Name: isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Forfatterne har ingen kvitteringer.

Prøverne fra humant væv blev indsamlet i henhold til Helsinki-erklæringen, mens de observerede University Hospital Federico II retningslinjer. Alle patienter, der er involveret i dette studie, gav skriftligt samtykke.
1. forberedelse af forsyninger og kultur medier
<ol><li>Rengør og autoklave et stort par kirurgisk saks, to sæt fine pincet, to par microdissecting saks, 1 L steril flaske, 500 mL steril flaske og en 250 mL steril flaske.</li>
	<li>Forbered 100 mm plader, 60 mm plader, 35 ...

<ol>
	<li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research.">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li><li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency:+what+will+become+of+embryonic+stem+cells.">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases.">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+(ipsc)+based+therapeutics.">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li><li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Cell+Reprogramming:+Methods+and+Applications.">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li><li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation.">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li><li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion.">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li><li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choices+for+Induction+of+Pluripotency:+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies.">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li><li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells:+implications+in+cell-based+regenerative+medicine.">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells.">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells.">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts.">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li><li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins.">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li><li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency.">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells.">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation,+stemness,+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li><li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development.">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li><li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells.">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li></ol>

ipscs er hurtigt ved at dukke op som den mest lovende celle kandidat til regenerativ medicin applikationer og som et uhyre nyttigt værktøj til sygdoms modellering og Drug test3,8. Den protokol, der præsenteres her, beskriver den generation af humane iPSCs fra en prøve, der har størrelsen af en hud punch biopsi med en enkel og effektiv procedure, som ikke kræver noget specifikt udstyr eller tidligere erfaring med omprogrammering teknologi.
<p class="jove...

Celle omprogrammering repræsenterer en ny teknologi til at omdanne hver somatisk celle i kroppen til en pluripotente stamcelle, kendt som iPSC1. Muligheden for at omprogrammere en voksen somatisk celle tilbage til en pluripotente og udifferentieret tilstand har overvundet de grænser, der er pålagt af de ringe tilgængelighed og etiske spørgsmål i forbindelse med brugen af pluripotente celler, som tidligere kun kan udledes af menneskelige embryoner (embryonale stamceller eller ESC)2,3,4. I 2006 gennemførte Kazutoshi Takahashi og Shinya Yamanaka en pioner undersøgelse, der opnåede den første omdannelse af voksne somatiske celler fra huden til pluripotente celler ved kunstigt at tilføje fire specifikke gener (Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC)5. Et år senere førte det arbejde, der blev udført i Thomsons laboratorium, til en vellykket omprogrammering af somatiske celler til iPSCs ved transduktion af en anden kombination af fire gener (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSCs tilbyder en række muligheder for videnskabsfolk og forskere på forskellige områder, såsom regenerativ medicin og farmakologi, som er en glimrende platform til at studere og behandle forskellige sygdomme sammen med en genotypisk afspejling af de karakteristika af patienten, de er afledt af. Brugen af iPSCs giver flere fordele, herunder: den reducerede risiko for immunrespons på grund af en fuldstændig autologt oprindelse af celler; muligheden for at skabe et celle bibliotek, et vigtigt redskab til at forudsige respons på nye lægemidler og deres bivirkninger, da de er i stand til kontinuerligt selv forny og generere forskellige celletyper; og chancen for at udvikle en skræddersyet tilgang til Drug Administration7,8,9.
Forskellige teknikker er kendt på nuværende tidspunkt, at inducere udtryk for omprogrammering faktorer, og de er inkluderet i to hovedkategorier: ikke-virale og virale vektor-baserede metoder10,11,12,13. Ikke-virale metoder omfatter mRNA transfection, Mirna infektion/transfection, piggybac, minicircle vektorer og episomal plasmider og exosomer10,11,12,13. Viral-baserede metoder omfatter ikke-integrerede vira, såsom adenovirus, Sendai virus og proteiner, og integrere vira som retrovirus og lentivirus10,11,12,13.
Ifølge flere undersøgelser, ingen væsentlige forskelle er blevet bemærket blandt disse metoder med hensyn til effektiviteten af celle omprogrammering, derfor valget af den egnede metode strengt afhænger af den anvendte celletype og på de efterfølgende anvendelser af ipscs opnået14,15. Alle de nævnte metoder viser ulemper, for eksempel, Sendai virus er effektiv på alle celletyper, men kræver en masse passager for at få iPSCs; omprogrammering af episomes er fremragende til blodlegemer, men trænger til ændring af standard dyrkningsbetingelser for fibroblaster; piggybac-metoden kan udgøre et attraktivt alternativ, men undersøgelser i humane celler er stadig begrænsede og svage10,11,12,13. Exosomer er Nano-vesikler fysiologisk udskilles i alle kropsvæsker af celler. Ifølge nylige undersøgelser, de er ansvarlige for intercellulære kommunikation og kan have en rolle i vigtige biologiske processer, såsom celle spredning, migration og differentiering. Exosomer kan transportere og overføre mRNA og miRNA til modtager celler med en helt naturlig mekanisme, da de deler den samme sammensætning af cellemembranen16. Derfor er exosomer en lovende ny generation teknik til omprogrammering, men deres potentiale til at omprogrammere somatiske celler ved deres indhold er stadig under efterforskning. Viral vektorer-baserede metoder bruger vira modificeret for at formidle omprogrammering gener til modtager celler. Denne teknik, på trods af den høje effektivitet af omprogrammering, anses ikke for sikker, da integrationen af virus i cellen kan være ansvarlig for infektion, Teratomer og genomisk ustabilitet17.
Følgende protokol til at generere iPSCs kolonier kombinerer Yamanaka og Thompson's omprogrammering cocktail og er baseret på brugen af en metode, der kræver NM-RNAs og immun unddragelse faktorer med mulighed for at udføre det i Xeno-fri betingelser. Rationalet bag brugen af denne metode er at sprede, inden for det videnskabelige samfund, en protokol, der giver mulighed for en hurtig, enkel og meget effektiv omprogrammering af voksne humane fibroblaster fra abdominal hud i iPSCs18.
Den foreslåede metodes styrker er faktisk den nemme ydeevne og den korte tid, der er nødvendig for at opnå iPSCs. Desuden, metoden undgår cellulære forsvarsmekanismer og brugen af virale vektorer, ansvarlig for relevante spørgsmål.
Med hensyn til standardprotokollen blev der foretaget følgende ændringer: (1) Confluent fibroblaster blev synkroniseret ved passage 4 ved at placere i 0,1% serum for 48 h før trypsinization; (2) den cellulære densitet for kultur og mængden af reagenser blev justeret for udnyttelsen på en 24-brønd multi-brønd plade i stedet for en 6-brønd plade; (3) omprogrammerings forsøget blev udført ved hjælp af en 5% Co2 -inkubator i stedet for en inkubator med atmosfæriske (21% o2) eller hypoksiske (5% o2) betingelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td>Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>F9665-500ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H1387-1L</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>13778-030</td>
			<td>Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, store at -20 &#176;C. Avoid multiple freeze-thaws.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1116</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Culture Medium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A-500ml</td>
			<td>Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 &#176;C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 &#176;C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062-100ml</td>
			<td>Reduced-Serum Medium; store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4333-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P5665</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 0.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030124537</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030120086</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Cleaning agent for removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>00-0076</td>
			<td>Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method

Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) kunne til dato betragtes som en lovende kilde til pluripotente celler til håndtering af sygdomme, der i øjeblikket ikke kan behandles, til rekonstitution og regenerering af skadede væv og til udvikling af nye lægemidler. Trods alle de fordele, der er forbundet med brugen af iPSCs, såsom den lave risiko for afvisning, de mindre etiske spørgsmål og muligheden for at få dem fra både unge og gamle patienter uden nogen forskel i deres omprogrammerings potentiale, problemer med at overvinde er stadig talrige. Faktisk, celle omprogrammering udført med virale og integrere virus kan forårsage infektioner og indførelsen af nødvendige gener kan fremkalde en genomisk ustabilitet af recipient cellen, forringe deres brug i klinikken. Der er især mange betænkeligheder ved brugen af c-MYC-genet, som er velkendt fra flere undersøgelser for sin mutation-inducerende aktivitet. Fibroblaster er dukket op som den egnede cellepopulation til cellulær omprogrammering, da de er nemme at isolere og kultur og høstes af en minimalt invasiv hudpunch biopsi. Den her beskrevne protokol indeholder en detaljeret trin-for-trin beskrivelse af hele proceduren, fra prøve behandling for at opnå cellekulturer, valg af reagenser og forsyninger, rengøring og tilberedning, til celle omprogrammering ved hjælp af en kommerciel ikke-modificeret RNAs (NM-RNAs)-baseret omprogrammering kit. Den valgte omprogrammering kit giver mulighed for en effektiv omprogrammering af human dermal fibroblast til iPSCs og små kolonier kan ses så tidligt som 24 h efter den første transfection, selv med ændringer med respekt for standarddata arket. Den omprogrammering procedure, der anvendes i denne protokol giver fordelen ved en sikker omprogrammering, uden risiko for infektioner forårsaget af viral vektor-baserede metoder, reducerer de cellulære forsvarsmekanismer, og giver mulighed for generering af Xeno-fri iPSCs, alle vigtige funktioner, der er obligatoriske for yderligere kliniske anvendelser.

Formålet med protokollen var at omprogrammere Dermal fibroblaster isoleret fra abdominal hud ved hjælp af ikke-integrerende omprogrammerings metode baseret på NM-RNAs til at inducere ekspression af specifikke faktorer. For at nå dette mål blev humane Dermal fibroblaster isoleret fra hudprøver af patienter, der gennemgik mave sæk kirurgi, og iPSCs blev genereret ved at introducere Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 omprogrammerings faktorer og E3, K3, B18 immun unddragelse faktorer ved en kommerciel klar til brug...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Celle omprogrammering kræver indførelse af vigtige gener, som regulerer og vedligeholder pluripotente celle tilstand. Den beskrevne protokol muliggør dannelse af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) kolonier fra humane Dermal fibroblaster uden virale/integreretsmetoder, men ved hjælp af ikke-modificerede RNAs (NM-RNAs) kombineret med immun unddragelse faktorer, der reducerer cellulære forsvarsmekanismer.

Isolering af voksne humane Dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering af inducerede pluripotente stamceller ved hjælp af en ikke-integrerings metode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Følgende protokol indeholder instruktioner til at generere autologe human-induceret pluripotente stamceller gennem hurtig og effektiv omprogrammering af humane dermal fibroblaster isoleret fra en hud punch biopsi. Procedurerne kan udføres af forskere med ringe eller ingen erfaring med celle omprogrammering og med korrekt justering, tillader produktet af xeno-fri induceret pluripotente stamceller. Autologe IPS-celler kan anvendes til regenerative medicinapplikationer og til modellering af sygdomme som genetiske sygdomme eller kræft for at undersøge de underliggende molekylære mekanismer og udvikle mere specifikke behandlinger.Arbejdsbyrden er høj. Det er yderst nyttigt at studere protokollen, før forsøget planlægges omhyggeligt, herunder de trin, hvor reagenser og materialer skal forberedes. Den visuelle demonstration af proceduren hjælper forsker med ringe eller ingen erfaring udføre celleisolering og omprogrammering, undgå almindelige fejl i forbindelse med mulige mikrobielle og RNA forurening.Under en steril hætte vaskes den friskudybte prøve af menneskers hud fra maven i en 100 millimeter skål med HPSS-opløsning. Fjern hår og fedt ved hjælp af fine kraftaffængt og saks og dissekere det med en skalpel for at opnå fragmenter af størrelsen af to millimeter med en millimeter, undgå ar, snavsede eller brændte områder af vævet. Placer fire små fragmenter i hver 35 millimeter skål, dække med en steril dække glas og tilsæt 1,5 millimeter I-DMEM.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i ca 15 dage, eller indtil cellerne når 85% sammenløb. Skift kulturmediet hver tredje dag og tjek udvæksten af celler ved hjælp af en omvendt fase kontrast mikroskop dagligt. Løft nu dækglassene med fine snævle, læg dem på hovedet i en 100 millimeter skål og vask med 1X steril PBS.Fjern fragmenterne af prøverne og kassér dem. Vask plader med 1X steril PBS. Fjern 1X PBS og tilsæt tre millimeter Trypsin-EDTA til dækglas placeret i 100 millimeter skålen og tilsæt en millimeter Trypsin-EDTA til de 35 millimeter retter også.Inkuberes i fem minutter ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Derefter blokere trypsinization ved at tilføje fem millimeter TSS til 100 millimeter skål og to millimeter TSS til hver 35 millimeter skål. Opsaml suspensionen i 15 millimeter sterile rør, centrifuge ved 400 gange G ved fire grader Celsius i fem minutter.Inspirer supernatanten og opspjæv pellet i 12 millimeter I-DMEM. Split celle suspension i tre millimeter aliquots og overføre dem hver i en 60 millimeter plade. Inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Skift mediet dagligt. Hold celler i kultur, indtil de når et sammenløb på 75%Efter det, gentag trypsinization tre gange for at få celler, passage fire. Derefter synkronisere cellerne ved at erstatte I-DMEM med S-DMEM og inkubere i 48 timer ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Under cellesynkroniseringen skal du forberede fibroblastudvidelsesmedium og total ikke-modificeret RNA omprogrammering cocktail til fibroblastfri programmering. For at forenkle forberedelsen af de ni rør af ikke-modificerede RNA-aliquots, der derefter er opdelt i 36, plejede vi at følge en ordning, som vi fastgjort til hættevæggen. Coat en 24-brønd plade ved at overføre 100 mikroliter af kælder membran matrix optøet på is til hver brønd til ensartet dække bunden.Inkuberes i mindst en time ved 37 grader Celsius, før cellerne sås. Inspirer mediet fra plader med celler i kultur og vask hurtigt i 1X PBS. Gentag trypsinisering for at få celler, der passage fem.Inspirer supernatanten og opspjæn pellet i en passende mængde fibroblast ekspansion medium. Forbered og rengør hæmocytometeret med 70% alkohol. Derefter forberedes en opløsning ved forsigtigt at blande 10 mikroliter trypanblå og 10 mikroliter celleaffjedring i et 1,5 milliliterrør, og inkubere i et til to minutter ved stuetemperatur.Pipette 10 mikroliter af opløsningen i hæmocytometeret og placere den på scenen af en omvendt fase kontrast mikroskop til at tælle. Ikke-levedygtige celler er blå, mens levedygtige celler ikke er indgroede. Tæl cellerne i mindst to kvadrater af hemocytometerkammeret.Udfør en fortynding for at opnå en masseitet på 2,5 gange 10 til de fjerde celler pr. 500 mikroliter af fibroblast ekspansionsmedium og resuspend cell pellet. Pipette 500 mikroliter af cellesuspensionen i hver brønd af 24-brøndpladen. Inkuber celler natten over ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Om morgenen skal du fjerne det gamle medie fra hver brønd og erstatte det med 500 mikroliter af præ-zarmed xeno-fri faktorfri kulturmedium. Inkuberes ved 37% grader Celsius under 5% kuldioxid i mindst seks timer. Tø fem 15,4 mikroliter aliquots af samlede nmRNA omprogrammering cocktail ved stuetemperatur derefter placere dem i is.Der tilsættes 234,6 mikroliter reduceret serummedium til hver aliquot, pipetteres forsigtigt tre til fem gange, og hver af dem mærkes som rør A.Label fem sterile RNasefrie 0,5 milliliterrør som rør B og bland seks mikroliter af syntetisk lille forstyrrende RNA-transinfektionsreagens med 244 mikroliter reduceret serummedium. Brug derefter pipetter til at tilføje indholdet af hvert rør B til et rør A dråbe klogt. Bland ved at trykke på bunden af røret.Inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter dette, at tilføje 125 mikroliter af nmRNA transfection kompleks opløsning fra hver af de fem aliquots til hver brønd, vippe pladen og pipette dråbe klogt ind i mediet. Bland indholdet i de 20 brønde ved at rokke forsigtigt.Brug de resterende fire brønde som reference. Inkuber pladen i 15 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den næste dag, aspirere mediet.Gentag transfektionsproceduren, som på dag ét, hver dag i yderligere tre dage. På dag fem, aspirere mediet og udveksle med frisk, forvardt XF / FF Kultur Medium under en steril hætte. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Monitorer cellekulturen dagligt af et fasekontrastmikroskop, indtil dannelsen af IPSC-kolonier observeres. Formålet med denne protokol var at omprogrammere dermale fibroblaster isoleret fra abdominal hud ved hjælp af ikke-integrerende omprogrammeringsmetode. Human fibroblaster voksede fra prøver af abdominal hud inden for en uge af kultur og nåede 85% sammenløb inden for to uger.Celler var karakteriseret ved klæbende vækst på plast kultur retter, og deres morfologi varierede fra aflange og spindel-formet til fladtrykt og stjerneformet. Fibroblast morfologi og arrangement og kultur dramatisk ændret efter såning på BMM, når de har erhvervet en aflang morfologi og arrangeret til at danne tynde forgrenede strukturer. Små kolonier var allerede synlige i kulturen på dag ét fra første transfektion og deres størrelse voksede gradvist over tid, mens deres antal steg til dag syv og derefter forblev stabilt mellem dag syv og dag 14, sandsynligvis som følge af mindre kolonier fusionerer til at danne større kolonier.Da omprogrammeringsproceduren blev udført med antibiotikafrie medier, blev mikrobiel kontaminering et stort problem i tilfælde, hvor sterile forhold ikke var garanteret. Spredningshastigheden og platingtætheden påvirker omprogrammeringseffektiviteten, så det er vigtigt at planlægge cellepassagering og definere belægningsgraden på grundlag af celleprolifererende sats. Denne protokol erstatter dyrebaserede reagenser med passende xenofrie reagenser og gør det muligt at omprogrammere voksne humane fibroblaster til IPS-celler i et komplet xenofrit kulturmiljø, der ikke var deres kliniske anvendelse.Humane celler er en potentiel kilde til infektion med blodbårne patogener, derfor bør personlige værnemidler bæres under hele proceduren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Udvikling, Expansion, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

En forbedret metode til forberedelse af type I kollagen fra hud

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv Generation og redigering af Feeder-gratis IPSCs fra pancreas celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalerbar generation af modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidet differentiering af modne nyre podocytter fra menneskeskabte pluripotente stamceller under kemisk definerede forhold

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kultur metode til at opretholde hvilende humane hæmatopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Generation af selvsamlede vaskulære menneskelige hudækvivalenter

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...