Name: isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Författarna har inga erkännanden.

Proverna från mänsklig vävnad samlades in enligt Helsingforsdeklarationen medan de observerade Federico II-riktlinjerna för University Hospital. Alla patienter som deltog i denna studie gav skriftligt medgivande.
1. beredning av förbrukningsmaterial och odlingsmedier
<ol><li>Rengör och autoklav ett stort par av kirurgisk sax, två uppsättningar av fina pinpett, två par microdissecting sax, 1 L steril flaska, 500 mL steril flaska, och en 250 mL steril flaska.</li>
	<li>Förbered 100 m...

<ol>
	<li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research.">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li><li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency:+what+will+become+of+embryonic+stem+cells.">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases.">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+(ipsc)+based+therapeutics.">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li><li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Cell+Reprogramming:+Methods+and+Applications.">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li><li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation.">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li><li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion.">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li><li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choices+for+Induction+of+Pluripotency:+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies.">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li><li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells:+implications+in+cell-based+regenerative+medicine.">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells.">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells.">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts.">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li><li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins.">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li><li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency.">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells.">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation,+stemness,+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li><li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development.">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li><li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells.">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li></ol>

iPSCs växer snabbt som den mest lovande cell kandidat för regenerativ medicin applikationer och som ett oerhört användbart verktyg för sjukdomsmodellering och drogtester3,8. Det protokoll som presenteras här beskriver generering av mänskliga iPSCs från ett prov som har storleken på en hudpunsch biopsi med ett enkelt och effektivt förfarande som inte kräver någon särskild utrustning eller tidigare erfarenhet av omprogrammering teknik.
<p class="jo...

Cell omprogrammering representerar en ny teknik för att omvandla varje somatisk cell i kroppen till en pluripotenta stamcell, känd som iPSC1. Möjligheten att omprogrammering en vuxen somatisk cell tillbaka till en pluripotenta och odifferentierad stat har övervinna de gränser som införts av dålig tillgänglighet och etiska frågor i samband med användningen av pluripotenta celler, tidigare endast kan härledas från mänskliga embryon (embryonala stamceller eller ESC)2,3,4. I 2006 genomförde Kazutoshi Takahashi och Shinya Yamanaka en banbrytande studie för att uppnå den första omvandlingen av vuxna somatiska celler från huden till pluripotenta celler genom att artificiellt lägga till fyra specifika gener (Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC)5. Ett år senare ledde arbetet i Thomson laboratorium till en lyckad omprogrammering av somatiska celler till iPSCs genom transduktion av en annan kombination av fyra gener (Oct4, Sox2, nanog, Lin28)6.
iPSCs erbjuder ett antal möjligheter för forskare och forskare inom olika områden, såsom regenerativ medicin och farmakologi, är en utmärkt plattform för att studera och behandla olika sjukdomar tillsammans med en genotypisk reflektion av egenskaperna hos den patient de härstammar från. Användningen av iPSCs ger flera fördelar, bland annat: den minskade risken för immunsvar på grund av ett fullständigt autologt ursprung av celler; möjligheten att skapa ett cell bibliotek, ett viktigt verktyg för att förutsäga svar på nya läkemedel och deras biverkningar, eftersom de kan kontinuerligt självförnya och generera olika celltyper; och chansen att utveckla en skräddarsydd metod för läkemedelsadministration7,8,9.
Olika tekniker är kända för närvarande, för att inducera uttrycket av omprogrammeringskoefficienter och de ingår i två huvudkategorier: icke-virala och virala vektorbaserade metoder10,11,12,13. Icke-virala metoder inkluderar mRNA transfektion, Mirna infektion/transfektion, piggybac, minicircle vektorer och episomala plasmider och undanflykt10,11,12,13. Viral-baserade metoder inkluderar icke-integrerande virus, såsom adenovirus, Sendai virus och proteiner, och integrera virus som retrovirus och lentivirus10,11,12,13.
Enligt flera studier, inga signifikanta skillnader har noterats bland dessa metoder när det gäller effektiviteten av cell omprogrammering, därav, valet av lämplig metod beror strikt på den celltyp som används och på de efterföljande tillämpningarna av iPSCs erhålls14,15. Alla de nämnda metoderna visar nackdelar, till exempel är Sendai-viruset effektivt på alla celltyper, men kräver en hel del passager för att få iPSCs; omprogrammering av episomes är utmärkt för blodkroppar men behöver modifiering av standard odlingsförhållanden för fibroblaster; den piggybac metoden kan representera ett attraktivt alternativ men studier i mänskliga celler är fortfarande begränsade och svaga10,11,12,13. Exosomer är nanovesikler fysiologiskt utsöndras i alla kroppsvätskor av celler. Enligt nyare studier, de är ansvariga för intercellulära kommunikation och kan ha en roll i viktiga biologiska processer, såsom cellproliferation, migration och differentiering. Exosomes kan transportera och överföra mRNA och miRNA till mottagar celler med en helt naturlig mekanism, eftersom de delar samma sammansättning av cellmembranet16. Därför är undanflykt en lovande ny generation teknik för omprogrammering, men deras potential att programmera somatiska celler av deras innehåll är fortfarande under utredning. Viral vektorer-baserade metoder använder virus modifierade för att förmedla omprogrammering gener till mottagar celler. Denna teknik, trots den höga effektiviteten av omprogrammering, anses inte vara säker, eftersom integrationen av viruset i cellen kan vara ansvarig för infektion, Teratomu och genomisk instabilitet17.
Följande protokoll för att generera iPSCs kolonier kombinerar Yamanaka ' s och Thompson ' s omprogrammering cocktail och bygger på användning av en metod som kräver NM-RNAs och immunsuppressiva faktorer med möjlighet att utföra det i Xeno-fria villkor. Logiken bakom användningen av denna metod är att sprida, inom det vetenskapliga samfundet, ett protokoll som möjliggör en snabb, enkel och mycket effektiv omprogrammering av vuxna mänskliga fibroblaster från buken huden till iPSCs18.
Styrkan i den föreslagna metoden är i själva verket den lätthet av prestanda och den korta tid som krävs för att få iPSCs. Dessutom, metoden undviker cellulära försvarsmekanismer och användning av virala vektorer, ansvarig för relevanta frågor.
När det gäller standardprotokollet gjordes följande ändringar: (1) Confluent fibroblaster synkroniserades vid passage 4 genom att placera i 0,1% serum för 48 h före trypsinization; (2) den cellulära densitet för kultur och volymen av reagenser justerades för utnyttjande på en 24-väl multi-well plattan i stället för en 6-brunn tallrik; (3) omprogrammeringexperimentet utfördes med hjälp av en 5% CO2 -inkubator i stället för en inkubator med atmosfäriskt (21% o2) eller hypoxisk (5% o2) villkor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td>Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>F9665-500ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H1387-1L</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>13778-030</td>
			<td>Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, store at -20 &#176;C. Avoid multiple freeze-thaws.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1116</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Culture Medium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A-500ml</td>
			<td>Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 &#176;C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 &#176;C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062-100ml</td>
			<td>Reduced-Serum Medium; store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4333-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P5665</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 0.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030124537</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030120086</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Cleaning agent for removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>00-0076</td>
			<td>Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method

Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) skulle kunna övervägas, hittills, en lovande källa till pluripotenta celler för hantering av för närvarande icke behandlingsbara sjukdomar, för beredning och förnyelse av skadade vävnader och för utveckling av nya läkemedel. Trots alla fördelar i samband med användningen av iPSCs, såsom den låga risken för avslag, de minskat etiska frågor, och möjligheten att få dem från både unga och gamla patienter utan någon skillnad i deras omprogrammering potential, problem att övervinna är fortfarande många. I själva verket kan cell omprogrammering utförs med viral och integrera virus orsaka infektioner och införandet av nödvändiga gener kan framkalla en genomisk instabilitet i mottagar cellen, försämra deras användning i kliniken. I synnerhet, det finns många farhågor om användningen av c-MYC-genen, välkänd från flera studier för dess mutation-inducerande aktivitet. Fibroblaster har dykt upp som lämplig cellpopulation för cellulära omprogrammering som de är lätta att isolera och kultur och skördas av en minimalt invasiv hudpunsch biopsi. Det protokoll som beskrivs här ger en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av hela förfarandet, från provbearbetning för att erhålla cellkulturer, val av reagenser och förnödenheter, rengöring och beredning, till cell omprogrammering med hjälp av en kommersiell icke-modifierat RNAs (NM-RNAs)-baserad omprogrammeringssats. Den valda omprogrammering Kit möjliggör en effektiv omprogrammering av Human dermal fibroblast till iPSCs och små kolonier kan ses så tidigt som 24 h efter den första transfektion, även med ändringar med hänsyn till standarddata bladet. Den omprogrammering förfarande som används i detta protokoll ger fördelen av en säker omprogrammering, utan risk för infektioner orsakade av viral Vector-baserade metoder, minskar cellulära försvarsmekanismer, och möjliggör generering av Xeno-fria iPSCs, alla viktiga funktioner som är obligatoriska för ytterligare kliniska tillämpningar.

Syftet med protokollet var att programmera dermal fibroblaster isolerade från buk huden med hjälp av icke-integrerande omprogrammering metod baserad på NM-RNAs att inducera uttrycket av specifika faktorer. För att uppnå detta mål, var Human dermal fibroblaster isolerade från hudprover av patienter som genomgår bukplastik och iPSCs genererades införa Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, nanog, Lin28 omprogrammering faktorer och E3, K3, B18 immun skatteflykt faktorer av en kommersiell färdig att använda omprogrammering kit s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Cell omprogrammering kräver införandet av viktiga gener, som reglerar och bibehålla pluripotenta cell tillstånd. Det protokoll som beskrivs möjliggör bildandet av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kolonier från Human dermal fibroblaster utan viral/integrera metoder men med hjälp av icke-modifierade RNAs (NM-RNAs) kombinerat med immunförsvaret undvikande faktorer minska cellulära försvarsmekanismer.

Isolering av vuxna humana dermal fibroblaster från buk hud och generering av inducerade pluripotenta stamceller med en icke-integrerande metod

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Följande protokoll ger instruktioner för att generera autolog human-inducerad pluripotenta stamceller genom snabb och effektiv omprogrammering av mänskliga dermal fibroblaster isolerade från en hud punch biopsi. De förfaranden som kan utföras av forskare med liten eller ingen erfarenhet av cell omprogrammering och med korrekt justering, tillåter produkten av xeno-fria inducerad pluripotenta stamceller. Autolog IPS-celler kan användas för regenerativ medicin applikationer och för modellering sjukdomar som genetiska sjukdomar eller cancer för att undersöka underliggande molekylära mekanismer och utveckla mer specifika terapier.Arbetsbelastningen är hög. Det är till stor hjälp att studera protokollet innan man noggrant planerar försöket, inklusive de steg under vilka reagenser och material ska beredas. Den visuella demonstrationen av proceduren hjälper forskningarna med liten eller ingen erfarenhet att utföra cellisolering och omprogrammering, undvika vanliga misstag relaterade till eventuella mikrobiella och RNA kontaminering.Under en steril huva, tvätta det nybehåffade provet av mänsklig hud från buken i en 100 millimeters skål med HPSS-lösning. Ta bort hår och fett med hjälp av fina tlys och saxar och dissekera det med en skalpell för att få fragment av storleken på två millimeter med en millimeter, undvika ärr, smutsiga eller brända områden av vävnaden. Placera fyra små fragment i varje 35 millimeters skål, täck med ett sterilt täckglas och tillsätt 1,5 millimeter I-DMEM.Inkubera plattorna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i ca 15 dagar eller tills celler når 85%sammanflödet. Ändra odlingsmediet var tredje dag och kontrollera cellernas utväxt med hjälp av ett inverterat faskontrastmikroskop dagligen. Nu lyfter du täckglasen med fina tåtaningar, placera dem upp och ner i en 100 millimeters skål och tvätta med 1X steril PBS.Ta bort fragmenten av proverna och kassera dem. Tvätta plattor med 1X steril PBS. Ta bort 1X PBS och tillsätt tre millimeter Trypsin-EDTA till täckglasen placeras i 100 millimeter skålen och lägga till en millimeter trypsin-EDTA till 35 millimeter rätter också.Inkubera i fem minuter vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Sedan blockera trypsinization genom att lägga till fem millimeter TSS till 100 millimeter skålen och två millimeter TSS till varje 35 millimeter skålen. Samla upphängningen i 15 millimeter sterila rör, centrifug vid 400 gånger G vid fyra grader Celsius i fem minuter.Aspirera supernatanten och resuspend pelleten i 12 millimetrar av I-DMEM. Dela cellupphängningen i tre millimeters alikvoter och överför dem var och en i en 60 millimeters platta. Inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.Byt medium dagligen. Håll celler i kultur tills de når en sammanflödet av 75%Efter det, upprepa trypsinization tre gånger för att få celler som passage fyra. Sedan synkroniserar du cellerna genom att ersätta I-DMEM med S-DMEM och inkubera i 48 timmar vid 37 grader Celsius med 5 %koldioxid.Under cellen synkronisering, förbereda fibroblast expansion medium och totalt icke-modifierad RNA omprogrammering cocktail för fibroblast fri programmering. För att förenkla utarbetandet av de nio rör av icke-modifierade RNA alikvoter som sedan delas upp i 36, brukade vi följa ett schema som vi fäst på huven väggen. Coat en 24-brunnsplatta genom att överföra 100 mikroliter av källaren membran matris tinas på is till varje brunn för att jämnt täcka botten.Inkubera i minst en timme vid 37 grader Celsius innan du sådde cellerna. Aspirera mediet från plattor med celler i kultur och tvätta snabbt i 1X PBS. Upprepa trypsinization för att erhålla celler som passage fem.Aspirera den supernatant och resuspend pelleten i en lämplig volym av fibroblast expansionsmedium. Förbered och rengör hemocytometern med 70%alkohol. Förbered sedan en lösning genom att försiktigt blanda 10 mikroliter trypanblå och 10 mikroliter cellfjädring i ett 1,5 milliliterrör och inkubera i en till två minuter vid rumstemperatur.Pipetter 10 mikroliter av lösningen i hemocytometern och placera den på scenen av en inverterad fas kontrast mikroskop för att räkna. Icke-livskraftiga celler är blå medan livskraftiga celler är obefläckade. Räkna cellerna i minst två kvadrater av hemocytometerkammaren.Utför en spädningsgrad för att erhålla en densitet på 2,5 gånger 10 till de fjärde cellerna per 500 mikroliter fibroblast expansionsmedium och resuspend cell pelleten. Pipett 500 mikroliter av cellupphängningen i varje brunn av 24-brunnsplattan. Inkubera celler över natten vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.På morgonen, ta bort det gamla mediet från varje brunn och ersätta den med 500 mikroliter av pre-zarmed xeno-fri faktorfri kultur medium. Inkubera vid 37%grader Celsius under 5%koldioxid i minst sex timmar. Tina fem 15,4 mikroliter alikvoter av totalt nmRNA omprogrammering cocktail vid rumstemperatur sedan placera dem i is.Tillsätt 234,6 mikroliter av reducerat serummedium till varje alikvot, försiktigt pipetter tre till fem gånger och märka var och en som rör A.Label fem sterila RNase-fria 0,5 milliliter rör som rör B och blanda sex mikroliter av syntetiska små störande RNA transfection reagens med 244 mikroliter av reducerat serum medium. Sedan, använd pipetter för att lägga till innehållet i varje rör B till ett rör A droppe klokt. Blanda genom att knacka på botten av röret.Inkubera i rumstemperatur i 15 minuter. Efter det, att lägga till 125 mikroliter av nmRNA transfection komplex lösning från var och en av de fem alikvoterna till varje brunn, luta plattan och pipetten droppe klokt i mediet. Blanda innehållet i de 20 brunnarna genom att gunga försiktigt.Använd de återstående fyra brunnarna som referens. Inkubera plattan i 15 timmar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Nästa dag, aspirera mediet.Under den sterila huven, upprepa transfektionsproceduren, som på dag ett, varje dag i tre dagar till. På dag fem, aspirera mediet och utbyte med färska, förvörd XF / FF Kultur Medium under en steril huva. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid.Övervaka cellkulturen dagligen genom ett faskontrastmikroskop, tills observera bildandet av IPSC-kolonier. Syftet med detta protokoll var att omprogrammera dermal fibroblaster isolerade från buken huden med hjälp av icke-integrera omprogrammering metod. Human fibroblaster outgrew från prover av buken huden inom en vecka av kultur och nådde 85%sammanflödet inom två veckor.Celler kännetecknades av självhäftande tillväxt på plast kultur rätter, och deras morfologi varierade från långsträckta och spindel-formad till tillplattad och stjärnformade. Fibroblast morfologi och arrangemang och kultur förändrats dramatiskt efter sådd på BMM, när de förvärvade en långsträckt morfologi och arrangerade för att bilda tunna grenade strukturer. Små kolonier var redan synliga i kultur på dag ett från första transfection och deras storlek växte progressivt över tiden, medan deras antal ökade til dag sju och sedan förblev stabil mellan dag sju och dag 14, förmodligen som ett resultat av mindre kolonier sammanslagning för att bilda större kolonier.Eftersom omprogrammering förfarandet utfördes med hjälp av antibiotika-fria medier, i det fall där sterila villkor inte garanterades, blev mikrobiell kontaminering en viktig fråga. Spridningshastighet och pläteringsdensiteten påverkar omprogrammeringseffektiviteten, så det är viktigt att planera cellpassning och definiera pläteringstätheten på grundval av cellproliferationshastigheten. Detta protokoll ersätter reagenser som härrör från djur för lämpliga xenofria reagenser och tillåter omprogrammering av vuxna fibroblaster till IPS-celler i en komplett xenofri kulturmiljö som inte var deras kliniska användning.Mänskliga celler är en potentiell källa till infektion med blodburna patogener, därav, personlig skyddsutrustning bör bäras under hela förfarandet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utveckling, expansion och<em&gt; In vivo</em&gt; Övervakning av humana NK celler från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidad differentiering av mogna njurpodocyter från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller under kemiskt definierade förhållanden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kulturmetod för att upprätthålla quiescenta mänskliga hematopoetiska stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Isogen njure glomerulus chip konstruerad från humaninducerade pluripotenta stamceller

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generering av humana blodkärlsorganoider från pluripotenta stamceller

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Generering, screening med hög genomströmning och biobankning av humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda hjärtsfäroider

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...