Name: isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

ولم اعلامات صاحبا البلاغ.

تم جمع العينات من الانسجه البشرية وفقا لإعلان هلسنكي في حين مراقبه مستشفي جامعه فيديريكو الثاني المبادئ التوجيهية. وقدم جميع المرضي المشاركين في هذه الدراسة موافقه خطيه.
1. اعداد اللوازم والاعلام الثقافي
<ol><li>تنظيف والاوتوكلاف واحد زوج كبير من مقص الجراحية ، ومجموعتين من ?...

<ol>
	<li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research.">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li><li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency:+what+will+become+of+embryonic+stem+cells.">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases.">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+(ipsc)+based+therapeutics.">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li><li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Cell+Reprogramming:+Methods+and+Applications.">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li><li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation.">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li><li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion.">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li><li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choices+for+Induction+of+Pluripotency:+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies.">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li><li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells:+implications+in+cell-based+regenerative+medicine.">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells.">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells.">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts.">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li><li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins.">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li><li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency.">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells.">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation,+stemness,+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li><li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development.">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li><li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells.">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li></ol>

ipscs الناشئة بسرعة كمرشح الخلية الواعدة للتطبيقات الطب التجديدي وكاداه مفيده للغاية لنمذجة الامراض واختبار المخدرات3,8. يصف البروتوكول المعروض هنا توليد iPSCs البشرية من عينه لها حجم خزعة الجلد لكمه مع اجراء بسيط وفعال لا يتطلب اي معدات محدده أو خبره سابقه مع أ...

وتمثل أعاده برمجه الخلايا تكنولوجيا جديده لتحويل كل خليه جسديه من الجسم إلى خليه جذعيه مستحثه ، تعرف باسم iPSC1. وقد تغلبت امكانيه أعاده برمجه خليه جسديه بالغه إلى دوله مستحثه وغير متمايزة علي الحدود التي يفرضها الفقراء علي التوافر والمسائل الاخلاقيه المتصلة باستخدام الخلايا المستحثة ، والتي كانت في السابقحيد عنه فقطمن الاجنه البشرية (الخلايا الجذعية الجنينية أوESC). في 2006 ، اجري كازوتوشي تاكاهاشي وشينيا ياماناكا دراسة رائده لتحقيق أول تحويل للخلايا الجسدية البالغة من الجلد إلى خلايا مستحثه باضافه أربعه جينات محدده بشكل مصطنع (Oct4 ، Sox2 ، Klf4 ، c-Myc)5. وبعد عام ، ادي العمل الذي اجري في مختبر طومسون إلى أعاده برمجه ناجحه للخلايا الجسدية في iPSCs عن طريق توصيل مزيج مختلف من أربعه جينات (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
تقدم iPSCs عددا من الفرص للعلماء والباحثين من مختلف المجالات ، مثل الطب التجديدي وعلم الصيدلة ، كونها منصة ممتازة لدراسة وعلاج الامراض المختلفة جنبا إلى جانب انعكاس التنميط الجيني لخصائص المريض التي تستمد منها. استخدام iPSCs يوفر العديد من المزايا بما في ذلك: انخفاض خطر الاستجابة المناعية بسبب أصل ذاتي تماما من الخلايا. امكانيه إنشاء مكتبه خليه ، أداه هامه للتنبؤ بالاستجابة للعقاقير الجديدة وأثارها الجانبية ، لأنها قادره علي التجديد الذاتي باستمرار وتوليد أنواع مختلفه من الخلايا ؛ والفرصة لوضع نهج مخصص لأداره المخدرات7،8،9.
تقنيات متنوعة معروفه في الوقت الحاضر ، للحث علي التعبير عن عوامل أعاده برمجه وانها مدرجه في فئتين رئيسيتين: الطرق غير الفيروسية والفيروسية القائمة علي ناقلات الامراض10،11،12،13. وتشمل الطرق غير الفيروسية نقل mrna ، ميرنا العدوى/ترانسكشن ، الحاملة ، النواقل الصغيرة والبلازميدات الفرجين و exosomes10،11،12،13. وتشمل الأساليب القائمة علي الفيروسية الفيروسات غير المدمجة ، مثل فيروس الغدة الدرقية ، وحمي سينداي والبروتينات ، ودمج الفيروسات مثل الفيروسات الرجعية و لينتيفيروس10،11،12،13.
وفقا لعده دراسات ، لم يلاحظ اي اختلافات كبيره بين هذه الطرق من حيث فعاليه أعاده برمجه الخلية ، التالي ، فان اختيار الطريقة المناسبة يعتمد بدقه علي نوع الخلية المستخدمة وعلي التطبيقات اللاحقة من ipscs التي تم الحصول عليها14،15. جميع الطرق المذكورة تظهر مساوئ, علي سبيل المثال, فيروس سينداي فعاله علي جميع أنواع الخلايا, ولكن يتطلب الكثير من الممرات للحصول علي iPSCs; أعاده برمجه من قبل الابيسمات ممتازة لخلايا الدم ولكن يحتاج إلى تعديل ظروف الثقافة القياسية للخلايا الليفية. يمكن ان تمثل طريقه الدخول بديلا جذابا ولكن الدراسات في الخلايا البشرية لا تزال محدوده وضعيفه10،11،12،13. التماثيل هي الحويصلات النانويه يفرز فسيولوجيا في جميع سوائل الجسم عن طريق الخلايا. ووفقا للدراسات الاخيره ، فهي مسؤوله عن الاتصالات بين الخلايا ويمكن ان يكون لها دور في العمليات البيولوجية الهامه ، مثل تكاثر الخلايا والهجرة والتمايز. Exosomes يمكن نقل ونقل mRNA وميرنا إلى الخلايا المتلقية مع اليه طبيعيه تماما ، كما انها تشترك في تكوين نفس الغشاء الخلوي16. ولذلك ، exosomes هي تقنيه جيل جديد واعده لأعاده برمجه ، ولكن قدرتها علي أعاده برمجه الخلايا الجسدية من محتواها لا يزال قيد التحقيق. تستخدم الأساليب القائمة علي النواقل الفيروسية الفيروسات المعدلة من أجل نقل الجينات أعاده برمجه إلى الخلايا المتلقية. هذا الأسلوب, علي الرغم من كفاءه عاليه من أعاده برمجه, لا تعتبر أمنه, كما ان دمج الفيروس داخل الخلية يمكن ان تكون مسؤوله عن العدوى, التراتومه وعدم الاستقرار الجينوم17.
البروتوكول التالي لتوليد مستعمرات iPSCs يجمع بين الكوكتيل في ياماناكا وأعاده برمجه طومسون ويستند علي استخدام طريقه تتطلب نانومتر-RNAs وعوامل التهرب المناعي مع امكانيه تنفيذ ذلك في ظروف خاليه من xeno. الأساس المنطقي وراء استخدام هذه الطريقة هو لنشر ، داخل المجتمع العلمي ، بروتوكول السماح لأعاده برمجه سريعة وبسيطه وفعاله للغاية من الخلايا الليفية البشرية الكبار من جلد البطن إلى iPSCs18.
نقاط القوه في الطريقة المقترحة هي ، في الواقع ، سهوله الأداء والوقت القصير اللازم للحصول علي iPSCs. وعلاوة علي ذلك ، فان الطريقة تتجنب أليات الدفاع الخلوي واستخدام النواقل الفيروسية ، المسؤولة عن القضايا ذات الصلة.
وفيما يتعلق بالبروتوكول الموحد ، أجريت التعديلات التالية: (1) تمت مزامنة متموج الخلايا الليفية في مرور 4 من خلال وضع في المصل 0.1 ٪ ل 48 h قبل التريسينزيشن ؛ (2) تم تعديل الكثافة الخلوية للثقافة وحجم الكواشف للاستخدام علي لوحه متعددة الآبار 24 جيدا بدلا من لوحه 6-حسنا ؛ (3) تم تنفيذ تجربه أعاده برمجه باستخدام حاضنه 5 ٪ CO2 بدلا من حاضنه مع الغلاف الجوي (21 ٪ o2) أو نقص الأكسجين (5 ٪ س2) الشروط.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td>Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>F9665-500ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H1387-1L</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>13778-030</td>
			<td>Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, store at -20 &#176;C. Avoid multiple freeze-thaws.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1116</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Culture Medium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A-500ml</td>
			<td>Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 &#176;C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 &#176;C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062-100ml</td>
			<td>Reduced-Serum Medium; store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4333-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P5665</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 0.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030124537</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030120086</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Cleaning agent for removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>00-0076</td>
			<td>Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method

ويمكن اعتبار الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) ، حتى الآن ، مصدرا واعدا للخلايا المستحثة لأداره الامراض غير القابلة للعلاج حاليا ، ولأعاده تشكيل الانسجه المصابة وتجديدها ، ولتطوير ادويه جديده. علي الرغم من جميع المزايا المتعلقة باستخدام iPSCs ، مثل انخفاض خطر الرفض ، والقضايا الاخلاقيه التي قللت ، وامكانيه الحصول عليها من كل من المرضي الصغار والكبار دون اي فرق في امكانيه أعاده برمجتها ، ومشاكل للتغلب علي لا تزال عديده. في الواقع ، يمكن أعاده برمجه الخلايا التي أجريت مع فيروسات الفيروسية ودمج تسبب العدوى وإدخال الجينات المطلوبة يمكن ان تحفز عدم الاستقرار الجينوم من الخلية المتلقية ، مما يعوق استخدامها في العيادة. علي وجه الخصوص ، هناك العديد من المخاوف بشان استخدام الجينات c-Myc ، والمعروفة من عده دراسات لنشاطها حفز الطفرة. وقد برزت الخلايا الليفية كالسكان الخلية مناسبه لأعاده برمجه الخلوية لأنها سهله لعزل والثقافة ويتم حصادها بواسطة خزعة الجلد الطفيفة الغازية لكمه. البروتوكول الموصوف هنا يوفر وصف مفصل خطوه بخطوه للاجراء بأكمله ، من معالجه العينة للحصول علي ثقافات الخلايا ، واختيار الكواشف واللوازم ، والتنظيف والاعداد ، إلى أعاده برمجه الخلية بواسطة وسائل تجاريه مجموعه أعاده البرمجة المستندة إلى RNAs (NM-RNAs) غير المعدلة. مجموعه أعاده برمجه المختار يسمح لأعاده برمجه فعاله من الخلايا الليفية الجلدية البشرية إلى iPSCs والمستعمرات الصغيرة يمكن ان ينظر اليها في وقت مبكر 24 ح بعد الانتقال الأول ، حتى مع التعديلات مع الاحترام لورقه البيانات القياسية. الاجراء أعاده برمجه المستخدمة في هذا البروتوكول يوفر ميزه أعاده برمجه أمنه, دون مخاطر العدوى الناجمة عن الأساليب الفيروسية القائمة علي ناقلات, يقلل من أليات الدفاع الخلوية, ويسمح للجيل من iPSCs خاليه من xeno, جميع الميزات الهامه التي إلزاميه لمزيد من التطبيقات السريرية.

وكان الهدف من هذا البروتوكول هو أعاده برمجه الخلايا الليفية الجلدية المعزولة عن جلد البطن باستخدام طريقه البرمجة غير المدمجة التي تعتمد علي NM-RNAs للحث علي التعبير عن عوامل محدده. لتحقيق هذا الهدف ، تم عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية من عينات الجلد من المرضي الذين يخضعون لجراحه شد البط?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

تتطلب أعاده برمجه الخلايا إدخال الجينات الرئيسية ، التي تنظم وتحافظ علي حاله الخلايا المستحثة. البروتوكول الموصوف يمكن تشكيل الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) مستعمرات من الليفية الجلدية البشرية دون أساليب الفيروسية/دمج ولكن باستخدام RNAs غير المعدلة (نانومتر-RNAs) جنبا إلى جنب مع عوامل التهرب المناعي الحد من أليات الدفاع الخلوي.

عزل الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغين من جلد البطن وتوليد مستحث المستحثة باستخدام أسلوب غير دمج

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

البروتوكول التالي يوفر تعليمات لتوليد الخلايا الجذعية الذاتية التي يسببها الإنسان متعددة القدرات من خلال إعادة برمجة سريعة وفعالة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية المعزولة من خزعة لكمة الجلد. الإجراءات يمكن أن تنفذ من قبل الباحثين مع خبرة ضئيلة أو معدومة في إعادة برمجة الخلايا ومع التكيف السليم، ويسمح نتاج الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالخلايا المتعددة القدرات غير المستحثة بـ xeno. يمكن استخدام خلايا IPS الذاتية لتطبيقات الطب التجديدي والنمذجة لأمراض مثل الاضطرابات الوراثية أو السرطان للتحقيق في الآليات الجزيئية الأساسية وتطوير علاجات أكثر تحديدًا.فعبء العمل مرتفع. ومن المفيد للغاية دراسة البروتوكول قبل التخطيط بعناية للتجربة، بما في ذلك الخطوات التي ينبغي خلالها إعداد الكواشف والمواد. إن العرض المرئي للإجراء يساعد الأبحاث ذات الخبرة الضئيلة أو التي لا تقوم بعزل الخلية وإعادة البرمجة، وتجنب الأخطاء الشائعة المتعلقة بالتلوث الميكروبي والRNA المحتمل.تحت غطاء معقمة، قم بغسل عينة الجلد البشري التي تم الحصول عليها حديثًا من البطن في طبق 100 ملليمتر مع حل HPSS. إزالة الشعر والدهون باستخدام ملقط ناعم ومقص وتشريحه بمشرط للحصول على شظايا من حجم مليمترين في ملليمتر واحد، وتجنب الندوب، والمناطق القذرة أو المحروقة من الأنسجة. ضع أربع أجزاء صغيرة في كل طبق 35 ملليمتر، غطيه بزجاج معقمة وضيف 1.5 ملليمتر من I-DMEM.احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لحوالي 15 يوما أو حتى تصل الخلايا التقاء 85٪. تغيير ثقافة المتوسطة كل ثلاثة أيام والتحقق من نمو الخلايا باستخدام المجهر النقيض المرحلة المقلوب يوميا. الآن، رفع الغطاء النظارات مع ملقط غرامة، ووضعها رأسا على عقب في طبق 100 ملليمتر وغسل مع 1X برنامج تلفزيوني معقمة.إزالة أجزاء من العينات وتجاهلها. اغسل الأطباق مع 1X PBS العقيمة. إزالة برنامج تلفزيوني 1X وإضافة ثلاثة ملليمترات من تريبسين-EDTA إلى النظارات غطاء وضعت في طبق 100 ملليمتر وإضافة ملليمتر واحد من تريبسين-EDTA إلى 35 ملليمتر أطباق كذلك.احتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم، كتلة التربسينية عن طريق إضافة خمسة ملليمترات من TSS إلى طبق 100 ملليمتر واثنين من ملليمترات من TSS إلى كل طبق 35 ملليمتر. جمع تعليق في أنابيب معقم 15 ملليمتر، الطرد المركزي في 400 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.التعرق وssuspend بيليه في 12 ملليمتر من I-DMEM. تقسيم تعليق الخلية إلى ثلاثة ملليمتر aliquots ونقل كل منها في لوحة 60 ملليمتر. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.تغيير المتوسط يوميا. إبقاء الخلايا في الثقافة حتى تصل إلى التقاء 75٪ بعد ذلك، كرر التربسيناتية ثلاث مرات للحصول على الخلايا التي مرور أربعة. ثم مزامنة الخلايا عن طريق استبدال I-DMEM مع S-DMEM واحتضان لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.أثناء تزامن الخلية، وإعداد توسيع الخلايا الليفية المتوسطة ومجموع غير معدلة رنا إعادة برمجة كوكتيل للبرمجة الحرة الليفية. لتبسيط إعداد الأنابيب التسعة من aliquots الحمض النووي الريبي غير المعدلة التي يتم تقسيمها بعد ذلك إلى 36 ، اعتدنا على اتباع مخطط نعلقه على جدار غطاء محرك السيارة. معطف لوحة 24-جيدا عن طريق نقل 100 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ذاب على الجليد إلى كل بئر لتغطية بشكل موحد القاع.احتضان لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية قبل بذر الخلايا. pirate المتوسطة من لوحات مع الخلايا في الثقافة وغسل بسرعة في 1X PBS. كرر التبسينيم للحصول على الخلايا التي مرور خمسة.التعرق وssuspend بيليه في حجم مناسب من الليفية التوسع المتوسطة. تحضير وتنظيف جهاز قياس الهيموسيت مع 70٪ من الكحول. ثم، إعداد حل عن طريق خلط بلطف 10 ميكرولترات من الأزرق trypan و 10 ميكرولترات من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر، واحتضان لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.ماصة 10 ميكرولترات من الحل في قياس الهيموسيت ووضعها على خشبة المسرح من المجهر النقيض المرحلة المقلوبة لحساب. الخلايا غير القابلة للحياة زرقاء بينما الخلايا القابلة للحياة غير مُطَرَّقة. عد الخلايا في مربعين على الأقل من غرفة قياس الهيموسيت.تنفيذ التخفيف للحصول على كثافة 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل 500 ميكرولترات من الليفي توسيع المتوسطة و resuspend بيليه الخلية. ماصة 500 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة 24-جيدا. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في الصباح، وإزالة المتوسطة القديمة من كل بئر واستبدالها مع 500 ميكرولترات من قبل زارميد xeno خالية من عامل خالية من الثقافة المتوسطة. احتضان في 37٪ درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات على الأقل. ذوبان خمسة 15.4 ميكرولتر aliquots من مجموع nmrna إعادة برمجة كوكتيل في درجة حرارة الغرفة ثم وضعها في الجليد.إضافة 234.6 ميكرولترات من متوسطة المصل مخفضة لكل aliquot، ماصة بلطف ثلاث إلى خمس مرات وتسمية كل واحد كما أنبوب A.Label خمسة مواسير معقمة خالية من 0.5 ملليلتر أنابيب كما أنبوب B ومزيج ستة ميكرولترات من الاصطناعية الصغيرة تتدخل RNA reafection مع 244 ميكرولتر من متوسطة المصل مخفضة. ثم، واستخدام الماصات لإضافة محتويات كل أنبوب B إلى أنبوب قطرة الحكمة. مزيج عن طريق التنصت على الجزء السفلي من الأنبوب.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، لإضافة 125 ميكرولترات من nmRNA حل معقدة نقل من كل من aliquots الخمسة إلى كل بئر، إمالة لوحة والماصات قطرة الحكمة في الوسط. اخلط المحتويات في الآبار العشرين عن طريق الهزاز بلطف.استخدم الآبار الأربعة المتبقية كمرجع. احتضان لوحة لمدة 15 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، استلهم الوسط.تحت غطاء محرك السيارة العقيمة، كرر إجراء transfection، كما في اليوم الأول، كل يوم لمدة ثلاثة أيام أخرى. في اليوم الخامس، استلهم الوسط وتبادله مع سيارة XF/FF ثقافة متوسطة طازجة ومدفأة مسبقًا تحت غطاء معقمة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.مراقبة ثقافة الخلية يوميا عن طريق المجهر النقيض مرحلة، حتى مراقبة تشكيل مستعمرات IPSC. وكان الهدف من هذا البروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية المعزولة من جلد البطن باستخدام طريقة إعادة البرمجة غير المتكاملة. تفوقت الخلايا الليفية البشرية من عينات من جلد البطن في غضون أسبوع واحد من الثقافة ووصلت إلى التقاء 85٪في غضون أسبوعين.تميزت الخلايا بنمو لاصق على أطباق الثقافة البلاستيكية ، وتنوعت مورفولوجياها من ممدود ومغزل الشكل إلى مسطح وشكل نجمة. الليفية مورفولوجيا والترتيب والثقافة تغيرت بشكل كبير بعد البذر على BMM، عندما اكتسبوا مورفولوجيا ممدود ورتبت لتشكيل هياكل متفرعة رقيقة. كانت المستعمرات الصغيرة مرئية بالفعل في الثقافة في اليوم الأول من مرحلة النقل الأولى ونما حجمها تدريجياً بمرور الوقت، في حين زاد عددها حتى اليوم السابع ثم ظلت مستقرة بين اليوم السابع واليوم 14، ربما نتيجة اندماج المستعمرات الأصغر لتشكيل مستعمرات أكبر.وبما أن إجراء إعادة البرمجة قد تم باستخدام وسائل الإعلام الخالية من المضادات الحيوية، في حالة عدم ضمان الظروف العقيمة، أصبح التلوث الميكروبي قضية رئيسية. ويؤثر معدل الانتشار وكثافة الطلاء على كفاءة إعادة البرمجة، لذا من المهم تخطيط عملية تمرير الخلايا وتحديد كثافة الطلاء على أساس معدل انتشار الخلايا. استبدال الكواشف المشتقة من الحيوانات للكاشف المناسبة خالية من xeno ، وهذا البروتوكول يسمح بإعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية البالغة في خلايا IPS في بيئة ثقافة خالية من xeno كاملة لم تكن استخدامها السريري.الخلايا البشرية هي مصدر محتمل للعدوى بمسببات الأمراض المنقولة بالدم ، وبالتالي ، يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية طوال العملية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

طريقة محسنة لإعداد النوع الأول الكولاجين من الجلد

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

التمايز الموجه لخلايا بودوسيت الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان في ظل ظروف محددة كيميائيا

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

طريقة ثقافية للحفاظ على الخلايا الجذعية الدموية البشرية الكويسنت

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

جيل من مكافئات الجلد البشري الوعائية ذاتية التجميع

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...