Name: isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

저자는 인정이 없습니다.

인간 조직에서 견본은 대학 병원 페데리코 II 지침을 관찰하는 동안 헬싱키의 선언에 따라 수집되었다. 이 연구에 관여하는 모든 환자는 서면 동의를 제공했습니다.
1. 보급품 및 문화 미디어 준비
<ol><li>수술용 가위 1쌍, 미세 집게 2세트, 미세 한 두 쌍, 미세 분절 가위 2쌍, 멸균 병 1개, 500mL 멸균 병, 250mL 멸균 병.</li>
	<li>100mm 플레이트, 60mm 플레이트, 35mm 플레이트, 일회용 메?...

<ol>
	<li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research.">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li><li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency:+what+will+become+of+embryonic+stem+cells.">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases.">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+(ipsc)+based+therapeutics.">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li><li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Cell+Reprogramming:+Methods+and+Applications.">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li><li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation.">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li><li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion.">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li><li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choices+for+Induction+of+Pluripotency:+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies.">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li><li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells:+implications+in+cell-based+regenerative+medicine.">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells.">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells.">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts.">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li><li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins.">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li><li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency.">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells.">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation,+stemness,+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li><li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development.">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li><li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells.">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li></ol>

iPSCs는 재생 의학 응용 분야에서 가장 유망한 세포 후보로 빠르게 부상하고 있으며 질병 모델링 및 약물검사를위한대단히 유용한 도구로3,8. 여기에 제시된 프로토콜은 특정 장비 또는 리프로그래밍 기술에 대한 이전의 경험이 필요하지 않은 간단하고 효율적인 절차로 피부 펀치 생검의 크기를 갖는 샘플로부터 인간 iPSCs의 생성을 설명합니다.
<p class...

세포 재프로그래밍은 iPSC1로알려져 있는 다능성 줄기 세포로 바디의 모든 체세포 세포를 변환하는 새로운 기술을 나타냅니다. 성인 체세포세포를 다능성 및 미분화 상태로 다시 재프로그래밍할 가능성은 다능성 세포의 사용과 관련된 빈약한 가용성 및 윤리적 문제에 의해 부과된 한계를 극복하였으며, 이전에는 인간 배아(배아 줄기 세포 또는ESC)에서만유래할 수 있었다2,3,4. 2006년 다카하시 카즈토시와 야마나카 신야는 4개의 특정 유전자(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)를 인위적으로 추가하여 피부에서 다능성 세포로의성인 체세포가 최초로 변환되는 선구적인 연구를 수행했습니다 5. 1 년 후, 톰슨의 실험실에서 수행 된 작업은 4 개의 유전자 (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)의 다른 조합의 변환에 의해 iPSCs로 체세포의 성공적인 재프로그래밍으로 이어졌다6.
iPSCs는 재생 의학 및 약리학과 같은 다양한 분야의 과학자와 연구자에게 다양한 기회를 제공하며, 다른 질병을 연구하고 치료할 수 있는 훌륭한 플랫폼이며, 그(것)들이 파생되는 환자의 특성의 유전형 반사와 더불어. iPSCs의 사용은 다음과 같은 몇 가지 장점을 제공합니다 : 세포의 완전히 자가 기원으로 인한 면역 반응의 위험 감소; 세포 라이브러리를 생성할 수 있는 가능성, 새로운 약물과 그들의 부작용에 대 한 반응을 예측 하는 중요 한 도구, 그들은 지속적으로 자체 갱신 하 고 다른 세포 종류를 생성할 수 있습니다. 및 약물 투여를위한 맞춤형 접근 법을 개발할 수있는 기회7,8,9.
다양한 기술은 현재, 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하기 위해 알려져 있으며, 이들은 두 가지 주요 범주에 포함된다: 비바이러스 및 바이러스 벡터 기반 방법10,11,12,13. 비 바이러스성 방법은 mRNA 형질감염, miRNA 감염/형질감염, PiggyBac, 미니서클 벡터 및 에피솜 플라스미드 및 엑소좀10,11,12,13을포함한다. 바이러스 기반 방법은 아데노바이러스, 센다이 바이러스 및 단백질과 같은 비통합 바이러스를 포함하며, 레트로바이러스 및 렌티바이러스10,11,12,13과같은 바이러스를 통합한다.
여러 연구에 따르면, 세포 리프로그래밍의 효과성 측면에서 이러한 방법들 사이에서 유의한 차이가 발견되지 않았으며, 따라서 적합한 방법의 선택은 사용되는 세포 유형 및14,15를수득한 iPSCs의 후속 적용에 따라 엄격하게 의존한다. 언급된 모든 방법은 단점을 보여 준다, 예를 들어, 센다이 바이러스는 모든 세포 유형에 효과적이지만, iPSCs를 얻기 위해 많은 구절이 필요합니다; 에피솜에 의한 재프로그래밍은 혈액 세포에 우수하지만 섬유아세포에 대한 표준 배양 조건의 수정이 필요합니다. PiggyBac 방법은 매력적인 대안을 나타낼 수 있지만 인간 세포에 대한 연구는 여전히 제한적이며 약한10,11,12,13. 엑소좀은 나노 소포생리학적으로 세포에 의해 모든 체액으로 분비됩니다. 최근 연구에 따르면, 그들은 세포 간 통신에 대 한 책임 및 중요 한 생물학적 프로세스에 역할을 가질 수 있습니다., 세포 증식 등, 마이그레이션 및 분화. 엑소좀은세포막(16)의동일한 조성을 공유하기 때문에 완전히 자연적인 메커니즘을 가진 수용자 세포로 mRNA 및 miRNA를 수송하고 전달할 수 있다. 따라서, 엑소좀은 재프로그래밍을 위한 유망한 차세대 기술이지만, 그들의 내용에 의해 체세포세포를 재프로그래밍할 수 있는 잠재력은 아직 조사 중이다. 바이러스 벡터 기반 방법은 수신자 세포에 재프로그래밍 유전자를 전달하기 위해 수정 된 바이러스를 사용합니다. 이 기술은, 리프로그래밍의 높은 효율에도 불구하고, 세포 내의 바이러스의 통합이 감염, 기형종 및 게놈 불안정성을 담당할 수 있기 때문에 안전한 것으로 간주되지 않는다17.
iPSCs 콜로니를 생성하는 다음 프로토콜은 야마나카와 톰슨의 리프로그래밍 칵테일을 결합하고 NM-RNA 및 면역 회피 인자를 필요로하는 방법의 사용을 기반으로 합니다. 이 방법의 사용 뒤에 근거는iPSCs18로복부 피부에서 성인 인간 섬유아세포의 신속하고, 간단하고 매우 효과적인 재프로그래밍을 허용하는 프로토콜, 과학 적인 지역 사회 내의 퍼지는 것입니다.
제안 된 방법의 강점은 사실, 성능의 용이성과 iPSC를 획득하는 데 필요한 짧은 시간입니다. 또한, 방법은 세포 방어 메커니즘 및 바이러스 벡터의 사용을 방지, 관련 문제에 대 한 책임.
표준 프로토콜에 대하여, 다음과 같은 변형이 이루어졌다: (1) 결합섬유아세포는 트립시네화 전에 48시간 동안 0.1% 혈청에 배치됨으로써 통로 4에서 동기화되었다; (2) 배양세포 밀도 및 시약의 부피는 6웰 플레이트 대신 24웰 멀티웰 플레이트의 활용도를 조정하였다; (3) 재프로그래밍 실험은 대기(21%O2) 또는 저산소(5%O2)조건을 가진 인큐베이터 대신 5%CO2인큐베이터를 사용하여 수행하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td>Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>F9665-500ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H1387-1L</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>13778-030</td>
			<td>Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, store at -20 &#176;C. Avoid multiple freeze-thaws.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1116</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Culture Medium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A-500ml</td>
			<td>Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 &#176;C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 &#176;C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062-100ml</td>
			<td>Reduced-Serum Medium; store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4333-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P5665</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 0.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030124537</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030120086</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Cleaning agent for removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>00-0076</td>
			<td>Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method

유도 된 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 현재까지 현재 치료 할 수없는 질병의 관리, 부상당한 조직의 재구성 및 재생 및 신약 개발을위한 다능성 세포의 유망한 공급원으로 간주 될 수 있습니다. 거부의 낮은 위험, 감소 된 윤리적 문제 및 재프로그래밍 잠재력의 차이없이 젊은 환자와 노인 환자 모두에서 얻을 수있는 가능성과 같은 iPSCs의 사용과 관련된 모든 장점에도 불구하고, 극복해야 할 문제 여전히 많다. 실제로, 바이러스 및 통합 바이러스로 행해진 세포 재프로그래밍은 감염을 일으킬 수 있고 필요한 유전자의 도입은 수용자 세포의 게놈 불안정성을 유도하여 클리닉에서의 사용을 손상시킬 수 있다. 특히, c-Myc 유전자의 사용에 대 한 많은 우려가 있다, 그것의 돌연변이 유도 활동에 대 한 여러 연구에서 잘 알려진. 섬유아세포는 세포 재프로그래밍에 적합한 세포 집단으로 나타났으며, 분리및 배양이 용이하고 최소 침습성 피부 펀치 생검에 의해 수확된다. 여기에 설명된 프로토콜은 시료 처리에서 세포 배양, 시약 및 소모품 선택, 세척 및 준비, 상업적 수단에 의한 세포 재프로그래밍에 이르기까지 전체 절차에 대한 상세한 단계별 설명을 제공합니다. 수정되지 않은 RNA(NM-RNAs) 기반 리프로그래밍 키트. 선택된 리프로그래밍 키트는 iPSCs및 작은 콜로니에 인간 진피 섬유아세포의 효과적인 재프로그래밍을 허용하고 작은 콜로니는 표준 데이터 시트에 대하여 수정되더라도, 첫번째 형질전환 후에 24 시간 일찍 보일 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 재프로그래밍 절차는 바이러스 벡터 기반 방법으로 인한 감염의 위험없이 안전한 재프로그래밍의 이점을 제공하고 세포 방어 메커니즘을 감소시키며 xeno-free iPSC의 생성을 허용합니다. 추가 임상 응용을 위해 필수인 중요한 기능.

프로토콜의 목적은 NM-RNA에 기초한 비통합 재프로그래밍 방법을 사용하여 복부 피부로부터 분리된 진피 섬유아세포를 재프로그래밍하여 특정 인자의 발현을 유도하는 것이었다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간 진피 섬유아세포는 배턱 수술을 받은 환자의 피부 표본으로부터 분리되었고 iPSCs는 NM-RNA 및 마이크로RNA 기술을 결합한 상업적 기성 용 재프로그래밍 키트에 의해 Oct4, Sox2, Klf4, CMyc, Nan...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

다음 프로토콜은 피부 펀치 생검으로부터 분리된 인간 진피 섬유아세포의 빠르고 효율적인 재프로그래밍을 통해 자가 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 지침을 제공합니다. 절차는 세포 재프로그래밍에 있는 거의 또는 전혀 경험이 없는 연구원에 의해 수행될 수 있고 적당한 조정으로, xeno 자유로운 유도한 만능 줄기 세포의 제품을 허용합니다. 자가 IPS 세포는 재생 의학 응용 프로그램을 위해 그리고 근본적인 분자 기계장치에 조사하고 더 특정 한 치료를 개발하기 위하여 유전 무질서 또는 암 같이 질병을 모델링하기 위하여 이용될 수 있습니다.워크로드가 높습니다. 시약 및 재료가 준비되어야하는 단계를 포함하여 실험을 신중하게 계획하기 전에 프로토콜을 연구하는 것이 매우 유용합니다. 절차의 시각적 데모는 거의 또는 전혀 경험이없는 연구가 가능한 미생물 및 RNA 오염과 관련된 일반적인 실수를 피하면서 세포 격리 및 재프로그래밍을 수행하는 데 도움이됩니다.멸균 후드 아래에서 HPSS 용액으로 100mm 접시에 복부에서 갓 얻은 인간의 피부 샘플을 씻어 내보라고 합니다. 미세 한 집게와 가위를 사용하여 머리와 지방을 제거하고 1 밀리미터에 의해 2 밀리미터크기의 조각을 얻기 위해 메스로 해부, 흉터를 피하기, 더러운 또는 조직의 연소 영역. 각 35mm 접시에 4개의 작은 조각을 놓고 멸균 커버 유리로 덮고 1.5밀리미터의 I-DMEM을 추가합니다.약 15일 동안 또는 세포가 85%에 도달할 때까지 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 배양 배지를 3일마다 변경하고 매일 반전된 상 대비 현미경을 사용하여 세포의 성장을 확인한다. 이제 커버 안경을 미세한 집게로 들어 올리고 100mm 접시에 거꾸로 놓고 멸균 PBS 1X로 씻어 내보실 수 있습니다.샘플의 조각을 제거하고 폐기합니다. 1X 멸균 PBS로 접시를 씻으시면 됩니다. 1X PBS를 제거하고 100mm 접시에 놓인 커버 안경에 트립신-EDTA 3밀리미터를 추가하고 트립신-EDTA 1mm를 35mm 요리에 추가합니다.이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 그런 다음 각 35mm 접시에 100밀리미터 접시에 5mm의 TSS와 2밀리미터의 TSS를 추가하여 트립시니화를 차단합니다. 서스펜션을 15mm 멸균 튜브로 모으고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 400배G로 수집합니다.상류체를 흡인하고 I-DMEM의 12 밀리미터에서 펠릿을 재놓습니다. 세포 현탁액을 3mm 알리쿼트로 분할하고 각각 60mm 플레이트로 옮기습니다. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다.매일 매체를 변경합니다. 그 후에 75%의 합류에 도달할 때까지 배양에 세포를 유지, 4를 통과하는 세포를 얻기 위하여 트립시화를 세 번 반복합니다. 그런 다음 I-DMEM을 S-DMEM으로 대체하여 세포를 동기화하고 37도에서 48시간 동안 이산화탄소를 5%로 배양합니다.세포 동기화 동안 섬유아세포 팽창 배지및 섬유아세포 무료 프로그래밍을 위한 총 비수정 RNA 리프로그래밍 칵테일을 준비합니다. 그 때 36으로 분할되는 비수정 RNA 알리쿼트의 9개의 튜브의 준비를 단순화하기 위하여, 우리는 우리가 후드 벽에 붙어 있는 계획을 따르기 위하여 이용했습니다. 24웰 플레이트를 얼음 위에 해동한 지하 멤브레인 매트릭스 100마이크로리터를 균일하게 바닥으로 덮어 줍니다.세포를 파종하기 전에 섭씨 37도에서 적어도 한 시간 동안 배양하십시오. 배양세포로 플레이트에서 배지를 흡인하고 1X PBS로 빠르게 세척합니다. 트립시니화를 반복하여 5를 통과하는 세포를 얻습니다.슈퍼나탈을 흡인시키고 섬유아세포 팽창 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재보종한다. 70%의 알코올로 혈종계를 준비하고 청소하십시오. 그런 다음 1.5 밀리리터 튜브에 트라이판 블루 10 마이크로리터와 셀 서스펜션 10 마이크로리터를 부드럽게 혼합하고 실온에서 1~2분 동안 배양하여 용액을 준비합니다.용액의 파이펫 10 마이크로리터는 용혈계로 들어가 서카운트하는 반전된 상 대비 현미경의 단계에 놓는다. 실행 가능한 세포가 얼룩지지 않는 동안 실행 불가능한 세포는 파란색입니다. 혈전계 챔버의 적어도 두 제곱에서 세포를 계산합니다.섬유아세포 팽창 배지의 500 마이크로리터당 제4 세포에 2.5배 10배의 밀도를 얻고 세포 펠릿을 재보종한다. 파이펫 500 마이크로리터는 24웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 넣습니다. 하룻밤 동안 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.아침에는 각 우물에서 오래된 매체를 제거하고 500 마이크로리터의 사전 zino-free 요인 없는 배양 매체로 대체하십시오. 최소 6시간 동안 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37%에서 배양합니다. 실온에서 총 nmRNA 리프로그래밍 칵테일의 5 15.4 마이크로 리터 알리 쿼트 다음 얼음에 배치.각 알리쿼트에 234.6 마이크로리터를 첨가하고, 3~5회 부드럽게 파이펫을 만들고, 튜브 A.Label 5개의 멸균 RNase-free 0.5 밀리리터 튜브로 라벨을 붙이고, 합성 소형 간섭 RNA 트랜스퍼시약 6개에 244마이크로리터의 감속미미를 혼합한다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 각 튜브 B의 내용을 튜브 A 드롭에 현명하게 추가합니다. 튜브의 바닥을 눌러 섞는다.실온에서 15분 동안 배양하세요. 그 후, 5개의 알리쿼트의 각에서 nmRNA 경질 복합용액125마이크로리터를 각각 양호하게, 플레이트와 파이펫 드롭을 배지로 현명하게 기울인다. 20 개의 우물에서 부드럽게 흔들어 내용내용을 섞습니다.나머지 4개의 우물을 참조로 사용합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 15시간 동안 배양합니다. 다음 날, 매체를 흡인.멸균 후드 아래에서, 3 일 동안 매일, 첫날과 같이, 형질 수술을 반복합니다. 5일째에는 중형을 흡기하고 멸균 후드 아래 신선한 사전 데워진 XF/FF 컬쳐 배지와 교환합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.IPSC 식민지의 형성을 관찰할 때까지, 위상 대비 현미경으로 매일 세포 배양을 모니터링합니다. 이 프로토콜의 목적은 비 통합 리프로그래밍 방법을 사용하여 복부 피부에서 분리 된 진피 섬유 아세포를 다시 프로그래밍하는 것이었습니다. 인간의 섬유아세포는 배양 1주일 이내에 복부 피부 샘플에서 자라서 2주 이내에 85%의 합류에 도달했습니다.세포는 플라스틱 배양 접시에 접착제 성장을 특징으로하고, 그들의 형태는 길쭉하고 스핀들 모양에서 평평하고 별 모양에 이르기까지 다양했다. 섬유아세포 형태와 배열 및 배양은 BMM에 시드후 극적으로 변경, 그들은 길쭉한 형태를 취득하고 얇은 분기 구조를 형성하도록 배열 할 때. 작은 식민지는 이미 첫 번째 트랜스펙트에서 첫날 에 문화에서 볼 수 있었고, 그 크기는 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가, 그 수는 7 일까지 증가하고 다음 하루 사이에 안정적으로 유지 14, 아마 더 큰 식민지를 형성하기 위해 병합 작은 식민지의 결과로.항생제 없는 매체를 사용하여 재프로그래밍 절차가 수행되었기 때문에 멸균 조건이 보장되지 않은 경우 미생물 오염이 주요 문제가 되었습니다. 증식율과 도금 밀도는 재프로그래밍 효율에 영향을 미치므로 세포 패시징을 계획하고 세포 증식율에 기초하여 도금 밀도를 정의하는 것이 중요합니다. 적절한 제노프리 시약을 위해 동물 유래 시약을 대체하는 이 프로토콜은 임상용이 아닌 완전한 제노없는 배양 환경에서 성인 인간 섬유아세포를 IPS 세포로 리프로그래밍할 수 있게 합니다.인간 세포는 혈액 성 병원균감염의 잠재적 인 소스, 따라서, 개인 보호 장비는 절차를 통해 착용해야합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

연구

생체공학

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

피부에서 타입 I 콜라겐의 제조를위한 개선 된 방법

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...