Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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作者希望感谢三星科技集团为具有代表性的结果提供生物标本，以及共同因素基因组学的整个分子、分析、产品和商业团队，以表彰他们的技术专长和支持。

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	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

所有作者都受雇于共同因素基因组公司，该公司开发和生产免疫普原试剂试剂盒和信息学工具在本文中使用。免疫Prism测定仅供研究使用，不用于诊断程序。

该协议需要20纳克完整或40纳克高降解（FFPE）RNA。RNA样品应不含DNA、盐（如Mg2+或二元盐）、二价阳合剂（如EDTA、EGTA、锡酸盐）或有机物（如酚和乙醇）。不建议继续进行具有 DV200 <20% 的 RNA 样本。强烈建议使用试剂盒内控制RNA，因为这些控件提供了一种评估整个协议性能的方法，从库制备到分析。
该协议设计为使用 0.2 mL PCR 带管执行。如果愿意，也可以使用96孔PCR板中的井执行该协议。只需使用 96 孔 PCR 板的孔代替 PCR 管或带管的所有参考。仅使用带有透明孔的 PCR 板，因为在珠子净化和洗涤步骤期间，目视确认珠子完全重新悬浮至关重要。
在整个协议中，除非另有说明，否则将试剂冷冻或放在冰上。在试剂完全解冻之前，请勿使用试剂。使用前，请务必彻底混合所有试剂。
将酶保持在-20°C，直到准备好使用，使用后迅速返回到-20°C。仅使用分子级无核酸酶水;不建议使用DEPC处理的水。移液混合时，轻轻吸气并分配至少总体积的50%，直到溶液充分混合。移液器混合所有含有酶的主混合物。使用涡旋混合酶可能导致变性，并损害其性能。在珠子纯化过程中，使用分子级乙醇中新鲜制成的80%乙醇溶液。使用不新鲜的乙醇溶液可能会导致产量降低。避免过度干燥珠子，因为这样会降低洗脱效率（如果珠子干燥，看起来会裂开）。
如步骤 10 中所述，每个反应中都会添加唯一的索引引出。根据这些索引的顺序，对于低级多路复用，某些索引组合是最佳的。这些索引的序列是数据后排序的解数化所必需的。补充表3提供了序列和推荐的多路复用组合。在同一步骤中，必须注意，推荐的PCR周期数量因使用的RNA质量而异，并且可能需要一些优化来防止PCR过度扩增。对于免疫Prism控制RNA和其他高质量RNA，开始优化与10PCR周期。对于免疫Prism FFPE控制RNA和其他高降解/FFPERNA，开始优化与15PCR周期。建议使用要分析的材料的RNA代表生成测试库，以优化PCR周期。应使用一致产生足够预捕获库产量（>200 ng）的最小 PCR 周期数。生物分析仪追踪图上约1000 bp的二次峰值表示过度放大（图4）。应尽量减少过度放大，但小次峰的存在不会干扰检测结果。
为了尽量减少样品损失和避免开关管，步骤13可以在PCR管、带状管或96孔PCR板中执行，而不是1.5 mL微管，如果您的真空集中器允许的话。转子可以在许多集中器上拆下。这使得带材管或板能够安装在真空中。然后，可以使用无离心的水干燥设置运行真空浓度。有关您的真空集中器的说明，请参阅手册。如果样品在带状管或96孔板中干燥，杂交步骤可以在同一容器中执行。
在步骤 17 期间，确保每 10-12 分钟涡旋一次，以提高珠子捕获效率。混合时，小心地握住暖带管的盖，以防止管打开。
步骤 18 中描述的清污对于避免高非特定污染至关重要，必须密切遵循。确保每次清洗时完全重新悬浮珠子，完全去除洗涤缓冲液，在洗涤缓冲液 2 洗涤过程中，将样品转移到新鲜的带管中（步骤 18.6.5）。确保链球菌珠在整个孵育过程中完全重新悬浮并保持悬浮状态。溅到管盖上不会对捕获产生负面影响。在室温下液中，微板涡旋混合器可用于在两分钟的孵育期内涡旋样品，以便更容易再悬浮。不要让链球菌珠干涸。如果需要，在缓冲液中延长孵育，以避免珠子干燥。如果使用多个带状管，则每次清洗时使用一条管，而另一个带管则位于热循环器中。这可以帮助避免过度干燥珠子或冲，导致不良的重新悬浮或其他次优技术。对于首次用户，不建议一次处理超过 8 个库反应。
当前的免疫分析技术提供了一系列信息 - 从数千个需要重要解释（RNA测序）的数据点到单个离散数据点（单丛IHC）。此处描述的协议表示一种位于中间位置的方法，其集中范围可实现高灵敏度，但仅捕获临床相关转录组数据的子集。由于散装RNA提取的性质，该协议不提供有关免疫细胞和肿瘤微环境之间的空间关系的信息，但是，结果可以补充成像技术来添加这些信息。该协议生成的数据有无数的应用，因为关于癌症作为一种疾病的生物学和正在开发的治疗它的疗法，有许多值得学习的知识。如代表性结果所示，个人免疫报告有助于了解患者的免疫状况如何因疾病进展或治疗等事件而发生变化。虽然这里提供的结果提供了一些示例用例，但其他应用，包括调查治疗的作用机制和识别临床结果的假定生物标志物，如无进展和整体生存也实际。在生物标志物发现应用中使用该协议时，必须实践良好的研究设计，以确保分析同质种群，包括足够的样本，用于统计能力，并考虑偏置源。由于测定的集中性、流线型，因此，一旦发现这些生物标志物，就有可能实现临床验证和下游应用。

肿瘤渗透淋巴细胞（TILs）和其他免疫相关分子在形式固定和石蜡嵌入（FFPE）固体肿瘤人体组织样本的定量在临床研究1、2、3中已显示出价值。流动细胞学和单细胞核糖核酸（RNA）测序等常用技术对新鲜组织和血液4有用，但由于无法产生可行的细胞悬浮液，因此不适合分析FFPE材料。目前用于量化FFPE组织中这些细胞的方法面临重大挑战。免疫组织化学（IHC）和其他类似的成像工作流程需要特定的抗体来检测细胞表面蛋白，这在实验室中很难标准化，以实现可重复的定量5。诸如nCounter系统等平台依靠单一基因的表达来定义关键的免疫细胞6，限制了检测的敏感性和特异性。更通用的RNA测序方法，加上独立的软件工具，是可用的，但在使用7，8，9，10，11，12之前需要显著的优化和验证。激光捕获微分体（LCM）与FFPE组织RNA测序相结合的最新进展已显示出希望;然而，一个更高的通量，交钥匙的解决方案是需要的翻译研究，旨在识别强大的生物标志物13，14。在精密医学和免疫治疗时代，能够定义患者队列（包括治疗反应者、癌症亚型或具有高预测准确性和统计意义的生存结果）的多维生物标志物的方法变得越来越重要。
为了满足这一需求，开发了一种免疫分析测定，利用标准化的RNA测序试剂和基于云的信息学，使固体肿瘤FFPE组织中免疫细胞的敏感和特异性定量。除了容纳来自FFPE组织的降解RNA外，该协议还能够容纳从限制组织样本（如核心针头活检、针吸气和微或宏观解剖组织）衍生的RNA。将每个样本的RNA数据与免疫细胞的基因表达模型数据库进行比较，该数据库称为免疫健康表达模型，以量化免疫细胞占样本中总细胞的百分比。简单地说，这些模型是使用机器学习方法构建的，从纯化免疫细胞群（使用规范细胞表面标记分离的分离）生成全转录组数据中识别独特的多基因表达模式（使用规范细胞表面标记）17、18。该技术基础的多维健康表达模型使测定能够将每个免疫细胞量化为异质混合物中总细胞的百分比。这使得研究人员能够生成样本间和样本内免疫细胞的比较，这已被证明具有临床价值19，20。其他应用包括免疫反应治疗前和治疗后定量，如代表性结果所述。测定报告肿瘤和肿瘤微环境免疫结合的多种特征，包括八种免疫细胞类型的绝对百分比（来自基因表达模型）：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD56=自然杀伤细胞、CD19+ B细胞、CD14+单核细胞、Tregs、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。此外，测定报告10个免疫逃逸基因的表达（以千万分之一转录或TPM计算）：PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、TIM-3、BTLA、ICOS、CD47、IDO1和ARG1。
试剂试剂盒用于根据基于混合捕获的库制备方法，在Illumina平台上建立高质量的库，以便进行测序，如图1所示。如果研究人员在实验室中没有Illumina测序平台，他们可以将样品提交核心实验室进行测序。生成后，测序数据将上载到棱镜门户进行自动分析，并将以免疫报告（图 2A）的形式为每个样本返回一个全面的定量配置文件。用户还可以在棱镜门户中定义样本分组以生成生物标志物报告（图2B），突出显示区分两个患者群组的统计显著性生物标记。重要的是，试剂盒生成的数据仅供研究使用，不得用于诊断目的。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> 图 1：工作流概述。在此协议中，RNA首先转换为cDNA。测序适配器被连带，适配器连带的cDNA被PCR放大和条形码，以创建预捕获库。然后，生物素化探针杂交到特定的cDNA靶点，然后用链球菌珠捕获。未绑定、非靶向的 cDNA 通过洗涤去除。最终的 PCR 扩充产生一个后捕获库，可以进行测序。*总RNA必须来自人体样本;可能是完整或降解 （FFPE） RNA。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> 图2：代表性免疫报告。工作流生成两个报告， 每个处理的样本的单个免疫报告 （A）， 和生物标记报告 （B） 为定义的患者队列.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
该协议需要大约16小时的制备时间（从总RNA到准备测序的库）;但是，正如协议中所述，有许多可选的停止点。该测定利用转录组学的丰富、动态特性，从传统的单分析物生物标记物转向多维基因表达模型，从而实现具有标准化的组织样本的全面生物特征试剂和易于使用的软件工具。它使研究人员能够利用机器学习和健康表达模型数据库，在自己的实验室中利用当代技术，从而获得更准确、定量的珍贵临床样本免疫配置文件，并发现具有全面统计分析的多维RNA生物标志物。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

免疫疗法在肿瘤患者的治疗中显示出希望，但肿瘤微环境的复杂异质性使得预测治疗反应具有挑战性。解决肿瘤组织内和周围免疫细胞的相对群体的能力已被证明与理解反应在临床上相关，但受到流式细胞学和免疫组织化学等传统技术的限制（IHC），由于需要大量的组织，缺乏准确的细胞类型标记，以及许多技术和后勤障碍。一种测定（例如，免疫Prism免疫分析分析）通过容纳少量RNA和高降解RNA（从临床存档的固体肿瘤组织中提取的RNA的常见特征）克服了这些挑战。该测定通过试剂盒和基于云的信息学进行访问，为Illumina测序平台提供端到端定量、高通量免疫分析解决方案。研究人员从只有两个部分的形式固定石蜡嵌入（FFPE）组织或总RNA的20-40 ng（取决于样品质量），该协议生成免疫配置文件报告量化8个免疫细胞类型和10个免疫逃生基因，捕捉肿瘤微环境的完整视图。无需额外的生物信息分析即可利用所得数据。使用适当的样本队列，该协议还可用于识别患者感兴趣群体中具有统计意义的生物标志物。

在整个协议中有许多检查点，使用户能够评估生成的材料的质量和数量。按照协议中描述的步骤 12，生成电象图，如图3所示，代表完整RNA样本的典型预捕获库（RIN = 7.8）。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> 图3：完整RNA样品的典型预捕获库生物分析仪迹。预捕获库在大小约为 250-400 个碱基对 （bp） 时显示为一个宽峰值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
应注意避免过度放大，如图4所示的约1，000 bp的第二个峰值所示，这是从FFPE RNA样本（DV200 = 46）生成的预捕获库的代表性电检图。如果此峰值相对于主峰值（如图所示约为 250-400 个碱基对 （bp）））较小，则不会影响下游步骤或分析。如果第二个峰值相对于 250-400 bp 峰值较大，则可以用更少的 PCR 周期重新制作预捕获库，以减少过度放大。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> 图4：FFPE RNA样品的典型预捕获库生物分析仪跟踪。第二个峰值在1，000 bp附近，表明过度放大。如果此峰值相对于主峰值在 250-400 bp 附近较小（如图所示），则不会影响下游步骤或分析。如果第二个峰值相对于 250-400 bp 峰值较大，则可以用更少的 PCR 周期重新制作预捕获库，以减少过度放大。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
如步骤 12.1.3 中所述，应评估适配器二聚器的存在，以确定是否需要进行额外的清理。图5所示的电表图代表不可接受的（图5A，DV200=33）和可接受的（图5B，DV200=46）的适配器二分器水平，显示为128 bp左右的尖峰。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> 图 5：预捕获库生物分析仪跟踪。适配器二聚体以大约128 bp.（A） 的尖峰出现， 电表图中存在过多的适配器二聚体.（B） 可接受的适配器二聚位器水平在此跟踪中描述。这两种痕迹都显示出轻度过度扩增的证据，但这不应干扰免疫Prism测定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
在协议完成之前，在测序之前，使用数字电泳再次评估最终库。由 FFPE RNA 制成的文库的平均大小分布往往小于由完整 RNA 制成的文库。对于完整的RNA样本，结果的跟踪应类似于图6（RIN = 9.5）。对于降解或 FFPE RNA，生成的跟踪应类似于图 7（DV 200 = 36）。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> 图6：完整RNA样品的典型最终库生物分析仪迹。最终库在大小约为 250-400 个碱基对 （bp） 时显示为一个宽峰值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> 图7：FFPE RNA样品的典型最终库生物分析仪跟踪。由 FFPE RNA 制成的文库的平均大小分布往往小于由完整 RNA 制成的文库。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
如上所述，使用该协议生成的结果可能以两种关键方式应用，如图8所示。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> 图 8：协议的两个用例。此免疫分析测定产生的结果应用于两个关键的转化应用。（A） 第一个用例从人体固体肿瘤组织（包括FFPE档案）开始，为样本生成单独的免疫配置文件。（B） 一旦生成一组人类样本，数据将结合使用棱镜门户生成多维生物标记物和相应的生物标志物报告。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
为了演示每个用例，包含来自小型翻译研究的代表性数据21。本研究中使用的样本是7例诊断和治疗非小细胞肺癌（NSCLC）患者的样本。样本是治疗前和治疗后活检中患者匹配的固体肿瘤组织。首先，对单个样本进行分析以生成免疫配置文件，如图9所示的示例报告。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> 图9：NSCLC样本的个体免疫报告示例。Prism Portal 管道为每个已处理的样本生成图形报告，并在此处为 NSCLC 固体肿瘤样本生成代表性报告。（A） 报告的正面以图形方式描述了从FFPE组织中提取的RNA样本中免疫细胞的分解。（B） 报告的反面包括免疫细胞表（绝对百分比）和逃逸基因表达（以千万分之一转录本或TPM计算），以及测定的性能说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
治疗前和治疗后的免疫图谱可用于了解治疗（化疗或放疗，在这项研究中）如何改变肿瘤微环境。图10显示了一个示例，其中单个患者在化疗前和化疗后显示每个免疫细胞的百分比变化和总免疫含量的变化。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> 图 10：治疗前和后处理结果示例。显示单个 NSCLC 患者从治疗前和治疗后样本生成的单个免疫细胞和总免疫内容数据。在此示例中，患者接受化疗方案作为治疗。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
患者可以按临床结果或表型等标准进行分组进行比较。例如，在图11中，NSCLC研究中的样本根据治疗后疾病进展的时间进行了比较。一部分患者在>18个月内出现疾病复发，另一个子集在+18个月内进展得更快。比较每个样本的中位增量值（治疗前和治疗后值之间的差异），以识别疾病进展的假定生物标志物。
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> 图11：临床结果比较示例。在匹配的治疗前和治疗后NSCLC样本中，免疫细胞百分比之间的定量变化被计算并报告为"delta"值。那些以黄色突出显示的表示出生存状态之间的明确信号变化。蓝色条表示 >18 个月的中值增量值，直到疾病进展，橙色条表示 ±18 个月的中值增量值，直到疾病进展。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
最后，类似的样本分组可用于专门查看预处理样品，通过使用棱镜门户生成生物标志物报告来识别预测性生物标志物。如图12所示，上述相同的临床表型（疾病进展）定义了样本分组。在此示例中，两个免疫逃逸基因被确定为样本分组（CD47 和 OX40，如图12A的下面板所示）的统计显著性区分。在此示例中，由于单个基因生物标志物具有强大的、具有明确的统计意义，多维生物标记物不会增加显著的预测值（如图12B的右上角条形图中标记的 ImmunoPrism）。完整的数据表，包括所有18个分析物的测定结果，在报告的反面进行汇总，包括统计分析和简要方法摘要。
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> 图12：NSCLC样品生物标志物报告示例。生物标志物发现管道提供单个生物标志物的可视化报告，以及机器学习多维生物标志物，并详细统计。（A） 在这项研究中，管道确定了两个单独的生物标志物（CD47和OX40），用于确定阈值为18个月的疾病进展。（B） 有关方法及全部结果的详情载于报告的反面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
补充表1：试剂盒材料。列出了免疫公关套件中提供的材料列表，以及制造商协议中引用的部件号。所需所有其他设备和材料均列在"材料表"中。访问<a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/，</a>查看安全数据表 （SDS）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">请点击此处查看此文件（右键单击下载）。</a>
补充表2：热循环器程序。为了便于编程，总结了整个协议中引用的推荐循环程序程序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">请点击此处查看此文件（右键单击下载）。</a>
补充表3：排序索引指南。列出了试剂盒中提供的索引引种;在测序后去复用的每个反应中添加独特的引解剂。还提供推荐的低级多路复用组合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">请点击此处查看此文件（右键单击下载）。</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

通过分子和信息学协议描述使用基于RNA的方法确定固体肿瘤组织的定量免疫特征，并利用临床队列进行免疫肿瘤学生物标志物发现。

固体肿瘤的预测免疫建模

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

肿瘤微环境的综合特征性在免疫肿瘤学研究中至关重要。该检测是首次使用基于RNA的健康表达模型测量实体肿瘤组织的免疫细胞。该检测使研究人员能够获得FFB实体肿瘤组织中免疫背景高度敏感和特异性的测量结果，并将这些结果组合成多维生物标志物。所有的癌症治疗，不仅仅是免疫疗法，在实体肿瘤的位点引起免疫反应。测量这种免疫反应对于了解疾病进展和治疗反应很重要。该协议将传统的RNA库制备技术与目标捕获相结合。虽然耗时，但按照洗涤步骤和按照建议监控质量控制检查点对成功非常重要。对于来自形式固定石蜡嵌入样品的高降解RNA，根据表在冰上组装第一股合成反应。在微离合中短暂地旋转样品之前，通过上下移液多次，彻底混合反应。离心结束时，立即将样品放入表上程序 3 的预热热循环器中。对于高质量完整的RNA，将第一股合成反应组装在冰上，如表中所述的无核酸酶PCR管。为了开始这个程序，将感兴趣的条形码库的200纳米与两微克的COT-1 DNA和两微升的阻尼糖在无核酸酶管中。然后使用设置为 30 至 45 摄氏度的真空浓缩器干燥管内装物。杂交后，从热循环器中去除样品，将热循环器设置为 65 摄氏度，加热盖设置为 70 摄氏度。使用多通道移液器将 17 微升完全均质的珠子转移到样品中，移液器可上下 10 次。要将DNA与珠子结合，请按照程序10将管放入热循环器中，每10至12分钟短暂取出一根剥离的管子，进行三秒钟的温和涡旋，以保持珠子的重新暂停。在结合孵育后，立即从热循环器中去除一条管，并将 100 微升预热洗涤缓冲液一个添加到管中。移液器彻底上下10次，将管子放在磁架上，使珠子在吸出含有上清液的未绑定DNA之前，与洗涤溶液完全分离。从机架上取下管子，加入 150 微升预热严格洗涤缓冲液，并彻底混合，以完全重新暂停珠子，避免气泡。将管子在 65 摄氏度下放回热循环器中 5 分钟，然后将管子放回磁架，使磁珠与超自然完全分离。丢弃含有超级纳酸剂的未绑定DNA，再次用预热的严格洗涤缓冲液清洗珠子，就像刚刚演示的总共两次严格洗涤一样。最后一次洗涤后，取出上经剂，并在管中加入150微升室温洗涤缓冲液。移液洗涤10至20次，以完全重新暂停珠子，并用盖子密封孵育样品两分钟，在涡流之间交替30秒，休息30秒。在孵化结束时，将离心机短暂地放在磁架上，并在磁珠完全粘附到磁铁上后取出上流液。在盖关闭时将管短暂离离，然后将样品返回磁架。使用 10 微升移液器去除任何残留洗涤缓冲液，并添加 150 微升的室温洗涤缓冲液 2。移液洗涤10至20次，以完全重新暂停珠子，并用盖子密封两分钟孵育样品，在涡流之间交替30秒，休息30秒。短暂离心后，将每个管的整个珠子体积转移到干净的无核酸酶 PCR 管中，然后将管放到磁架上。丢弃含有超自然物质的未绑定DNA后，再次短暂地将样品离心，并使用10微升移液器在磁架中去除珠子上残留的洗涤缓冲液。将 150 微升的洗涤缓冲液三个添加到管中，并上下移液器 10 到 20 次，以完全重新填充珠子。在短暂离心前，在30秒的温和涡旋和30秒的休息之间孵育管子两分钟。将管子放在磁架上，以吸入超极物，并再次短暂地将珠子样品离心。使用 10 微升移液器在磁架中去除磁珠中残留的洗涤缓冲液，然后从机架上取出管子，然后每管将珠子重新悬浮在 20 微升无核酸酶水中。然后移液珠子10次，以确保任何珠子卡在管的一侧已重新暂停。应评估适配器二丁首先是否存在，以确定是否需要进行其他清理。例如，此电图显示可接受的适配器二丁二百，该调子在 128 个基对附近显示为锐峰，而此电图显示适配器二丁车的不可接受的水平。治疗前和治疗后免疫特征可用于了解特定治疗对肿瘤微环境的影响，如在此代表性分析中，每个感兴趣的免疫细胞的百分比变化和总免疫含量显示单个患者的化疗前和化疗后。在这项分析中，根据患者组之间的样本与治疗后疾病进展的时间进行比较。一部分患者在18个月后出现疾病复发，而另一部分在18个月或更小期间进展较快。然后可以比较每个样本的中位增量值，以确定疾病进展的应定生物标志物。例如，这里两个免疫逃逸基因被确定为样本分组的统计显著差异。由于单个基因生物标志物具有明显的统计意义，多维生物标志物没有增加显著的预测价值。确保一次进行一条加热洗涤，以防止样品冷却，并记得将珠子转移到新鲜管中，以避免脱靶污染。该协议演示了使用基因表达模型来量化免疫细胞和肿瘤组织。正在开发新的模型来测量细胞状态，如耗尽或激活。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

在固定和活细胞，流式细胞仪测量钙蛋白酶活性

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

科研

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Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

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To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

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