato de Transplante de Fígado parcial ortotópico com reconstrução arterial hepática

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats using a whole or partial graft is an indispensable experimental model for transplantation research, such as ...

A Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation Using a Novel Magnetic Anastomosis Technique for Suprahepatic Vena Cava Reconstruction

Um modelo do rato de ortotópico transplante hepático, usando uma técnica de anastomose magnético romance para reconstrução de veia Cava Suprahepatic

The rat model of orthotopic liver transplantation (OLT) is essential for transplant research. It is a very sophisticated animal model and requires a steep ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplante de células-tronco derivadas de tecido adiposo folha para reduzir o vazamento após colectomia parcial em um modelo do rato

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Um modelo pré-clínico porcino de transplante cardíaco ortotópico

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach

Transplante de rim de rato ortotópico: uma abordagem cirúrgica nova e simplificada

Kidney transplantation offers increased survival rates and improved quality of life for patients with end-stage renal disease, as compared to any type of ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

Left Lung Orthotopic Transplantation in a Juvenile Porcine Model for ESLP

Transplante ortotópico de pulmão esquerdo em modelo suíno juvenil para PESL

Lung transplantation is the gold-standard treatment for end-stage lung disease, with over 4,600 lung transplantations performed worldwide annually. ...