Name: use of capillary electrophoresis immunoassay to search for potential biomarkers of amyotrophic lateral sclerosis in human platelets
Uploaded: 2020-02-10T13:30:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets at JoVE.com

מחקר זה בחסות מענק פנימי. שהוענק לאלכוהוליסטים אנונימיים עבודה זו נתמכת על ידי מענק CTSA מ NCATS הוענק למרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס לגבולות: מכון לבלב למחקר קליני וטרנסלtional (#UL1TR606381). התכנים הם באחריותם הבלעדית של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את ההשקפות הרשמיות של NIH או NCATS. אנחנו אסירי תודה על אוניברסיטת קנזס מרכז רפואי מרפאת ALS אישי לקבלת אישור IRB לדגימת דם אוסף מחולים בריאים מתנדבים ALS. המחברים מודים Emre Agbas על הגהה של כתב היד.

<ol>
	<li>Blair, P., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+alpha-granules:+basic+biology+and+clinical+correlates.">Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates.</a> Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).</li><li>Mercado, C. P., Kilic, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+SERT+in+platelets:+regulation+of+plasma+serotonin+levels.">Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels.</a> Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).</li><li>Goubau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+granule+trafficking+in+platelets+and+neurons:+a+common+molecular+machinery.">Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery.</a> European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).</li><li>Basu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelets+as+a+platform+to+monitor+metabolic+biomarkers+using+stable+isotopes+and+LC-MS.">Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS.</a> Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).</li><li>Wilhite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+phosphorylated+TDP-43:+an+exploratory+study+for+a+peripheral+surrogate+biomarker+development+for+Alzheimer's+disease.">Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer's disease.</a> Future Science OA. 3 (4), 238 (2017).</li><li>Worth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS+Analysis+of+Human+Platelets+as+a+Platform+for+Studying+Mitochondrial+Metabolism.">LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).</li><li>Statland, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rasagiline+for+amyotrophic+lateral+sclerosis:+A+randomized,+controlled+trial.">Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial.</a> Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).</li><li>Charytan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+cardiovascular+efficacy+of+spironolactone+in+dialysis-dependent+ESRD+(SPin-D):+a+randomized,+placebo-controlled,+multiple+dosage+trial.">Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial.</a> Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).</li><li>Ugras, S. E., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Binding+Proteins+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+and+Neurodegeneration.">RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration.</a> Neurology Research International. , 432780 (2012).</li><li>Amador-Ortiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+immunoreactivity+in+hippocampal+sclerosis+and+Alzheimer's+disease.">TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer's disease.</a> Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).</li><li>Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43:+the+relationship+between+protein+aggregation+and+neurodegeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration.</a> FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+links+between+TDP-43+dysfunction+and+neurodegeneration.">The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration.</a> Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).</li><li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ALS-associated+mutation+affecting+TDP-43+enhances+protein+aggregation,+fibril+formation+and+neurotoxicity.">An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity.</a> Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).</li><li>Geser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+disease+clinically+limited+to+the+lower+motor+neuron+is+a+diffuse+TDP-43+proteinopathy.">Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43:+gumming+up+neurons+through+protein-protein+and+protein-RNA+interactions.">TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).</li><li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALS+disease+protein+TDP-43+is+actively+transported+in+motor+neuron+axons+and+regulates+axon+outgrowth.">The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth.</a> Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).</li><li>Ayala, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+the+cellular+localization+and+shuttling+of+TDP-43.">Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43.</a> Journal of Cell Sciences. 121, 3778-3785 (2008).</li><li>Fiesel, F. C., Kahle, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+and+FUS/TLS:+cellular+functions+and+implications+for+neurodegeneration.">TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration.</a> FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).</li><li>Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+functions+of+TDP-43+and+FUS+and+their+role+in+ALS.">Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS.</a> Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).</li><li>Liachko, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDC7+inhibition+blocks+pathological+TDP-43+phosphorylation+and+neurodegeneration.">CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration.</a> Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).</li><li>Qureshi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+and+phospho-proteomic+profile+of+human+platelets+in+basal,+resting+state:+insights+into+integrin+signaling.">Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling.</a> PLoS One. 4 (10), 7627 (2009).</li><li>Suominen, I., Koivisto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Precision+When+Pipetting+Protein+Samples:+Assessing+Reliability+of+the+Reverse+Pipetting+Technique.">Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique.</a> American Laboratory. , (2011).</li><li>. Pipetting tool box for life sciences Available from: <a target="_blank" href="https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html">https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html</a> (2019)</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communication. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Fourier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+automated+capillary+nano-immunoassay-Simple+Western+assay-to+quantify+total+TDP43+protein+in+human+platelet+samples.">Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).</li><li>. Compatibility, S.W.S.A.B Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/technical_library.html">https://www.proteinsimple.com/technical_library.html</a> (2017)</li></ol>

המחברים להכריז לא עניין פיננסי מתחרה מלבד פרוטטינופשוט, Inc. כיסו את עלות הפרסום של כתב יד זה.

מערכת החיסונית המבוססת על נימי הנימים היא כיום שיטת הבחירה לניתוח מדגם בתפוקה גבוהה והקרנות התרופות25. כרכים קטנים לדוגמה, רכיבי שיטת מיטוב היטב, פלטפורמת שיטת האחסון והמכשור הידידותיים למשתמש, הוצאות מגיב ואחוזי הפחתת קורות חיים נמוכים הם היתרונות העיקריים26,27. למרות שישנן מספר שיטות להפרדת חלבונים בשיטות שונות ומבוססות, הנוגדן שמתואר כאן יכול להיות מותאם על ידי מעבדות קטנות העוסקות בפיתוח ביונסיקר מבוסס דם. הטכנולוגיה של השימוש ב-CEI המשמשת כאן מספקת אמינות, מדידות ורגישות עבור TDP-4328 והנגזרת הזרחנות שלה5.
מערכת CEI מספק גם מבחר ריבוב של ניתוח TDP-43 ונגזרות זרחנות שלה בו זמנית ולספק את הקוונפיקציה ישירה של חלבון היעד, אם מטוהרים או רקומביננטי היעד חלבון זמין. באורך מלא רקומביננטי TDP-43 חלבון הוא זמין מסחרית; עם זאת, רקומביננטי זרחני TDP-43 נגזרות לא. מאז זרחני TDP-43 אינו זמין מסחרית, ערך זרחון חזוי (PPV) יושם כדי להעריך TDP-43 פרופיל בחולים ALS. פאן TDP-43 ו-TDP זרחני-43 כמויות היו מתויג לצמיתות עם פלואורואופפור; לכן, פרופיל TDP-43 נשאר זהה עם או בלי יחידה כמותית (כלומר, ng/mL, pg/mL, וכו '). למרות קביעת כמות מוחלטת של TDP-43 ונגזרות זרחנים שלה (כלומר, P [S409-410-12] TDP-43) מספק מדידה כמותית יותר, חישוב PPV מבטלת את הצורך של רקומביננטי זרחנים TDP-43 עבור סטנדרטיזציה, מאז הוא לא זמין מסחרית.
CEI מספק מספר מחסומים בפלטפורמת הספק כדי לזהות במדויק את הבעיה במקרה שהתקלה נכשלת. זה מבטל את המכשולים ומספק עיצוב ניסיוני טוב יותר. תהליך הטיפול הוא אוטומטי לחלוטין, למעט מילוי צלחת המדגם. זוהי תכונה משמעותית בהשוואה לניתוח הכתמים המערביים הסטנדרטיים. תכונה זו מספקת עקביות מהפעלה-להפעלה. למרות שכל מעבדה כוללת נוהלי הפעלה סטנדרטיים ייחודיים, חשוב לדבוק בשיטות המזגרות את הטעות האנושית. לדוגמה, זה קריטי להכין את לומינול-S/תחמוצת התערובת רק לפני טעינת הצלחת, מאז הוספת חמצן לתוך הלומינול מתחיל את התגובה אנזימטית וצורכת המצע הלומינול. טעינת דגימות ונוגדנים ראשוניים/משניים לבארות צלחת ללא בועות אוויר הם גם צעדים חשובים באופן ביקורתי.
בנוסף, מאז בארות הצלחת הם קטנים בנפח ואין מקום בין בארות, משתמשים צריכים לנקוט זהירות בעת ליטוף, שהוא הצעד החשוב ביותר מאז כל דבר אחר הוא אוטומטי. מסדר ההעמסה של הדגימות, הנוגדנים והריאגנטים האחרים חשוב לעקביות של השיטת (איור 1). תהליך הכנת הצלחות לוקח בערך 40 – 45 דקות. לכן, מומלץ לטעון תחילה את הצלחת עם רכיבי השיטה הנדרשים ולהכין את תערובת הלומינול-S/מי חמצן ממש לפני הליטוף. בדרך זו, יש רצף עקבי של הוספת מגיב, ועוצמת אות עקבית באופן עקבי תהיה מושגת. לא מומלץ להשתמש הלומירול שפג תוקפם/חמצן מגיב, כפי שהוא משפיע בעיקר על חוזק של מי חמצן. ההתקדמות האחרונה בהצגת מערכת פיצול מאגר וכולל טווח תאימות כימיים וחומרי ניקוי הגדילו את איכות הרשת והפיקה תוצאות מתועלות וצפויות יותר. עכשיו, מנתח משולבת חדש מאותו היצרן בעל תכונה לניתוח דגימות המסומנות עם כימואומיננסנציה ו-מעלה נוגדנים מצופני קרינה באותו לרוץ. תכונה חדשה זו מבטלת את הצורך להפעיל ברציפות שתי צלחות בודדות ומבטלת את ההפעלה הפעלה-to-הפעלה.
יש לאחסן את לוחיות השיטת האחסון בטמפרטורת הסביבה. אם הוא נבחר לשמור את לוחיות הזמן במקרר של 4 ° c, יש להוציא את הלוחות בלילה שלפני המנה ולהביא לטמפרטורת הסביבה. בארות לדוגמה טעון באופן שגוי צריך להיות בהרחבה (4 – 5 פעמים) שטף עם המאגר סיפק בערכה לפני הוספת המדגם הנכון. כל נוגדן ראשוני ודגימות ביולוגיות הן ייחודיות; לכן, אופטימיזציה נוגדן/חלבון צריך להתבצע לפני ניתוח דגימות עבור חלבונים היעד בנוזלים ביולוגיים.
כאן, הזמן דגירה הנוגדן העיקרי נקבע 30 דקות כברירת מחדל. אם האות הוא חלש, משתמשים צריכים לשקול להגדיל את זמן דגירה העיקרי נוגדן עד להגיע כוח האות הרצוי ללא שחיקה האות הפלואורסצנטית. עבור טסיות האדם, דגימות במאגר מהחולים היו מוכנים משמש לצורך שיטת אופטימיזציה. הצירוף לדוגמה מייצג טוב יותר את הווריאציה בין biomolecules היעד. מומלץ להשתמש supernatants ברור במקום ליפוסט מוחלט או כולל הומואט עבור CEI.
הריכוז הגבוה של החלבון בתערובת של טסיות דם מלאה עלול להקטין את היחס בין האות לרעש (איור 2). הקפאת מחזורי ההפשרה של דגימות יש להימנע, כמו זה משפיע לרעה על כריכת נוגדנים העיקרי. המרכיבים של מאגר ליפוסט הם חשובים, כמו כמה ריאגנטים אינם תואמים CEI29. מומלץ להצליב את רשימת הריאגנטים התואם באתר האינטרנט של היצרן לפני ההכנה לדוגמה. זוהי הגבלה של המערכת שאינה סובלת תנאים מאוד גבוהים להכנה לדוגמא. מומלץ למטב את הפרמטרים של הפעלת השיטה (כלומר, דילול נוגדן ראשוני, ריכוז חלבונים, זמן הדגירה העיקרי של הנוגדן, וכו ') באמצעות דגימות במאגר כדי לנתח לאחר מכן את דגימות בודדות.

המטרה הכוללת של CEI כפי שמתואר כאן היא לספק פרוטוקול חורג מעודכן לניתוח חלבונים היעד של טסיות האדם. הקצאה של מולקולה חתימה מבוססת דם היא אחת המשימות החשובות ביותר בתחום של פיתוח ביואריקר במחלות ניווניות האדם, כגון מחלת אלצהיימר (AD), amyotrophic לרוחב טרשת נפוצה (ALS), אוני הטמפורלית ניוון (ftld), מחלת פרקינסון (PD), הכללת ומבגו (IBM), ושאר התנאים הפתולוגית לצבירת חלבונים הרלוונטיים. זיהוי של כמויות דקות של חלבונים כגון חתימה בכמויות גדולות של דם עם סוכנים רבים מפריעים הוא אתגר. לכן, הספציפיות, הרגישות, היכולת להתמודד עם מספר רב של דגימות, והיעדר האפשרות של השיטה שנבחרה הם קריטיים.
טסיות האדם יכול לשמש כסביבה לזהות ולהקצות חלבונים בסמנים פוטנציאליים עבור מחלות ניווניות. טסיות לספק את ההזדמנות לשמש מודל מחליף תא הראשי, אשר משקפים כמה תכונות של תאים עצביים1,2,3. יש תכונות מסוימות העושות טסיות אחד האמצעים המועדפת כדי לנתח חלבונים המועמד מועמדים ונגזרות כימיים שלהם. ראשון, טסיות ניתן לרכוש בקלות באמצעות גישה פחות פולשנית על ידי איסוף דם מתורמים (כלומר, לנקב) או בכמויות גדולות מבנקים דם הקהילה. שנית, טסיות ניתן לבודד בקלות מן הדם כולו עם עבודת הכנה מינימלית במעבדות מצויד מינימלית4,5. שלישית, טסיות אין גרעין; לכן, הם תא מודל טוב ללמוד שינויים בחילוף החומרים ללא התקנה הטרנססקריפט. רביעית, התוכן הסמנים של טסיות הוא אנקפסולציה; לכן, הסביבה מיקרוטסיות מגן על תוכנו מפני חומרים מפריעים סרום (כלומר, הפרוטסים). פלזמה חמישית, טסיות מועשר ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 7 – 8 ימים מבלי לאבד פעילות מטבולית. לכן, טסיות לספק מודל עובד שבו גורמים חיצוניים ממוזערים ומבוקרת.
שיטות חיסוני מסורתיות כגון מעטפת חיסונית (למשל, בלופים מערביים) ושיטת חיסוני מקושרת של אנזימים (אליסה) משמשות יותר בניתוח חלבונים ספציפי. עם זאת, שתי שיטות אלה יש מספר חסרונות, כולל מספר שלבי מידע, הדרישה של כימיקלים מסוכנים ריאגנטים, גודל דגימה גדולה, בעיות עם שינוי ביכולת הנתונים, ובין הפעלה מושתנים מידע. אלה התבקשו להתפתחות של שיטה פשוטה יותר עם פחות צעדים והשגה בתקופה קצרה יחסית. למרות שטכניקת האבן המערבית הקלאסית תישאר שיטת מעבדה פופולרית, הליך רב-השלבים שלה, אספקה, פסולת רעילה (כלומר, אקרילאמיד, מתנול וכו ') וזמן הטיפול הופכים להיות פחות רצויים בעת ביצוע תפוקה גבוהה כמותית . ניתוח חלבונים
הגישה CEI אוטומטי הוא הופך בהדרגה שיטה של בחירה עבור מעבדות המבצעות תפוקת התפוקה גבוהה חלבון אומר6. CEI מבטלת את הצורך ג'ל, אלקטרופורזה ג'ל מכשירים, ממברנות, אלקטרופורזה והעברת התקנים אלקטרו, וטיפול פיזי עורבות. אם תוכננה היטב, יש להשלים את מערך CEI בתוך כ 3.5 h, כולל ניתוח נתונים כמותי, electropherogram באיכות הפרסום וגרפים בעלי אנליזה סטטיסטית. עליונות נוספת של מערכת cei היא הדרישה של 10x-20x פחות ריכוז החלבון, מה שהופך אותו אידיאלי לשימוש בדגימות אנושיות בשימוש בניסויים קליניים7,8.
החלק הקריטי ביותר של CEI הוא אופטימיזציה של תנאי הטיפול עבור כל נוגדן שנרכשו מספקים שונים, סוג של נוגדן (חד שבטיים לעומת polyclonal בטים), ריכוז החלבון האופטימלי, הכנה לדוגמה, הטמפרטורה מדגם לדוגמה, ומתח האלקטרופורזה מוחל על נימים. פיתחנו שיטת מיטוב בתבנית יחידה עבור CEI שצריך להיות מיושם לפני כל assays חדש, אשר יחסוך זמן ומשאבים. צעד זה אופטימיזציה ואחריו הערכה כמותית אוטומטית של נגזרים הכולל והזרחתית של התגובה הטרנסניתית של DNA/RNA כריכת חלבון (TARDP). בשל גודלו (43 kDa), ראשי התיבות TDP-43 ישמשו לאורך הנייר הזה. כאן, TDP-43 חלבון בטסיות הדם האנושית ליפוסט המתקבל מהחולים ALS מוערך כדי לעזור לפתח ערך זרחון חזוי (PPV) כמו בסמנים פוטנציאליים התחזיות.
TDP-43 הוא מועמד פוטנציאלי מחלה חדשה ביוארקר עבור ALS. TDP-43 הוא חלבון בכל מועד בכל התאים הנוקלאווניים; לכן, את הפונקציות של tdp-43 במהלך שונות הסלולר אירועים נורמליים במחלות ניווניות נחקרו9,10,11,12,13,14. למרות tdp-43 הוא חלבון גרעיני15, יש לו את היכולת הסעה פנימה והחוצה בין הגרעין והציטופלסמה בשל נוכחותם של לוקליזציה גרעינית ורצפים ייצוא גרעיני16,17,18,19. Cytoplasmic TDP-43 מעורב באירועים סלולריים שונים, כגון היציבות mRNA והתחבורה, תגובת הלחץ, פונקציה מיטוכונדריאלי, המשך באופן אוטומטי כמה20. עם זאת, לא הרבה ידוע על התפקיד של נגזרות זרחני של TDP-43 מלבד המעורבות שלהם בפתוגנזה של מחלה ניווניות21.
פרוטוקול זה ממחיש כיצד לייעל את תנאי הגישה כדי לנתח את התוכן של TDP-43 ואת נגזרת זרחתיה שלה בטסיות באמצעות הגישה CEI. מאז זרחני TDP-43 אינו זמין מסחרית, הוא מוצע להשתמש בערך זרחון חזוי (PPV) כדי להעריך את הפרופילים של TDP-43 בחולים ALS. מערכת CEI זו מנצלת נפח קטן של תערובת לדוגמה (2.5 – 3.0 μL לכל נימי דם). הגדרת עוצמת הקול הכוללת של שיטת האחסון היא 8.0 μL לכל קפילר בהתבסס על פרוטוקול היצרן; מכאן, החוקרים יכולים להשתמש אחד לדוגמה תערובת הכנה לשני מסלולים נפרדים. היצרן עיצב את פרוטוקול הספק כך שכל שגיאות הליטוף יהיו מזעריות, אם לא יבוטלו לחלוטין. The 24 האדם בודדים טסיות לדוגמה תערובות מחולקים לחצי כרכים (כלומר, 2.5 – 3.0 μL לכל מדגם) ו ניתח ברציפות אלה על ידי שני נוגדנים שונים בתוך ~ 7 h. מערכת ה-CEI המתוארת כאן מספקת מודאליות רצויה של תפוקה גבוהה. משתמשים צריכים לבדוק נוגדנים מספקים שונים ושיטות הכנה לדוגמה עבור חלבון היעד לפני ביצוע הקרנה בקנה מידה גדול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Separation kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>SM-W004</td>
			<td>Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3000G Thermocycler</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FTC3G/02</td>
			<td>We used this thermocylcer for heating the sample mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse detection kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>042-205</td>
			<td>Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>22309-1-AP</td>
			<td>Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody</td>
			<td>CosmoBio-USA</td>
			<td>TIP-PTD-P02</td>
			<td>Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit detection kit</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>DM-001</td>
			<td>Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TDP-43 (pan) antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10782-2-AP</td>
			<td>Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass for SimpleWestern (SW)</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>Ver.4.0.0.</td>
			<td>Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator; Model100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625004</td>
			<td>Model# 5810 with swinging plate bucket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wes analyzer</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td>55892-WS-2203</td>
			<td>Performs the capillary gel electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of capillary electrophoresis immunoassay to search for potential biomarkers of amyotrophic lateral sclerosis in human platelets

הטיפול החיסוני נימי (CEI), הידוע גם בשם הטכנולוגיה המערבית קפילר, הופך לשיטה של בחירה עבור מחלות סינון חלבונים רלוונטיים ותרופות בניסויים קליניים. הניתן לגילוי, רגישות, נפח קטן לדוגמה דרישה, נוגדנים ריבוב עבור תוויות חלבון מרובות במדגם זהה, אוטומטי היכולת תפוקה גבוהה לנתח עד 24 דגימות בודדות, ואת הדרישה זמן קצר להפוך CEI יתרון על שיטת החיסוני המערבית הקלאסית. ישנן מספר מגבלות של שיטה זו, כגון חוסר יכולת לנצל ג'ל מעבר צבע (4% – 20%) מטריצה, רקע גבוה עם דגימות ביולוגיות מזוקק, וחוסר זמינות מסחרית של ריאגנטים בודדים. נייר זה מתאר שיטה יעילה להפעלת CEI בקביעת מספר רב של מיטוב, אופטימיזציה של ריכוז החלבון והנוגדן הראשוני בצלחת הספק, ומספקת תבניות ידידותיות למשתמש להכנה לדוגמה. גם תיאר הן שיטות למדידת פאן TDP-43 ו-TDP זרחני-43 נגזרות של טסיות ליפוסט, במסגרת היוזמה בפיתוח ביוארקר דם מבוסס על מחלות ניווניות.

אופטימיזציה של ריכוז החלבון cytosolic של טסיות ונוגדן העיקרי טיטור חשוב להקים טווח דינמי ליניארי של חלבונים ציטוסולטליים בתוך הסדר, מאז שינויים באות הם יחסיים ישירות שינויים בחלבון ציטוזול טסיות. שימוש בתערובת טסיות ליפוסט שלמה בתוך ה, עשוי להפחית את עוצמת האות של חלבונים היעד (TDP-43 ו P (S409-412) TDP-43) ולתרום לאות ברקע גבוה. לכן, באותו מקרה, שימש הסופרנטאנט הברור (שבר ציטוסולג) לאחר טסיות דם (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig02v2.jpg"> איור 2: בהירות האות תלויה באיכות המדגם. (A) שלמות טסיות ליפוסטהומוטה מפריעה עם ANTI-tdp-43 נוגדן כריכת; לפיכך, מומלץ לצפות באלקטרופגרמה רועשת. (ב) שבריר של טסיות דם ציטוזה התקבל מתוך הצנטריפוגה את כל הליפוסט למטה (16,000 x g עבור 30 דקות). רוב החלבונים הקרומי הוסרו; מכאן, anti-TDP-43 נוגדן הכריכה כדי TDP-43 חלבון היה משופר (מעקב קו כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טווח דינמי ליניארי עבור ריכוז חלבון ציטוקי טסיות הוקמה בשנת 0.2 – 0.8 mg/mL. תבנית של שיטת הפעולה אומצה כך שריכוז החלבונים והנוגדן העיקרי הצליחו להתבצע באותו מבחן (איור 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig03v2.jpg"> איור 3: טווח דינמי ליניארי לריכוז החלבון הציטומי טסיות. (א) גם ריכוזי החלבון והנוגדנים בנוגדן היו ממוטבים בצלחת אחת במהלך אותה הפעלה. (ב) טווח עבודה ליניארי (0.2 – 0.8 מ"ג/mL) עבור חלבון הוקמה. לטעון חלבון 0.5 mg/mL היה מתויג על ידי נוגדן בתור שליטה חיובית (קפילר 25). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig3alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
יצוין כי תוכן גליצרול בצינור ההכנה לדוגמה צריך להיות פחות מ -20% (הסופי), אחרת ריכוז גלירול גבוה יהיה להשפיע לרעה על כריכת הנוגדן העיקרי.
קביעת זמן חשיפה אופטימלי בגירסה הישנה יותר של התוכנה, זמן החשיפה האופטימלי היה צריך להיקבע על ידי התוויית אזור שיא נגד ריכוז חלבון (mg/mL). הגירסה החדשה מספקת כלי חדש בשם פרופיל הזיהוי של טווח דינמי גבוה (HDR) (איור 4). באמצעות הפאנל התמונה סיפק את האפשרות להציג את כל זמני חשיפה (כלומר, 5 s, 15 s, 30 s, 60 s, 120 s, 240 s, 480 s) יחד. תוכנת מחשב ניתח את כל זמני החשיפה וזיהה אוטומטית את זמן החשיפה הטוב ביותר (HDR). פרופיל זיהוי HDR נמסר טווח דינמי רחב באופן משמעותי עקב רגישות גבוהה יותר של CEI, כלומר יותר איתור וכימות מעל טווח ריכוז גדול יותר לדוגמה. עם זאת, למשתמשים עדיין יש את האפשרות לבחור כל זמן חשיפה העונה על המטרה הניסיונית. באמצעות תכונה זו, זמן חשיפה מיטבי נמצא עבור TDP-43 חלבון. השיא מייצג את זמן החשיפה האופטימלי (איור 4א). זמן חשיפה אחת (4 s) הוגדרה עבור נוגדן זה לאחר סקירת כל תשע פעמים חשיפה הנע בין 1 – 512 s (איור 4ב).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig04v2.jpg"> איור 4: פרופיל זיהוי טווח דינמי גבוה (HDR) עבור חלבון יעד. (א) tdp-43 השיא חלבון מייצג את זמן החשיפה האופטימלי עבור חלבון היעד. a-TDP-43 Ab טיטור היה 1:300, ואת הריכוז החלבון ציטוזול חלבונים היה 0.5 mg/mL. הקו הכחול המוגדר על-ידי התוכנה מציין את זמן החשיפה האופטימלי. (ב) איור זה מייצג זמן חשיפה יחיד המוגדר על-ידי המשתמש (4 s) לאחר סקירת כל תשע זמני החשיפה הנע בין 1 – 512. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig4alarge.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
TDP-43 רמות בציטוסול טסיות האדם של מטופלים ALS התפתחות בדיקת דם. בסיסית בוצעה באמצעות תנאי שימוש ממוטבים, שברים טסיות דם ליפוסט מושגת מחולים ALS נותחו באמצעות שני סטים של נוגדנים (כלומר, anti-TDP-43 [פאן] נוגדן, נוגדן המכיר נגזרות זרחנים של TDP-43 חלבון; כאן, a-P [S409/410-2] TDP-43 היה בשימוש). בהפגנה זו, TDP ספציפי למחלות-43 ו נגזרת זרחתיה שלה מוצגים (איור 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig5a.jpg"> איור 5: ייצוג של ערך זירחון חזוי (PPV) של TDP-43. הכמות המוחלטת של TDP זרחני-43 ופאן TDP-43 לבדו לא הראה הבדל רב בין ה-ALS לבין קבוצות בקרה. עם זאת, PPV הצביע על עלייה קלה הקבוצה של ALS, למרות שלא היה הבדל סטטיסטי בין שתי הקבוצות עקב מספר מספיק של נושאים (ALS = 25, שליטה = 27). ערך d של כהן נמוך בין האמצעי של ALS וקבוצת בקרה הראה גודל השפעה נמוכה בין שתי הקבוצות בשל גודל מדגם קטן (בקרה = 25, ALS = 27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig5alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סך TDP-43 היה כימות באמצעות עקומת הכיול (איור 6)
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig06v2.jpg"> איור 6: עקומת כיול סטנדרטית. רקומביננטי TDP שנרכשו מסחרית-43, ריכוזי חלבון שימשו כדי לבנות עיקול רגיל. כל אחד מהנתונים מייצג את הממוצע של מטריפליטים. עוצמות הכוונות של החלבון היו תלויות בריכוז (שיבוץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig6alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הקוונפיקציה של TDP זרחתית-43 חלבון לא היה אפשרי עקב חוסר זמינות מסחרית של חלבון זה. במקום זאת, ערך זירחון חזוי (PPV) הוקם המגדיר את אחוז מינים זרחניים של TDP-43. PPV נקבע משני מסכים רציפים לדוגמה באמצעות המשוואה הבאה.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60638/60638equ01B.jpg">
שינויים בשיטת הניהול הפנים-פנימית נבדקו בתוך שברים של טסיות דם אנושיים (איור 7)
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig07v2.jpg"> איור 7: וריאציות של שינויים. (א) שני נימים טעונים באותה דוגמית נותחו על ידי cei, וריאציה של שיטת הפעלה פנימית חושבה כ-CV% = 14.9. (ב) מדגם זהה נותח בשלושה ימי שינוי שונים ובשלוש מריצות שונות. וריאציה של שיטת ההפעלה הבין-הפעלה חושבה כ-CV% = 18.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig7alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
למרות שערכים וריאציות של מקדם הפעלה (CV-to-נימי) מקדמי של ערכי וריאציה נפלו בטווח המקובל (14.9% =), ערך השיטת הניהול הבין-מופעל היה גבוה יחסית (CV% = 18.7). מפורש כי וריאציה זו עשויה להיות עקב שימוש במחסניות קפילר ולדוגמה צלחות מהמון שונים. מומלץ לבצע מחקרים הניתנים לביצוע ברכיבי CEI בעלי מספר מאוד זהה.
טבלה 1: שיטת הטעינה של לוח הבסיס של cei. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60638/Table_1_Wes_Assay_Layout_single_sheet.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a>
טבלה 2: תבנית אינטראקטיבית להכנת תערובת לדוגמה. לאחר הזנת הריכוז חלבון מניות מדגימות לא ידועות, תאים אינטראקטיביים יחשב באופן אוטומטי כמה נפח צריך לשמש להכנת מיקס לדוגמה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60638/Table_2_Wes_Assay_Sample_mix_preparation_template_UD.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets at JoVE.com

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

בדיקות דם מבוססות עבור מחלות ניווניות חיוניים ליישום מחקרים קליניים בקנה מידה גדול. בדיקת דם אמינה ומאומתת צריך לדרוש נפח דגימה קטן, כמו גם להיות שיטת דגימה פחות פולשנית, במחיר סביר, והניתן לקריאה. נייר זה מדגים כי התפוקה הגבוהה של אלקטרופורזה באמצעות נימי הכוח מספקת את הקריטריונים להתפתחות ביואלית פוטנציאלית.

שימוש של אלקטרופורזה נימי הנוגדנים כדי לחפש בסמנים פוטנציאליים של טרשת Amyotrophic לרוחב בטסיות האדם

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייעל הן ריכוזי חלבון ונוגדנים ראשוניים בצלחת בדיקה אחת, ולבצע שתי בדיקות באמצעות הכנת מדגם יחיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת 2 1/2 ימים של עבודת מעבדה כולל ניתוח נתונים, להסתיים בתוך 3 1/2 שעות. טכניקה זו מספקת פורמט מבחני תפוקה גבוהה לפיתוח סמן ביולוגי מבוסס דם עבור ALS והיא שיטה אידיאלית לביצוע ניסויים קליניים גדולים.שיטה זו יכולה לספק תובנה לפרופילי חלבון היעד במהלך פרוגנוזה של המחלה והוא יכול להקל על ניטור ההשפעות של תרופות של ניסויים קליניים מעניינים. לאחר איסוף 100 microliters של lysates טסיות אנושיות של חולי ALS ונושאים בריאים, למלא תבניות שנוצר בבית עבור הפריסה נימי הכנת מדגם. טבלת ההכנה לתערובת לדוגמה היא דינמית ותחשב באופן אוטומטי כמה נפח יש להסיר מהמקור.שים את כל הראיגנטים על הקרח. מלבד החבילה הסטנדרטית, שאמורה להישאר בטמפרטורת החדר. כדי להכין את תערובת האב הפלואורסצנטי, להוסיף 40 microliters של מים deionized לצינור ברור של DTT, ולהוסיף 20 microliters של מאגר מדגם 10X.ו-20 מיקרוליטרים של תווי DTT מוכנים של 400 מילימולרים לצינור הוורוד מהתכונה. כדי להכין את הסולם biotinylated, להוסיף 16 microliters של מים deionized, שני microliters של חיץ מדגם 10X ושני microliters של 400 מילימולר מוכן פתרון DTT לצינור הלבן המסופק בערכה. לאחר ערבוב עדין, להעביר את פתרון הסולם לתוך צינור PCR 200 מיקרוליטר לפני denaturing.הוסף 1.5 מיקרוליטר של חיץ מדגם 10X ו 148.5 microliters של מים deionized לצינור מיקרוצנטריפוגה 600 microliter ומערבולת לערבב, לפני הנחת הצינור על קרח. מוסיפים את הנוגדנים המעניינים ישירות את הדילואנט כפי שצוין בטבלה ושטפו את קצה הפיפס מספר פעמים בתת פתרון נוגדנים הומוגני. כדי להכין את תערובת מדגם נימי, לפתוח את כל צינורות PCR ולהוסיף 1.6 aliquots microliter של מאגר מדגם 5X פלואורסצנטי לכל צינור כפי שצוין בטבלה באמצעות טכניקת צינור הפוכה.סוגר מיד כל צינור עם הוספת המאגר. כאשר כל המאגר נוסף, פתח את כל הצינורות והוסף מאגר מדגם 0.1X באמצעי אחסון כפי שמצוין בטבלה, מיד סוגר כל צינור בעת הוספת המאגר. לאחר מכן, לפתוח את כל הצינורות ולהוסיף את דגימות החלבון כפי שצוין בטבלה מיד לסגור כל כובע צינור.כאשר כל הדגימות נוספו, בקצרה צנטריפוגה כל הצינורות בצנטריפוגה ספסל. מערבולת לערבב צנטריפוגה הדגימות שוב. בסוף הצנטריפוגה השנייה, מניחים את כל הצינורות לתוך תרמוסיקלר עם מכסה מחומם.ולתפור את הדגימות בתנאים שצוינו. בסוף denaturation, צנטריפוגה, לערבב צנטריפוגה הדגימות שוב למקם את כל הצינורות במתלה צינור על קרח. באמצעות הדמות כמדריך, להוסיף 10 microliters של חזרת סטרפטוודין peroxidase גם D1, 10 microliters של הנוגדן המשני המתאים בארות D2 עד D5, 10 microliters של דילואנט נוגדנים לכל באר בשורה B וגם C1, 10 microliters של הנוגדן העיקרי המתאים בארות C2 עד C25, חמישה microliters של סולם biotinylated מצינור PCR מספר אחד גם A1 שלושה מיקרוליטרים של מדגם לשורות A2 עד A25 ו 15 microliters של חמצן luminol מוכן טרי לכל באר של שורה E.Pipetting תערובת המדגם ואת reagent לתוך הבאר הזעירה בסדרים הנכונים הוא קריטי להצלחת הניסוי, ולכן זה צריך להיעשות בזהירות רבה.לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה לכל מאגר כביסה ייעודי היטב. ולסובב את תכולת הצלחת על ידי צנטריפוגה. כדי לבצע את הניתוח נימי על צלחת בדיקה, לחבר את מנתח נימי למערכת המקוונת ולחץ על מכשיר להתחבר בתוכנת המנתח.בחרו במספר הסידורי של הכלי בתפריט הנפתח ולחצו על 'התחבר'. בחר את הכרטיסיה Assay ובחר הצגה חדשה, הזן את הפרמטרים של ההתנסויות ושמור את שם הקובץ ואת המיקום. לאחר מכן ודא כי המחוון הכחול המהבהב במנתח הוא כחול מלא ולהסיר את מחסנית נימי מאריזתו.מוציאים את החותם המגן מצלחת ההתבונןות החזותית בארות מלאות מראש עבור בועות אוויר. מניחים את לוחית ההצבה במחזיק הצלחת ומחזיקים את מחסנית הנימים בזווית, מכניסים את המחסנית לחריץ נימי וסגרו את דלת המנתח. לאחר מכן לחץ על התחל בתוכנת המנתח.השימוש בתערובת ליזאט טסיות שלם בבדיקות עשוי להפחית את עוצמת האות של חלבוני היעד ולתרום לאות רקע גבוה. לכן, בהסטה זו, על טבעי ברור שימש לאחר קרע טסיות הדם. טווח דינמי ליניארי לריכוז חלבון ציטוסול טסיות הדם נקבע על 0.2 עד 0.8 מיליגרם למיליליטר, ותבנית חיבור אומצה כך שגם ריכוז החלבון וגם טיטרציה הנוגדן העיקרית הצליחו להתבצע בהקשה אחת.פרופיל זיהוי הטווח הדינמי הגבוה מספק טווח דינמי רחב משמעותית בשל הרגישות הרבה יותר של בדיקת נימי, וכתוצאה מכך זיהוי וכמות טובים יותר על פני טווח ריכוז מדגם גדול יותר. ניתן גם להגדיר זמני חשיפה אישיים. באמצעות תנאי הבדיקות האופטימיים, ניתוח זה של שברים ציטוסוליים lysate טסיות הדם המתקבלים לחולי ALS באמצעות שתי קבוצות של נוגדנים מאפשרים זיהוי של TDP-43 ספציפי למחלה ונגזרת הזרחן שלה בתוך הדגימות.לאחר מכן ניתן לכמת את ה- TDP-43 הכולל באמצעות עקומת הכיול. והמגוון הבין-מנוהל נבדקו בשברים ציטוסוליים של טסיות הדם האנושיות של ALS. שיטה זו מאפשרת שימוש בנוגדנים ראשוניים, ומאפשרת זיהוי של עד חמישה חלבוני מטרה שונים בתוך אותה דגימה בהקלה אחת.לא רק שטכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן ניתוח החלבון, היא דורשת נפחי דגימת מיקרוליטר ומייצרת תוצאות עם רמה גבוהה של רבייה. חלק מהכימיקלים המשמשים בהכאה זו וכל הדגימות האנושיות נחשבים biohazardous, ולכן ציוד מגן אישי מתאים תמיד יש להשתמש בעת ביצוע ניסויים אלה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

How to Create and Use Binocular Rivalry

איך ליצור ולהשתמש היריבות המשקפת

Each of our eyes normally sees a slightly different image of the world around us. The brain can combine these two images into a single coherent ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

מדידת נכות נוירולוגית מתקדמת עכבר דגם של טרשת נפוצה

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

הערכה של דופאמין הומאוסטזיס בעכברים באמצעות ניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית, דופמין Synaptosomal ספיגת

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

חקר החלל העמוק - לחשוף את האנטומיה של מבנים Periventricular כדי לחשוף את החדרים הצדדיים של המוח האנושי

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

השימוש ב Vivo הקלטה חד-סיבים ושורש השורש שלמות עם העצב מוצמד לבחון את המנגנון של כשל הולכה

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

שלאחר המוות תוכנית מקיפה עבור אנשים עם טרשת נפוצה

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Event Related Potentials (ERPs) and other EEG Based Methods for Extracting Biomarkers of Brain Dysfunction: Examples from Pediatric Attention Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD)

Event Related Potentials ERPs and other EEG Based Methods for Extracting Biomarkers of Brain Dysfunction: Examples from Pediatric Attention Deficit/Hyperactivity Disorder ADHD

פוטנציאל הקשורים לאירועים (ERPs) ושיטות אחרות EEG מבוסס על חילוץ ביופסים של המוח בתפקוד: דוגמאות מטיפול רפואי הפרעות קשב/היפראקטיביות (ADHD)

Neuropsychiatric diagnoses like ADHD are based on subjective methods like interviews, rating scales and observations. There is a need for more brain-based ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...