Name: isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Yazarların hiçbir takdiri yok.

İnsan dokusundan alınan örnekler Helsinki Bildirgesi'ne göre üniversite hastanesi Federico II yönergelerine uyulurken toplanmıştır. Bu çalışmaya katılan tüm hastalara yazılı izin verildi.
1. Malzeme ve Kültür Medyasının Hazırlanması
<ol><li>Temiz ve otoklav cerrahi makas büyük bir çift, ince forceps iki set, mikrodissecting makas iki çift, 1 L steril şişe, 500 mL steril şişe, ve 250 mL steril şişe.</li>
	<li>100 mm plaka, 60 mm plaka, 35 mm plaka, tek kullanı...

<ol>
	<li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research.">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li><li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine.">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li><li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+applications+in+regenerative+medicine,+disease+modeling,+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).</li><li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency:+what+will+become+of+embryonic+stem+cells.">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases.">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+(ipsc)+based+therapeutics.">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li><li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Cell+Reprogramming:+Methods+and+Applications.">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).</li><li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA.">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li><li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation.">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li><li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion.">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li><li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choices+for+Induction+of+Pluripotency:+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies.">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li><li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells:+implications+in+cell-based+regenerative+medicine.">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells.">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li><li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells.">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells.">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li><li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts.">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li><li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins.">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li><li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency.">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells.">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation,+stemness,+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li><li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development.">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li><li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li><li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells.">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li></ol>

iPSCs hızla rejeneratif tıp uygulamaları için en umut verici hücre adayı olarak ortaya çıkmaktadır ve hastalık modelleme ve ilaç testi için son derece yararlı bir araç olarak3,8. Burada sunulan protokol, herhangi bir özel ekipman veya yeniden programlama teknolojisi ile önceki deneyim gerektirmeyen basit ve verimli bir prosedür ile bir deri yumruk biyopsisi boyutuna sahip bir örnek insan iPSCs nesil açıklar.
Kaplama...

Hücre yeniden programlama iPSC1olarak bilinen bir pluripotent kök hücre, vücudun her somatik hücre dönüştürmek için yeni bir teknoloji temsil eder. Bir pluripotent ve farklılaşmamış devlet geri yetişkin bir somatik hücre yeniden programlama imkanı pluripotent hücrelerin kullanımı ile ilgili kötü durumu ve etik sorunlar tarafından dayatılan sınırları aşmak, daha önce sadece insan embriyolarından elde edilebilir (embriyonik kök hücreler veya ESC)2,3,4. 2006 yılında, Kazutoshi Takahashi ve Shinya Yamanaka yapay dört özel genler (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5ekleyerek pluripotent hücrelere deriden yetişkin somatik hücrelerin ilk dönüşüm elde öncü bir çalışma yürüttü . Bir yıl sonra, Thomson laboratuvarında yapılan çalışmalar dört gen (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6farklı bir kombinasyonu transdüksiyon tarafından iPSCs içine somatik hücrelerin başarılı yeniden programlama yol açtı .
iPSC'ler, elde ettikleri hastanın özelliklerinin genotyolojik bir yansıması ile birlikte farklı hastalıkları incelemek ve tedavi etmek için mükemmel bir platform olan, rejeneratif tıp ve farmakoloji gibi farklı alanlardaki bilim adamları ve araştırmacılariçin bir dizi fırsat sunar. iPSCs kullanımı dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar: hücrelerin tamamen otolog kökenli nedeniyle bağışıklık yanıtı için azaltılmış risk; sürekli olarak kendini yenileyebildikleri ve farklı hücre tipleri üretebildikleri için, yeni ilaçlara ve yan etkilerine tepkiyi tahmin etmek için önemli bir araç olan hücre kitaplığı oluşturma olasılığı; ve ilaç yönetimi için özelleştirilmiş bir yaklaşım geliştirmek için şans7,8,9.
Çeşitli teknikler şu anda, yeniden programlama faktörlerinin ifade ikna etmek için bilinen ve iki ana kategoride yer almaktadır: olmayan viral ve viral vektör tabanlı yöntemler10,11,12,13. Viral olmayan yöntemler mRNA transfeksiyon, miRNA enfeksiyon / transfeksiyon, PiggyBac, minicircle vektörler ve epizomal plazmidler ve ekzozomlar10,11,12,13içerir. Viral tabanlı yöntemler, Adenovirüs, Sendai virüs ve proteinler gibi entegre olmayan virüsler ve Retrovirus ve Lentivirus10,11,12,13gibi entegre virüsler içerir.
Çeşitli çalışmalara göre, hücre yeniden programlama etkinliği açısından bu yöntemler arasında önemli bir fark fark edilmiştir, dolayısıyla, uygun yöntemseçimi kesinlikle kullanılan hücre tipine bağlıdır ve alınan iPSCs sonraki uygulamalara bağlıdır14,15. Söz konusu tüm yöntemler dezavantajları göstermek, örneğin, Sendai virüs tüm hücre türleri üzerinde etkilidir, ancak iPSCs elde etmek için pasajlar bir sürü gerektirir; epizomlar tarafından yeniden programlama kan hücreleri için mükemmel ama fibroblastlar için standart kültür koşullarının değiştirilmesi gerekiyor; PiggyBac yöntemi çekici bir alternatif temsil edebilir ama insan hücrelerinde çalışmalar hala sınırlı ve zayıf10,11,12,13. Ekzozomlar fizyolojik olarak tüm vücut sıvılarına hücreler tarafından salgılanan nano-veziküllerdir. Son çalışmalara göre, hücreler arası iletişimden sorumludurlar ve hücre çoğalması, göç ve farklılaşma gibi önemli biyolojik süreçlerde rol oynarlar. Ekzozomlar, hücre zarının aynı bileşimini paylaştıkları için mRNA ve miRNA'yı tamamen doğal bir mekanizmaya sahip alıcı hücrelere taşıyabilir ve aktarabilirler16. Bu nedenle, ekzozomlar yeniden programlama için umut verici bir yeni nesil tekniktir, ancak somatik hücreleri içeriklerine göre yeniden programlama potansiyelleri hala araştırılmaktadır. Viral vektörtabanlı yöntemler, yeniden programlama genlerini alıcı hücrelere iletmek için değiştirilmiş virüsleri kullanır. Bu teknik, yeniden programlama yüksek verimliliğe rağmen, güvenli olarak kabul edilmez, hücre içinde virüsün entegrasyonu enfeksiyon sorumlu olabilir gibi, teratomlar ve genomik instabilite17.
IPSC kolonileri oluşturmak için aşağıdaki protokol Yamanaka ve Thompson'S yeniden programlama kokteyl birleştirir ve xeno-free koşullarda gerçekleştirmek için imkanı ile NM-RNA ve bağışıklık kaçırma faktörleri gerektiren bir yöntemin kullanımına dayanmaktadır. Bu yöntemin kullanımıarkasındaki mantığı yaymak için, bilimsel topluluk içinde, bir protokol iPSCs içine karın deriden yetişkin insan fibroblastlar hızlı, basit ve son derece etkili bir yeniden programlama sağlayan18.
Önerilen yöntemin güçlü yönleri, aslında, performans kolaylığı ve iPSCs elde etmek için gerekli kısa süre vardır. Ayrıca, yöntem hücresel savunma mekanizmaları ve viral vektörlerin kullanımını önler, ilgili konulardan sorumlu.
Standart protokole göre aşağıdaki değişiklikler yapılmıştır: (1) Konfluent fibroblastlar 48 saat boyunca %0.1 serum yerleştirilerek 4 8 no'lu paragrafta senkronize edilmiştir; (2) Kültür için hücresel yoğunluk ve reaktiflerin hacmi 6 kuyulu plaka yerine 24 kuyulu çok kuyulu bir plaka üzerinde kullanılmak üzere ayarlandı; (3) Yeniden programlama deneyi atmosferik (%21 O 2 ) veya hipoksik (%5 O2)koşullarına sahip birkuvöz yerine %5 CO2 kuluçka makinesi kullanılarak gerçekleştirildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353935</td>
			<td>Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>Treated, sterile cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipet</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td>Sterile, polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Centrifuge sterile tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>D6429-500ml</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>F9665-500ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H1387-1L</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>13778-030</td>
			<td>Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, store at -20 &#176;C. Avoid multiple freeze-thaws.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer Chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1116</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Culture Medium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A-500ml</td>
			<td>Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 &#176;C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 &#176;C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-062-100ml</td>
			<td>Reduced-Serum Medium; store at 2-8 &#176;C; avoid exposure to light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P4333-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P5665</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 0.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030124537</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free 1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>H0030120086</td>
			<td>RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Cleaning agent for removing RNase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>94046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>00-0076</td>
			<td>Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td>Store at -20 &#176;C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method

İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) bugüne kadar, şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların yönetimi için pluripotent hücrelerin umut verici bir kaynak olarak kabul edilebilir, yaralı dokuların reconstitution ve rejenerasyon ve yeni ilaçların geliştirilmesi için. Düşük ret riski, azalan etik sorunlar ve yeniden programlama potansiyellerinde herhangi bir fark olmaksızın hem genç hem de yaşlı hastalardan bunları elde etme imkanı gibi iPSC'lerin kullanımına ilişkin tüm avantajlara rağmen, üstesinden gelinmesi gereken sorunlar hala çoktur. Aslında, viral ve entegre virüsler ile yapılan hücre yeniden programlama enfeksiyonlara neden olabilir ve gerekli genlerin giriş alıcı hücrenin bir genomik istikrarsızlık neden olabilir, klinikte kullanımını bozan. Özellikle, c-Myc geninin kullanımı hakkında birçok endişe vardır, mutasyona neden olan aktivitesi için çeşitli çalışmalardan iyi bilinmektedir. Fibroblastlar izole etmek ve kültür kolay ve minimal invaziv deri yumruk biyopsisi ile hasat olarak hücresel yeniden programlama için uygun hücre popülasyonu olarak ortaya çıkmıştır. Burada açıklanan protokol, numune işlemeden hücre kültürleri elde etmeye, reaktif ve malzeme seçimine, temizlik ve hazırlamaya, ticari bir yöntemle hücre yeniden programlamasına kadar tüm prosedürün ayrıntılı bir adım adım açıklamasını sağlar. değiştirilmemiş RNA'lar (NM-RNA)tabanlı yeniden programlama kiti. Seçilen yeniden programlama kiti, insan dermal fibroblastının iPSC'lere etkin bir şekilde yeniden programlanmasına olanak sağlar ve küçük koloniler, standart veri sayfasına ilişkin değişikliklerle bile ilk transfeksiyondan sonra 24 saat kadar erken görülebilir. Bu protokolde kullanılan yeniden programlama prosedürü, viral vektör tabanlı yöntemlerin neden olduğu enfeksiyon riski olmadan güvenli bir yeniden programlama avantajı sunar, hücresel savunma mekanizmalarını azaltır ve xeno-free iPSCs üretimine izin verir, tüm daha fazla klinik uygulamalar için zorunlu olan kritik özellikler.

Protokolün amacı, abdominal deriden izole edilen dermal fibroblastların nm-rna'lara dayalı entegre olmayan yeniden programlama yöntemi ile belirli faktörlerin ekspresyonunu tetiklemek tir. Bu amaca ulaşmak için, insan dermal fibroblastlar mide tuck cerrahisi geçiren hastaların deri örneklerinden izole edildi ve iPSCs Oct4 tanıtArak oluşturuldu, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 yeniden programlama faktörleri ve E3, K3, B18 bağışıklık kaçırma faktörleri ticari kullanıma hazır yeniden programlama kiti ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method at JoVE.com

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Aşağıdaki protokol, deri yumruk biyopsisinden izole edilen insan dermal fibroblastlarının hızlı ve verimli bir şekilde yeniden programlanması yoluyla otolog insan kaynaklı pluripotent kök hücreler üretmek için talimatlar sağlar. İşlemler, hücre yeniden programlamakonusunda çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan araştırmacılar tarafından yapılabilir ve uygun ayarlama ile kseno-serbest indüklenen pluripotent kök hücrelerin inproduct sağlar. Otolog IPS hücreleri rejeneratif tıp uygulamaları ve genetik bozukluklar veya kanser gibi hastalıkların modelalınmasında altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak ve daha spesifik tedaviler geliştirmek için kullanılabilir.İş yükü yüksek. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması gereken adımlar da dahil olmak üzere, deneyi dikkatlice planlamadan önce protokolü incelemek son derece yararlıdır. Prosedürün görsel gösterimi, çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan araştırmaların hücre izolasyonunu ve yeniden programlamayı gerçekleştirmesine yardımcı olarak, olası mikrobiyal ve RNA kontaminasyonuyla ilgili yaygın hatalardan kaçınır.Steril bir kaputun altında, karından elde edilen taze insan derisi örneğini HPSS solüsyonu ile 100 milimetrelik bir tabakta yıkayın. Ince çalgılar ve makas kullanarak saç ve yağ çıkarın ve bir milimetre tarafından iki milimetre büyüklüğünde parçaları elde etmek için bir neşter ile incelemek, izleri kaçınarak, doku kirli veya yanmış alanlarda. Her 35 milimetrelik tabağa dört küçük parça yerleştirin, steril bir kapak camı ile kaplayın ve 1,5 milimetre I-DMEM ekleyin.Plakaları yaklaşık 15 gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle veya hücreler %85'e ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. Her üç günde bir kültür ortamını değiştirin ve her gün ters faz kontrastmikroskobu kullanarak hücrelerin büyümesini kontrol edin. Şimdi, ince forseps ile kapak gözlük kaldırın, baş aşağı 100 milimetrelik çanak yerleştirin ve 1X steril PBS ile yıkayın.Örneklerin parçalarını çıkarın ve atın. 1X steril PBS ile yıkama plakaları. 1X PBS'yi çıkarın ve 100 milimetrelik tabağa yerleştirilen kapak camlarına üç milimetre Tripsin-EDTA ekleyin ve 35 milimetrelik yemeklere bir milimetre Trypsin-EDTA ekleyin.%5 karbondioksitle 37 derecede beş dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, 100 milimetrelik tabağa beş milimetre TSS ve her 35 milimetrelik tabağa iki milimetre TSS ekleyerek tripsinizasyonu engelleyin. Süspansiyonu 15 milimetrelik steril tüplere, santrifüjü 400 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika toplayın.Supernatant aspire ve I-DMEM 12 milimetre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna üç milimetrelik bir erte bölün ve her biri 60 milimetrelik bir plakaya aktarın. %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat.Orta yı günlük olarak değiştirin. Hücreleri %75'lik bir kesişme olana kadar kültürde tutun, bundan sonra dört hücreyi elde etmek için tripsinizasyonu üç kez tekrarlayın. Daha sonra, I-DMEM'i S-DMEM ile değiştirerek hücreleri senkronize edin ve %5 karbondioksit le 37 derecede 48 saat kuluçkaya yatırın.Hücre senkronizasyonu sırasında, fibroblast sızma programlama için fibroblast genişleme ortamı nı ve toplam modifiye edilmeyen RNA yeniden programlama kokteylini hazırlayın. Daha sonra 36 ayrılır modifiye olmayan RNA aliquots dokuz tüplerhazırlanmasını kolaylaştırmak için, biz başlık duvara bağlı bir düzeni takip etmek için kullanılır. Kat 24-iyi plaka bodrum membran matris 100 mikrolitre aktararak her kuyuda buz üzerinde çözülmüş alt kapsayacak şekilde çözülmüş.Hücreleri tohumlamadan önce en az bir saat 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Kültür hücreleri ile plakalardan orta aspire ve hızlı bir şekilde 1X PBS içinde yıkayın. Beş geçişi hücreleri elde etmek için trypsinization tekrarlayın.Supernatant aspire ve fibroblast genleşme orta uygun bir hacimde pelet resuspend. Hemositometreyi %70 alkolle hazırlayın ve temizleyin. Daha sonra, 10 mikrolitre trypan mavisini ve 10 mikrolitre hücre süspansiyonünü 1,5 mililitrelik bir tüpte hafifçe karıştırarak bir çözüm hazırlayın ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika kuluçkaya yatırın.Pipet 10 mikrolitre çözeltiyi hemositometreye yerleştirin ve saymak için ters faz kontrast mikroskobu sahnesine yerleştirin. Canlı olmayan hücreler mavi, canlı hücreler ise lekesizdir. Hücreleri hemositometre odasının en az iki karesinde sayın.Fibroblast genleşme ortamının 500 mikrolitresi başına dördüncü hücrelere 2,5 kat 10 yoğunluk elde etmek ve hücre peletini yeniden askıya almak için seyreltme yapın. Pipet 24 kuyuplakaher kuyuiçine hücre süspansiyon 500 mikrolitre. Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Sabahları, her kuyudan eski ortamı çıkarın ve 500 mikrolitre önceden silahsız xeno-free kültür ortamı ile değiştirin. En az altı saat boyunca %5 karbondioksit inkantigrat%37 santigrat derecede kuluçka. Oda sıcaklığında toplam nmRNA yeniden programlama kokteyl beş 15,4 mikrolitre aliquots çözülme sonra buz onları yerleştirin.Her aliquot azaltılmış serum orta 234,6 mikrolitre ekleyin, hafifçe pipet üç ila beş kez ve tüp A.Label beş steril RNase-free 0.5 mililitre tüpler tüp B olarak etiket ve 244 mikrolitre azaltılmış serum orta sentetik küçük müdahale RNA transfeksiyon reaktif ivedi altı mikrolitre. Daha sonra, bir tüp A damla akıllıca her tüp B içeriğini eklemek için pipetler kullanın. Tüpün dibine dokunarak karıştırın.15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Bundan sonra, her beş aliquots her beş aliquots nmRNA transfection karmaşık çözelti 125 mikrolitre eklemek için, plaka ve pipet orta akıllıca damla eğim. 20 kuyudaki içeriği hafifçe sallayarak karıştırın.Geri kalan dört kuyuyu referans olarak kullanın. Plakayı 15 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, orta aspire.Steril kaputun altında, transfeksiyon işlemini tekrarlayın, ilk gün olduğu gibi, her gün üç gün daha. Beşinci gün, steril bir başlık altında taze, önceden ısıtılmış XF / FF Kültür Orta ile orta aspire ve değişim. Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.IPSC kolonilerinin oluşumunu gözlemleyene kadar hücre kültürünü her gün faz kontrastmikroskobuyla izleyin. Bu protokolün amacı, abdominal deriden izole edilen dermal fibroblastların entegre olmayan yeniden programlama yöntemi ile yeniden programlanmasıdır. İnsan fibroblastları, kültürden sonraki bir hafta içinde karın derisi örneklerinden artarak iki hafta içinde %85'e ulaştı.Hücreler plastik kültür yemeklerinde yapışkan büyüme ile karakterize edildi ve morfolojileri uzamış ve iğ şeklindeki düzleştirilmiş ve yıldız şeklindeydi. Fibroblast morfolojisi ve düzenleme ve kültür, BMM'de tohumlamadan sonra, uzatılmış bir morfoloji edinip ince dallı yapılar oluşturacak şekilde düzenlenmiş olarak önemli ölçüde değişmiştir. Küçük koloniler ilk transfection'dan itibaren ilk gün kültürde zaten görülebiliyordu ve sayıları zamanla giderek arttı, yedinci güne kadar sayıları arttı ve daha sonra muhtemelen daha büyük koloniler oluşturmak için birleşen küçük kolonilerin bir sonucu olarak, yedinci gün ile 14.Yeniden programlama işlemi antibiyotiksiz ortam kullanılarak yapıldığından, steril koşulların garanti altına alınmadığı durumlarda mikrobiyal kontaminasyon önemli bir sorun haline geldi. Proliferasyon hızı ve kaplama yoğunluğu yeniden programlama verimliliğini etkilediğinden, hücre geçişini planlamak ve hücre çoğalma hızı temelinde kaplama yoğunluğunu tanımlamak önemlidir. Uygun kseno-free reaktifler için hayvan türetilmiş reaktifler ikame, bu protokol onların klinik kullanımı değildi tam bir xeno-free kültür ortamında IPS hücrelerine yetişkin insan fibroblastların yeniden programlanması sağlar.İnsan hücreleri kan yoluyla bulaşan patojenler ile enfeksiyon potansiyel bir kaynak, bu nedenle, kişisel koruyucu ekipman işlem boyunca giyilmelidir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...