Name: isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00
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著者には謝辞がない。

ヒト組織からの標本は、大学病院フェデリコIIガイドラインを観察しながら、ヘルシンキ宣言に従って収集された。この研究に関与するすべての患者は書面による同意を提供した。
1. 物資・文化メディアの準備
<ol><li>1組の大きな外科用ハサミ、2組の細かい鉗子、2組の微小分離ハサミ、1L滅菌ボトル、500 mL滅菌ボトル、250mL滅菌ボトルを清潔でオートクレーブします。</l...

<ol>
	<li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research.">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li><li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li><li>Singh, V. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts.">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li><li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins.">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li><li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency.">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells.">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation,+stemness,+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li><li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development.">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li><li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells.">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li></ol>

iPSCは、再生医療用途の最も有望な細胞候補として、また疾患モデリングおよび薬物検査のための非常に有用なツールとして急速に出現しています3,8.ここで提示されるプロトコルは、特定の機器やリプログラミング技術の経験を必要としないシンプルで効率的な手順で、スキンパンチ生検のサイズを持つサンプルからのヒトiPSCの生成について説明?...

細胞リプログラミングは、体のすべての体細胞をiPSC1として知られる多能性幹細胞に変換する新しい技術を表しています。成人体細胞を多能性および未分化状態に再プログラミングする可能性は、多能性細胞の使用に関連する利用可能性と倫理的問題によって課される限界を克服し、以前はヒト胚(胚性幹細胞またはESC)2、3、4からしか導出できなかった。2006年、高橋和俊と山中伸弥は、4つの特定の遺伝子を人工的に加えることで、成人の体細胞を皮膚から多能性細胞に初めて変換する先駆的な研究を行った(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5.1年後、トムソンの研究室で行われた作業は、4つの遺伝子の異なる組み合わせ(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28)6の異なる組み合わせの伝達によって、体細胞をiPSCに再プログラミングすることに成功しました。
iPSCは、再生医療や薬理学など、さまざまな分野の科学者や研究者に多くの機会を提供し、異なる疾患を研究し、それらが由来する患者の特性のゲノム反射と共に治療するための優れたプラットフォームです。iPSCの使用は、細胞の完全に自家起源による免疫応答のリスクの低減を含むいくつかの利点を提供します。彼らは継続的に自己更新し、異なる細胞タイプを生成することができるので、新薬とその副作用への応答を予測するための重要なツール、細胞ライブラリを作成する可能性;薬物投与のためのカスタマイズされたアプローチを開発する機会7,8,9.
現在、多様な技術が知られており、リプログラミング因子の発現を誘導し、それらは2つの主要なカテゴリーに含まれている:非ウイルスおよびウイルスベクターベースの方法10、11、12、13。非ウイルス法は、mRNAトランスフェクション、miRNA感染/トランスフェクション、ピギーバク、ミニサークルベクターおよびエピソソームプラスミドおよびエキソソーム10、11、12、13を含む。ウイルスベースの方法は、アデノウイルス、センダイウイルスおよびタンパク質などの非統合ウイルス、およびレトロウイルスおよびレンチウイルス10、11、12、13のようなウイルスを統合する。
いくつかの研究によれば、細胞リプログラミングの有効性の点でこれらの方法の間で有意な差は見られなっていないが、したがって、適切な方法の選択は、使用される細胞タイプおよび得られたiPSCの後続の用途に厳密に依存する。前述のすべての方法は、例えば、センダイウイルスはすべての細胞タイプに有効であるが、iPSCを得るために多くの通路を必要とする欠点を示しています。エピソームによるリプログラミングは、血液細胞にとって優れていますが、線維芽細胞の標準的な培養条件の変更が必要です。PiggyBac法は魅力的な代替手段を表す可能性がありますが、ヒト細胞の研究はまだ限られており、弱い10、11、12、13.エキソソームは、細胞によってすべての体液に生理学的に分泌されるナノ小胞である。最近の研究によると、彼らは細胞間通信を担当し、細胞の増殖、移行、分化などの重要な生物学的プロセスに役割を持つことができます。エキソソームは、細胞膜16の同じ組成を共有するので、完全に自然なメカニズムを有するレシピエント細胞にmRNAおよびmiRNAを輸送および伝達することができる。したがって、エキソソームはリプログラミングのための有望な新世代技術ですが、その内容によって体細胞を再プログラムする可能性はまだ調査中です。ウイルスベクターベースの方法は、レシピエント細胞にリプログラミング遺伝子を伝えるために改変されたウイルスを使用します。この技術は、リプログラミングの高効率にもかかわらず、細胞内のウイルスの統合が感染、奇形腫およびゲノム不安定性17を引き起こし得るとして、安全であるとは考えられていない。
iPSCコロニーを生成する次のプロトコルは、山中とトンプソンのリプログラミングカクテルを組み合わせ、NM-RNAと免疫回避因子を必要とする方法の使用に基づいており、ゼノフリー条件でそれを実行する可能性があります。この方法の使用の背後にある根拠は、科学界内で、腹部皮膚からiPSC18への成人ヒト線維芽細胞の迅速かつシンプルかつ非常に効果的なリプログラミングを可能にするプロトコルを広めることである。
提案された方法の強みは、実際には、性能の容易さとiPSCの取得に要する短い時間です。さらに、この方法は、細胞の防御メカニズムとウイルスベクターの使用を回避し、関連する問題を担当します。
標準プロトコルに関しては、以下の改変が行われました:(1)コンフルエント線維芽細胞は、トリプシン化の前に48時間0.1%の血清に配置することによって通路4で同期しました。(2)培養用の細胞密度と試薬の体積は、6ウェルプレートの代わりに24ウェルマルチウェルプレート上の利用のために調整した。(3)リプログラミング実験は、大気(21%O2)または低酸素(5%O2)条件のインキュベーターの代わりに5%CO2インキュベーターを用いて行った。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td>Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>F9665-500ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H1387-1L</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>13778-030</td>
			<td>Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, store at -20 &#176;C. Avoid multiple freeze-thaws.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1116</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Culture Medium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A-500ml</td>
			<td>Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 &#176;C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 &#176;C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062-100ml</td>
			<td>Reduced-Serum Medium; store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4333-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P5665</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 0.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030124537</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030120086</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Cleaning agent for removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>00-0076</td>
			<td>Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method

人工多能性幹細胞(iPSC)は、現在治療不可能な疾患の管理、傷ついた組織の再構成と再生、および新薬の開発のための多能性細胞の有望な供給源と考えることができる。拒絶反応のリスクが低い、倫理的な問題が減り、再プログラミングの可能性に違いもなく老若男女両方の患者からそれらを得る可能性など、iPSCの使用に関連するすべての利点にもかかわらず、克服すべき問題まだ数多くあります。実際、ウイルスと統合ウイルスで行われる細胞リプログラミングは感染症を引き起こし、必要な遺伝子の導入はレシピエント細胞のゲノム不安定性を誘発し、クリニックでの使用を損なう可能性があります。特に、c-Myc遺伝子の使用に関する多くの懸念があり、その突然変異誘導活性に関するいくつかの研究からよく知られている。線維芽細胞は、細胞リプログラミングに適した細胞集団として出現し、分離や培養が容易であり、低侵襲の皮膚パンチ生検によって収穫される。ここで説明するプロトコルは、サンプル処理から細胞培養物を得るためのサンプル処理から、試薬や供給品の選択、洗浄と調製、商業的な手段による細胞リプログラミングまで、手順全体の詳細なステップバイステップの説明を提供します。非変更 RNA (NM-RNA) ベースのリプログラミング キット。選択されたリプログラミングキットは、iPSCおよび小さなコロニーへのヒト真皮線維芽細胞の効果的なリプログラミングを可能にし、標準的なデータシートに関する変更を加えても、最初のトランスフェクションの後に早くも24時間見ることができます。このプロトコルで使用されるリプログラミング手順は、ウイルスベクターベースの方法によって引き起こされる感染のリスクなしに、安全なリプログラミングの利点を提供し、細胞の防御メカニズムを低減し、ゼノフリーiPSCの生成を可能にします。さらなる臨床適用のために必須である重要な特徴。

このプロトコルの目的は、NM-RNAに基づく非統合リプログラミング法を用いて腹部皮膚から分離された皮膚線維芽細胞を再プログラムし、特定の因子の発現を誘導することであった。この目標を達成するために、ヒト皮膚線維芽細胞をおなかのタック手術を受けた患者の皮膚標本から単離し、iPSCはOct4、Sox2、Klf4、cMyc、ナノグ、Lin28リプログラミング因子およびE3、K3、B18免疫回避因子を導入し?...

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Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

以下のプロトコルは、皮膚パンチ生検から分離されたヒト真皮線維芽細胞の迅速かつ効率的な再プログラミングを通じて、自家のヒト誘発多能性幹細胞を生成するための指示を提供する。この手順は、細胞リプログラミングの経験がほとんどまたはまったくない研究者によって行われ、適切な調整を行うことで、異種フリーの人工多能性幹細胞の生成を可能にする。自己IPS細胞は、再生医療の応用や遺伝性疾患や癌などの疾患をモデル化して、基礎となる分子メカニズムを調査し、より具体的な治療法を開発するために使用される可能性があります。ワークロードが高い。試薬や材料を準備するステップを含め、実験を慎重に計画する前にプロトコルを研究することは非常に有用です。この手順の視覚的なデモンストレーションは、ほとんどまたはまったく経験のない研究が細胞の単離および再プログラミングを行うのに役立ち、微生物およびRNA汚染の可能性に関連する一般的な間違いを避ける。無菌フードの下で、取得した人間の皮膚のサンプルを100ミリメートル皿にHPSS溶液で洗浄します。細かい鉗子とはさみを使って毛髪や脂肪を取り除き、メスで解剖して2ミリメートルの大きさの断片を1ミリメートルずつ解剖し、瘢痕、汚れた領域、または組織の焼けた部分を避ける。各35ミリメートル皿に4つの小さな断片を置き、無菌カバーガラスで覆い、1.5ミリメートルのI-DMEMを加えます。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を約15日間、または細胞が85%合流するまでインキュベートします。培養液を3日ごとに変更し、逆相対照顕微鏡を使用して細胞の成長を毎日確認します。さて、カバーグラスを細かい鉗子で持ち上げ、100ミリメートル皿に逆さまにして1X滅菌PBSで洗います。サンプルのフラグメントを削除し、破棄します。1X滅菌PBSでプレートを洗浄します。1X PBSを取り外し、100ミリメートル皿に入れたカバーグラスに3ミリメートルのトリプシンEDTAを加え、35ミリメートルの皿にもトリプシンEDTAの1ミリメートルを加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、100ミリメートル皿に5ミリメートルのTSSを加え、TSSを2ミリメートルずつ35ミリメートル皿に加えてトリプシン化をブロックします。サスペンションを15ミリメートルの無菌チューブに集め、遠心分離機を摂氏4度で400倍に5分間回収します。上清を吸引し、I-DMEMの12ミリメートルでペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を3ミリメートルのアリコートに分割し、それぞれ60ミリメートルのプレートに移します。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。毎日メディアを変更します。培養中の細胞を75%の合流点に達するまで、トリプシン化を3回繰り返して、その通過4の細胞を得る。次に、I-DMEMをS-DMEMに置き換えて細胞を同期させ、摂氏37度で48時間インキュベートし、5%の二酸化炭素を使用します。細胞同期中に、線維芽細胞の増殖媒体および線維芽細胞の自由なプログラミングのための総非修飾RNAリプログラミングのカクテルを準備する。36に分割された非修飾RNAアリコートの9つのチューブの調製を簡素化するために、我々はフードの壁に取り付けたスキームに従うために使用しました。氷上で解凍した基底膜マトリックス100マイクロリットルを各ウェルに移して底を均一に覆い、24ウェルプレートをコーティングします。細胞を播種する前に摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートする。培養中の細胞を用いたプレートから培地を吸引し、1X PBSで素早く洗浄する。トリプシン化を繰り返して、その通過5個の細胞を得る。上清を吸引し、適切な量の線維芽細胞拡張培地でペレットを再懸濁する。70%アルコールでヘモサイトメーターを準備し、きれいにします。次に、10マイクロリットルのトリパンブルーと10マイクロリットルの細胞懸濁液を1.5ミリリットルチューブに軽く混合して溶液を調製し、室温で1~2分間インキュベートします。ピペット10マイクロリットルの溶液をヘモサイトメーターに入れ、逆相対照顕微鏡のステージに置いて数える。生存不可能な細胞は青であり、生存細胞は染色されない。ヘモサイトメーターチャンバーの少なくとも2つの正方形の細胞を数える。希釈を行い、線維芽細胞拡張培地の500マイクロリットル当たり4番目の細胞に2.5倍の10倍の密度を得て、細胞ペレットを再懸濁する。ピペット500マイクロリットルの細胞懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに入した。細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩インキュベートする。朝、各ウェルから古い培地を取り出し、500マイクロリットルのプレzアームドキセノフリーの因子フリー培地に置き換えます。5%の二酸化炭素の下で37%の摂氏で少なくとも6時間インキュベートする。室温でカクテルを再プログラミングする全nmRNAの5つの15.4マイクロリットルのアリコートを解凍し、氷の中に入れる。各アリコートに234.6マイクロリットルの減らされた血清培地を加え、3〜5回ピペットを軽くし、チューブA.ラベル5つの無菌RNase-free 0.5ミリリットルチューブとしてラベルを付け、6マイクロリットルの合成小干渉RNAトランスフェクション試薬を244マイクロリットルの還元血清培地と混合します。次に、ピペットを使用して各チューブBの内容物を管Aドロップワイズに添加する。チューブの底部をタップして混ぜます。室温で15分間インキュベートします。その後、5つのアリコートのそれぞれから各ウェルにnmRNAトランスフェクション複合体溶液の125マイクロリットルを加え、プレートを傾け、ピペットは媒体に下降する。20個の井戸の中身を軽く揺らすことで混ぜます。残りの4つのウェルを参照として使用します。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%で15時間インキュベートします。翌日、培地を吸引する。無菌フードの下で、1日目のように、さらに3日間毎日トランスフェクション手順を繰り返します。5日目に、培地を吸引し、無菌フードの下で新鮮な、事前に温めたXF / FF培養培地と交換します。プレートを摂氏37度と炭酸ガス5%でインキュベートします。細胞培養を位相コントラスト顕微鏡で毎日監視し、IPSCコロニーの形成を観察するまで観察する。このプロトコルの目的は、非統合型リプログラミング法を用いて、腹部皮膚から分離された真皮線維芽細胞を再プログラムすることであった。ヒト線維芽細胞は、培養後1週間以内に腹腔皮膚のサンプルから成長し、2週間以内に85%の合流に達した。細胞はプラスチック培養皿に接着性を持ち、その形態は細長く紡錘状から平らで星形までさまざまであった。線維芽細胞の形態と配置と培養は、BMMに播種した後、細長い形態を獲得し、細い分岐構造を形成するように配置した後に劇的に変化した。小さなコロニーは、最初のトランスフェクションから1日目にすでに文化に見え、その大きさは時間の経過とともに徐々に増加し、その数は7日目から14日目の間に安定したままであった。抗生物質を含まない培地を用いてリプログラミングを行ったため、無菌状態が保証されない場合には、微生物汚染が大きな問題となった。増殖速度とめっき密度はリプログラミング効率に影響を与えるため、細胞通過を計画し、細胞増殖率に基づいてめっき密度を定義することが重要です。動物由来の試薬を適切な異種フリー試薬に置き換えるこのプロトコルは、成人ヒト線維芽細胞を臨床使用しなかった完全な異種非培養環境でIPS細胞に再プログラミングすることを可能にする。ヒト細胞は血液媒介病原体の感染源となる可能性があるため、処置を通して個人保護具を着用すべきである。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

皮膚からのI型コラーゲンの調製のための改良された方法

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...