Name: isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

למחברים אין ותודות.

הדגימות מרקמת האדם נאספו על פי הצהרת הלסינקי תוך התבוננות בבית החולים האוניברסיטאי פדריקו II הנחיות. כל המטופלים המעורבים במחקר זה סיפק הסכמה בכתב.
1. הכנת אספקה ומדיית תרבות
<ol><li>נקי ומאוטוקלב זוג אחד גדול של מספריים כירורגית, שתי סטים של מלקחיים עדינים, שני זוגות של מספריי?...

<ol>
	<li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research.">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li><li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency:+what+will+become+of+embryonic+stem+cells.">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases.">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+(ipsc)+based+therapeutics.">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li><li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Cell+Reprogramming:+Methods+and+Applications.">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li><li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation.">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li><li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion.">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li><li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choices+for+Induction+of+Pluripotency:+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies.">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li><li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells:+implications+in+cell-based+regenerative+medicine.">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells.">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells.">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts.">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li><li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins.">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li><li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency.">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells.">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation,+stemness,+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li><li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development.">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li><li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells.">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li></ol>

iPSCs הם מתעוררים במהירות כמו המועמד התא המבטיח ביותר עבור יישומים רפואה רגנרטיבית וככלי מאוד שימושי עבור דוגמנות מחלות ובדיקות סמים3,8. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הדור של iPSCs אנושי ממדגם בעל גודל של ניקוב עור ביופסיה עם הליך פשוט ויעיל שאינו דורש שום ציוד ספצ...

תכנות התא מייצג טכנולוגיה חדשנית להפוך כל תא הסומטיים של הגוף לתוך תא גזע pluripotent המכונה iPSC1. האפשרות לתיכנות מחודש של תא סומטיים למבוגרים בחזרה למצב pluripotent מובחן יש להתגבר על המגבלות המוטלות על ידי זמינות העניים וסוגיות אתיות הקשורות לשימוש בתאי pluriפוטנטי, בעבר רק ללעג של עוברי אדם (תאי גזע עובריים או ESC)2,3,4. בשנת 2006, Kazutoshi טקהאשי ושינייה יאמאנאקה ערכו מחקר חלוצי השגת ההמרה הראשונה של תאים סומטיים בוגרים מהעור לתאים בעלי עוצמה מלאכותית על ידי הוספת ארבעה גנים ספציפיים (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. שנה לאחר מכן, העבודה שנערכה במעבדה של תומסון הובילה לתכנות מחדש של תאים סומטיים לתוך iPSCs על ידי התמרה של שילוב שונה של ארבעה גנים (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSCs מציעים מספר הזדמנויות למדענים וחוקרים של תחומים שונים, כגון רפואה רגנרטיבית ופרמקולוגיה, להיות פלטפורמה מצוינת ללמוד ולטפל במחלות שונות יחד עם השתקפות genotypic של המאפיינים של המטופל שהם נגזר. השימוש ב iPSCs מספק מספר יתרונות כולל: סיכון מופחת לתגובה חיסונית בשל מקור אוטוולוגי לחלוטין של תאים; האפשרות של יצירת ספריית תאים, כלי חשוב כדי לנבא את התגובה לתרופות חדשות ואת תופעות הלוואי שלהם, כפי שהם מסוגלים ברציפות לחדש את עצמי וליצור סוגי תאים שונים; וההזדמנות לפתח גישה מותאמת אישית. למנהל התרופות7,8,9
טכניקות מגוונות ידועות כיום, כדי לגרום לביטוי של גורמי תכנות משנה והם נכללים בשתי קטגוריות עיקריות: שיטות וקטוריות שאינן ויראליות ונגיפי10,11,12,13. שיטות שאינן ויראליות כוללות העברה של mrna, זיהום/העברה, העברה, מיני וקטורים ו אפיזומיום ואקזומים10,11,12,13. שיטות המבוססות על ויראלי כוללות וירוסים שאינם משתלבים, כגון אדנווירוס, וירוס סנדאי וחלבונים, ושילוב וירוסים כמו רטרווירוס ו-וירוס10,11,12,13.
לדברי מספר מחקרים, אין הבדלים משמעותיים הבחין בין שיטות אלה במונחים של יעילות של תא מתיכנות מראש, ומכאן, הבחירה של השיטה המתאימה תלוי לחלוטין בסוג התא המשמש וביישומים הבאים של iPSCs שהתקבלו14,15. כל השיטות שהוזכרו להראות חסרונות, למשל, וירוס סנדאי הוא יעיל בכל סוגי התאים, אבל דורש הרבה מעברים כדי להשיג iPSCs; מתכנות מראש על ידי אפיזומים מצוין עבור תאי דם, אבל צריך שינוי של תנאי התרבות הסטנדרטיים לפיברופיצוצים; השיטה מסוגלת לייצג חלופה אטרקטיבית אך מחקרים בתאי האדם עדיין מוגבלים וחלשים10,11,12,13. אקסוזומים הם ננו-שלפוחית פיזיולוגית המופרש לתוך נוזלי הגוף בתאים. לפי המחקרים האחרונים, הם אחראים לתקשורת בין-תאית ויכולים להיות בעלי תפקיד בתהליכים ביולוגיים חשובים, כגון הפצת תאים, הגירה ובידול. אקסוזומים יכול להעביר ולהעביר mRNA ו miRNA לתאי הנמען עם מנגנון טבעי לחלוטין, כפי שהם חולקים את הרכב זהה של קרום התא16. לכן, האקסוזומים היא טכניקת הדור החדש והמבטיח לתכנות, אך הפוטנציאל שלהם לתכנות מיתכנת תאים סומטיים על-ידי תוכנם עדיין נמצא בחקירה. ויראלי וקטורים מבוססי שיטות להשתמש וירוסים שונה כדי להעביר גנים מתיכנות לתאי הנמען. טכניקה זו, למרות היעילות הגבוהה של תכנות מראש, אינו נחשב בטוח, כמו שילוב של הנגיף בתוך התא יכול להיות אחראי על זיהום, teratomas ויציבות גנומית17.
הפרוטוקול הבא כדי לייצר מושבות iPSCs משלבת את הקוקטייל התכנות של יאמאנאקה ו תומפסון והוא מבוסס על השימוש בשיטה הדורשת NM-RNAs וגורמי התחמקות החיסונית עם האפשרות לבצע את זה בתנאי xeno-חינם. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא להתפשט, בתוך הקהילה המדעית, פרוטוקול המאפשר תכנות מהיר, פשוט, יעיל מאוד של העור האנושי מפני הבטן לתוך iPSCs18.
היתרונות של השיטה המוצעת הם, למעשה, את קלות הביצועים ואת הזמן הקצר הדרוש כדי להשיג iPSCs. יתרה מזאת, השיטה נמנעת ממנגנוני הגנה סלולאריים והשימוש בווקטורים ויראליות, האחראים לסוגיות רלוונטיות.
ביחס לפרוטוקול הסטנדרטי, נעשו השינויים הבאים: (1) פיברולזציה שוטפת סונכרנו במעבר 4 על ידי הצבת ב 0.1% סרום עבור 48 h לפני הטריסינוניזציה; (2) הצפיפות התאית לתרבות ולנפח של ריאגנטים הותאמו לניצול על צלחת מרובת היטב של 24 שעות במקום צלחת של 6 היטב; (3) ניסוי תכנות מחודש בוצע באמצעות אינקובטור 5% CO2 במקום אינקובטור עם אטמוספרית (21% o2) או ארוי (5% o2) תנאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td>Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>F9665-500ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H1387-1L</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>13778-030</td>
			<td>Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, store at -20 &#176;C. Avoid multiple freeze-thaws.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1116</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Culture Medium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A-500ml</td>
			<td>Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 &#176;C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 &#176;C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062-100ml</td>
			<td>Reduced-Serum Medium; store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4333-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P5665</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 0.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030124537</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030120086</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Cleaning agent for removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>00-0076</td>
			<td>Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method

כתוצאה מפגיעה בתאי גזע (iPSCs) יכולה להיחשב, עד היום, מקור מבטיח של תאים בעלי עוצמה לניהול המחלות הבלתי ניתן לטיפול כרגע, עבור החוקה והתחדשות של רקמות פצועות ולפיתוח תרופות חדשות. למרות כל היתרונות הנוגעים לשימוש ב-iPSCs, כגון הסיכון הנמוך של דחייה, הסוגיות האתיות ההפדלות, והאפשרות להשיג אותם מחולים צעירים וישנים ללא כל הבדל בפוטנציאל התכנות שלהם, בעיות להתגבר על הם עדיין רבים. למעשה, תא מתכנות שנערך עם ויראלי ושילוב וירוסים יכול לגרום לזיהומים המבוא של גנים נדרשים יכול לגרום לחוסר יציבות גנומית של תא הנמען, פגיעה בשימוש שלהם במרפאה. בפרט, יש חששות רבים לגבי השימוש ב-c-Myc גן, ידוע מספר מחקרים לפעילות מוטציה שלה ממריץ. פיברותקיעות התפתחה כאוכלוסיית התא המתאים לתיכנות מחודש של הסלולר כפי שהם קל לבודד את התרבות, הם נקצרו על ידי ניקוב העור פולשנית מינימלית. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תיאור מפורט צעד אחר צעד של ההליך כולו, מעיבוד לדוגמה כדי להשיג תרביות תאים, בחירת ריאגנטים ואספקה, ניקוי והכנה, לתא התיכנות מראש על ידי האמצעים של מסחרי ערכת הניתנת לתיכנות מבוססת RNAs (NM-RNAs) שאינה משתנה. הערכה הניתנת לתיכנות מראש מאפשר התכנות מראש יעיל של האדם העור פיברוהפיצוץ כדי iPSCs ומושבות קטנות ניתן לראות מוקדם ככל 24 h לאחר העברה הראשון, גם עם שינויים עם הכבוד לגליון הנתונים הרגיל. הליך התיכנות מחודש המשמש בפרוטוקול זה מציע את היתרון של בטוח תכנות מחודש, ללא הסיכון של זיהומים הנגרמים על ידי נגיפי שיטות וקטורים מבוססי, מפחית את מנגנוני ההגנה הסלולרית, ומאפשר את הדור של xeno iPSCs חינם, כל תכונות קריטיות הכרחיות עבור יישומים קליניים נוספים.

מטרת הפרוטוקול היתה לתכנת מראש את העור פיברותקיעות מבודדים מהעור הבטן באמצעות שיטה שאינה שילוב שיטת התכנות מבוסס NM-RNAs כדי לגרום לביטוי של גורמים ספציפיים. כדי להשיג מטרה זו, העור האדם פיברותקיעות היו מבודדים מתוך דגימות מהעור של חולים שעברו ניתוח טאק הבטן ו iPSCs נוצרו היכרות Oct4, Sox2, Klf4, cmyc, nan...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

הפרוטוקול הבא מספק הוראות ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אוטולוגיים הנגרמים על ידי בני אדם באמצעות תכנות מהיר ויעיל של פיברובלסטים עוריים אנושיים המבודדים מביופסיה של פונץ' בעור. ההליכים יכולים להתבצע על ידי חוקרים עם ניסיון מועט או ללא ניסיון בתכנות מחדש של תאים ועם התאמה נכונה, מאפשר את המוצר של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים ללא קסנו. תאי IPS אוטולוגיים עשויים לשמש עבור יישומי רפואה רגנרטיבית עבור מידול מחלות כמו הפרעות גנטיות או סרטן לחקור על מנגנונים מולקולריים הבסיסית ולפתח טיפולים ספציפיים יותר.עומס העבודה גבוה. זה מאוד מועיל ללמוד את הפרוטוקול לפני בזהירות לתכנן את הניסוי, כולל השלבים שבמהלכם reagents וחומרים צריך להיות מוכן. ההדגמה החזותית של ההליך מסייעת למחקרים עם ניסיון מועט או ללא ניסיון לבצע את בידוד התא ואת התכנות מחדש, תוך הימנעות מטעויות נפוצות הקשורות לזיהום מיקרוביאלי ו- RNA אפשרי.מתחת למכסה המנוע הסטרילי, שטפו את הדגימה הטרייה של עור אנושי מהבטן בצלחת של 100 מילימטר עם תות HPSS. הסר שיער ושומן באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים ול לנתח אותו עם אזמל כדי להשיג שברים בגודל של שני מילימטרים על ידי מילימטר אחד, הימנעות צלקות, אזורים מלוכלכים או שרופים של הרקמה. מניחים ארבעה שברים קטנים בכל צלחת 35 מילימטר, מכסים בזכוכית כיסוי סטרילית ומוסיפים 1.5 מילימטרים של I-DMEM.הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך כ 15 ימים או עד התאים להגיע 85% confluence. שנה את מדיום התרבות כל שלושה ימים ובדוק את הגידול של תאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך מדי יום. עכשיו, להרים את כוסות הכיסוי עם ממטרים עדין, למקם אותם במהופך בצלחת 100 מילימטר ולשטוף עם PBS סטרילי 1X.הסר את שברי הדגימות וזרוק אותם. לשטוף צלחות עם PBS סטרילי 1X. הסר את 1X PBS ולהוסיף שלושה מילימטרים של טריפסין-EDTA לכיסוי כוסות להציב בצלחת 100 מילימטר ולהוסיף מילימטר אחד של טריפסין-EDTA מנות 35 מילימטר גם כן.דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לחסום את טריפסיניזציה על ידי הוספת חמישה מילימטרים של TSS לצלחת 100 מילימטר ושני מילימטרים של TSS לכל צלחת 35 מילימטר. לאסוף את ההשעיה לתוך צינורות סטריליים 15 מילימטר, צנטריפוגה ב 400 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.שאף את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולה ב 12 מילימטרים של I-DMEM. לפצל את ההשעיה התא לשלושה aliquots מילימטר ולהעביר אותם כל אחד לתוך צלחת 60 מילימטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לשנות את המדיום מדי יום. שמור תאים בתרבות עד שהם מגיעים להתכנסות של 75%לאחר מכן, חזור על טריפסיניזציה שלוש פעמים כדי להשיג תאים שעברו ארבעה. לאחר מכן, לסנכרן את התאים על ידי החלפת I-DMEM עם S-DMEM ודגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.במהלך סנכרון התאים, הכינו את התרחבות פיברובלסט בינונית וקוקטייל תכנות מחדש של RNA שלא שונה עבור תכנות חופשי פיברובלסט. כדי לפשט את ההכנה של תשעת הצינורות של aliquots RNA לא שונה כי הם מחולקים לאחר מכן ל 36, נהגנו לעקוב אחר תוכנית שאנחנו מחוברים לקיר מכסה המנוע. מעיל צלחת 24 באר על ידי העברת 100 microliters של מטריצת קרום מרתף מופשר על קרח לכל באר כדי לכסות באופן אחיד את החלק התחתון.דגירה לפחות שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס לפני זריעת התאים. שאפו את המדיום מצלחות עם תאים בתרבות ושטפו במהירות ב-PBS 1X. חזור על טריפסיניזציה כדי להשיג תאים במעבר חמש.שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את גלולת הכדור בנפח מתאים של מדיום התרחבות פיברובלסט. מכינים ומנקים את ההמוציטומטר ב-70% אלכוהול. לאחר מכן, להכין פתרון על ידי ערבוב בעדינות 10 microliters של כחול טריפאן ו 10 microliters של השעיית תא בצינור 1.5 מיליליטר, ו דגירה במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.פיפטה 10 מיקרוליטרים של הפתרון לתוך ההמוציטומטר ומ מניחים אותו על הבמה של מיקרוסקופ ניגוד פאזה הפוך לספור. תאים שאינם בני קיימא הם כחולים בעוד תאים בני קיימא אינם נגועים. לספור את התאים לפחות שני ריבועים של תא hemocytometer.בצע דילול כדי לקבל צפיפות של 2.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים לכל 500 microliters של פיברובלסט התפשטות בינונית resuspend את גלולת התא. פיפטה 500 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת 24 באר. דגירה תאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.בבוקר, הסר את המדיום הישן מכל באר והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מדיום תרבות נטול פקטורים נטול קסנו. דגירה ב 37% מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני לפחות שש שעות. להפשיר חמישה 15.4 aliquots microliter של קוקטייל תכנות מחדש nmRNA הכולל בטמפרטורת החדר ואז למקם אותם בקרח.הוסף 234.6 microliters של מדיום סרום מופחת לכל aliquot, בעדינות פיפטה שלוש עד חמש פעמים ולתייג כל אחד כמו צינור A.Label חמישה צינורות סטריליים RNase 0.5 מיליליטר כמו צינור B ומערבבים שישה microliters של RNA קטן סינטטי מפריע RNA תמיר ריאגנט עם 244 microliters של מדיום סרום מופחת. לאחר מכן, השתמש פיפטים כדי להוסיף את התוכן של כל צינור B לצינור טיפה חכם. מערבבים על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, כדי להוסיף 125 microliters של פתרון מורכב transfection nmRNA מכל אחד מחמשת aliquots לכל באר, להטות את הצלחת ואת פיפטה טיפה חכם לתוך המדיום. מערבבים את התוכן ב 20 בארות על ידי נדנדה בעדינות.השתמש בארבע בארות הנותרות כהפניה. דגירה הצלחת במשך 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, שאף את המדיום.מתחת למכסה המנוע הסטרילי, חזור על הליך ההמרה, כמו ביום הראשון, כל יום במשך שלושה ימים נוספים. ביום החמישי, שאפו את המדיום והחליפו עם מדיום תרבות XF/FF טרי וחומם מראש מתחת למכסה המנוע הסטרילי. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.לפקח על תרבות התא מדי יום על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, עד התבוננות היווצרות מושבות IPSC. מטרת פרוטוקול זה הייתה לתכנת מחדש פיברובלסטים עוריים המבודדים מעור הבטן בשיטת תכנות מחדש שאינה משלבת. פיברובלסטים אנושיים יצאו מדגימות של עור בטן תוך שבוע מתרבות והגיעו ל-85% תוך שבועיים.התאים התאים התאפיינו בצמיחה דבקית על צלחות תרבות פלסטיק, והמורפולוגיה שלהם השתנתה ממוארכת בצורת ציר לשטח בצורת כוכב. מורפולוגיה Fibroblast וסידור ותרבות השתנו באופן דרמטי לאחר זריעה על BMM, כאשר הם רכשו מורפולוגיה מוארכת מסודרים כדי ליצור מבנים מסועפים דקים. מושבות קטנות כבר נראו בתרבות ביום הראשון מההתמזגות הראשונה וגודלן גדל בהדרגה עם הזמן, בעוד שמספרן גדל עד היום השביעי ולאחר מכן נותר יציב בין היום השביעי ליום ה-14, ככל הנראה כתוצאה מהתמזגות מושבות קטנות יותר כדי ליצור מושבות גדולות יותר.מאז הליך תכנות מחדש בוצע באמצעות מדיה ללא אנטיביוטיקה, במקרה שבו תנאים סטריליים לא הובטחו, זיהום מיקרוביאלי הפך לנושא מרכזי. שיעור ההתפשטות וצפיפות הציפוי משפיעים על יעילות התכנות מחדש, ולכן חשוב לתכנן את מעבר התאים ולהגדיר את צפיפות הציפוי על בסיס שיעור התפשטות התאים. פרוטוקול זה, המחליף ריאגנטים שמקורם בבעלי חיים בריאגנטים מתאימים נטולי קסנו, מאפשר תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים בוגרים לתאי IPS בסביבה תרבותית שלמה נטולת קסנו שלא היו השימוש הקליני שלהם.תאים אנושיים הם מקור פוטנציאלי של זיהום עם פתוגנים המועברים בדם, ומכאן, ציוד מגן אישי צריך להיות משוחק לאורך כל ההליך.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

ייצור, סינון בתפוקה גבוהה וביו-בנקאות של ספרואידים לבביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...