Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Forfatterne ønsker at anerkende TriStar Technology Group for at levere de biologiske prøver til de repræsentative resultater, samt hele molekylære, analyse, produkt og kommercielle teams på Cofactor Genomics for deres tekniske ekspertise og Støtte.

<ol>
	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Alle forfattere er ansat af Cofactor Genomics, Inc., den virksomhed, der udviklede og producerer ImmunoPrism reagens kit og informatik værktøjer, der anvendes i denne artikel. ImmunoPrism Assay er kun til forskningsbrug og er ikke til brug i diagnostiske procedurer.

Protokollen kræver 20 ng intakt eller 40 ng stærkt nedbrudt (FFPE) RNA. RNA-prøven skal være fri for DNA, salte (f.eks. mg2+eller guanidiniumsalte), divalente kationchelatingsmidler (f.eks. EDTA, EGTA, citrat) eller organiske stoffer (f.eks. phenol og ethanol). Det anbefales ikke at fortsætte med RNA-prøver, der har en DV200 <20%. Brug af in-kit kontrol RNA anbefales kraftigt, da disse kontroller giver et middel til at evaluere ydeevnen i hele protokollen, fra bibliotek forberedelse til analyse.
Protokollen er designet til at blive udført ved hjælp af 0,2 ml PCR striprør. Hvis det foretrækkes, kan protokollen også udføres ved hjælp af brøndene i en 96-brønd skrupmaskine plade. Du skal blot bruge brøndene i en 96-brønd PCR plade i stedet for alle henvisninger til PCR rør eller strip rør. Brug kun PCR-plader med klare brønde, da det er afgørende visuelt at bekræfte fuldstændig resuspension af perler under perlerensninger og vasketrin.
Under hele protokollen skal reagenserne holdes frosne eller på is, medmindre andet er angivet. Brug ikke reagenser, før de er helt optøet. Sørg for at blande alle reagenser grundigt før brug.
Hold enzymer ved -20 °C, indtil de er klar til brug og vende tilbage til -20 °C straks efter brug. Brug kun molekylært nuklease-frit vand; Det anbefales ikke at bruge DEPC-behandlet vand. Når pipettering blandes, skal du forsigtigt aspirere og dispensere mindst 50 % af det samlede volumen, indtil opløsningerne er godt blandede. Pipette blandes alle masterblandinger indeholdende enzymer. Brug vortex til at blande enzymer kan føre til denaturering og kompromittere deres ydeevne. Under perlerensninger skal du bruge frisklavede 80 % ethanolopløsninger fra ethanol af molekylær kvalitet. Brug af ethanolopløsninger, der ikke er friske, kan resultere i lavere udbytter. Undgå over tørring af perlerne, da dette kan reducere elution effektivitet (perler ser revnet, hvis over tørret).
Som beskrevet i trin 10 føjes unikke indeksprimere til hver reaktion. Baseret på sekvenser af disse indekser, for lav-niveau multiplexing, visse indeks kombinationer er optimale. Sekvenserne af disse indeks er nødvendige for at demultiplexing dataene efter sekvensering. Sekvenserne og de anbefalede multiplexingkombinationer findes i supplerende tabel 3. I samme trin er det vigtigt at bemærke, at antallet af anbefalede PCR-cyklusser varierer afhængigt af kvaliteten af det anvendte RNA, og nogle optimeringer kan være nødvendige for at forhindre PCR overforstærkning. For ImmunoPrism Intakt Control RNA og andre høj kvalitets-RNA skal du starte optimering med 10 PCR-cyklusser. For ImmunoPrism FFPE Control RNA og andre stærkt nedbrudte/FFPE RNA skal du starte optimering med 15 PCR-cyklusser. Det anbefales at producere et testbibliotek ved hjælp af RNA-repræsentant for det materiale, der skal analyseres for at optimere PCR-cyklusser. Det mindste antal PCR-cyklusser, der konsekvent giver tilstrækkelige forhåndsfangebiblioteksudbytter (>200 ng), bør anvendes. En sekundær top omkring 1000 bp på Bioanalyzer spor er tegn på over-forstærkning (Figur 4). Overforstærkning bør minimeres, men tilstedeværelsen af en lille sekundær top vil ikke forstyrre analyseresultater.
For at minimere prøvetab og undgå at skifte rør kan trin 13 udføres i PCR-rør, strimmelrør eller en 96-brønds PCR-plade i stedet for 1,5 ml mikrorør, hvis vakuumkoncentratoren tillader det. Rotoren kan fjernes på mange koncentratorer. Dette gør det muligt for strimmelrørene eller pladerne at passe ind i vakuum. Vakuumkoncentrationen kan derefter køres ved hjælp af den vandige udtørringsindstilling uden centrifugering. Se vejledningen for at få vejledning i vakuumkoncentratoren. Hvis prøverne tørres ned i strimmelrør eller en 96-brøndsplade, kan hybridiseringstrinnet udføres i samme beholder.
Under trin 17 skal du sørge for at vortex hver 10-12 min at øge perle fange effektivitet. Hold forsigtigt hætterne på de varme båndrør, når de blandes for at forhindre rør i at åbne.
De vasker, der er beskrevet i trin 18, er afgørende for at undgå høj uspecifik kontaminering og skal følges nøje. Sørg for at sætte perlerne helt i stå ved hver vask, helt fjerne vaskebufferne, og under vask buffer 2 vasken overføres prøverne til et frisk strimmelrør (trin 18.6.5). Sørg for, at streptavidin perlerne er helt opslæmes og forbliver i suspension under hele inkubationen. Sprøjt på rørhætterne vil ikke påvirke opfangetagdet negativt. Under rumtemperaturvasken kan der anvendes en mikropladevortexmixer til at vortexere prøverne i hele inkubationstiden på to minutter for lettere resuspension. Lad ikke streptavidin perlerne tørre ud. Hvis det er nødvendigt, udvide inkubationer i buffere for at undgå tørring af perlerne. Hvis du bruger mere end ét strimmelrør, skal du arbejde med et strimmelrør ad gangen for hver vask, mens de andre strimmelrør sidder i termohjulet. Dette kan hjælpe med at undgå over tørring af perlereller farende, hvilket resulterer i dårlig resuspension eller andre sub-optimale teknikker. For første gang brugere, anbefales det ikke at behandle mere end 8 bibliotek reaktioner ad gangen.
Nuværende immunprofileringteknikker leverer et kontinuum af information - fra tusindvis af datapunkter, der kræver betydelig fortolkning (RNA sekventering) til en person, diskret datapunkt (single-plex IHC). Den protokol, der er beskrevet her, repræsenterer en tilgang, der er et sted i midten, med et fokuseret anvendelsesområde, der muliggør høj følsomhed, men kun at fange en delmængde af klinisk relevante transkripomiske data. På grund af arten af bulk RNA udvinding, denne protokol giver ikke oplysninger om de rumlige relationer mellem immunceller og tumor mikromiljø, dog, resultater kan suppleres med billeddannelse teknologier til at tilføje disse oplysninger. Der er et utal af ansøgninger om de data, der genereres af denne protokol, da der er meget at lære om biologi af kræft som en sygdom, og de behandlinger, der udvikles til behandling af det. Som vist i de repræsentative resultater, den enkelte immunrapport er nyttig til at forstå, hvordan en patients immunprofil kan ændre sig som reaktion på hændelser såsom sygdomsprogression eller behandling. Mens de resultater, der præsenteres her, giver nogle eksempler på anvendelsestilfælde, er andre anvendelser, herunder undersøgelse af virkningsmekanismen i en behandling og identifikation af formodede biomarkører for kliniske resultater såsom progressionsfri og samlet overlevelse, også Praktiske. Når du bruger denne protokol til biomarkør opdagelse applikationer, er det vigtigt at praktisere god undersøgelse design for at sikre homogene populationer analyseres, tilstrækkelige prøver er inkluderet for statistisk magt, og kilder til bias overvejes. På grund af den fokuserede, strømlinede karakter af analysen, er det muligt at forestille sig en vej mod klinisk validering og downstream anvendelse af disse biomarkører engang opdaget.

Kvantificering af tumor-infiltrerende lymfocytter (TILs) og andre immun-relaterede molekyler i formalin-fast og paraffin indlejret (FFPE) fast tumor humant væv prøver har vist værdi i klinisk forskning1,2,3. Almindelige teknikker såsom flow cytometri og encellede ribonucleic acid (RNA) sekventering er nyttige for frisk væv og blod4,men er uegnede til analyse af FFPE materialer på grund af manglende evne til at skabe levedygtige cellesuspensioner. Nuværende metoder, der er blevet brugt til at kvantificere disse celler i FFPE væv lider af store udfordringer. Immunhistokemi (IHC) og andre lignende billedbehandlingsarbejdsgange kræver specifikke antistoffer for at påvise celleoverfladeproteiner, hvilket kan være vanskeligt at standardisere på tværs af laboratorier for at muliggøre reproducerbar kvantificering5. Platforme som nCounter-systemet er afhængige af ekspression af enkelte gener for at definere centrale immunceller6,hvilket begrænser følsomheden og specificiteten af detektion. Mere generiske RNA sekventering metoder, kombineret med standalone softwareværktøjer, er tilgængelige, men kræver betydelig optimering og validering før brug7,8,9,10,11,12. Nylige fremskridt i at kombinere laser capture mikrodædi (LCM) med RNA sekventering for FFPE væv har vist lovende; der kræves dog en mere høj gennemløbs-, nøglefærdig løsning til translationelle undersøgelser med henblik på at identificere robuste biomarkører13,14. Metoder til at generere flerdimensionale biomarkører, såsom Predictive Immune Modeling, der definerer patient kohorter, herunder terapi responders, kræft undertyper, eller overlevelse resultater med høj prædiktiv nøjagtighed og statistisk signifikans bliver stadig vigtigere i en alder af præcision medicin og immunterapi15,16.
For at imødekomme dette behov blev der udviklet en immunprofilanalyse for at muliggøre følsom og specifik kvantificering af immunceller i fast tumor FFPE-væv ved hjælp af standardiserede RNA-sekventeringsreagenser og skybaserede informatik. Ud over at imødekomme nedbrudt RNA fra FFPE væv, protokollen er i stand til at rumme RNA stammer fra at begrænse vævsprøver såsom centrale nål biopsier, nål aspirater, og mikro- eller makro-dissekeret væv. RNA-data fra hver prøve sammenlignes med en database over genekspressionsmodeller af immunceller, kaldet immunsundhedsudtryksmodeller, for at kvantificere immunceller som en procentdel af de samlede celler, der findes i prøven. Kort sagt blev disse modeller bygget ved hjælp af maskinlæringsmetoder til at identificere unikke flergene udtryksmønstre fra hele transskriptionsdata genereret fra rensede immuncellepopulationer (isoleret ved hjælp af kanoniske celleoverflademarkører)17,18. De flerdimensionale Health Expression Models underliggende teknologi gør det muligt for analysen at kvantificere hver immuncelle som en procentdel af de samlede celler til stede i den heterogene blanding. Dette gør det muligt for forskeren at generere sammenligninger mellem og intra-prøve immuncelle, som har vist sig at have klinisk værdi19,20. Andre anvendelser omfatter kvantificering af immunrespons før og efter behandling, som beskrevet i de repræsentative resultater. Analysen rapporterer om flere funktioner i immun contexture af tumor og tumor mikromiljø, herunder de absolutte procenter af otte immuncelletyper (afledt af genekspression modeller): CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, CD56+ Natural Killer celler, CD19+ B celler, CD14+ monocytter, Tregs, M1 makrofager, og M2 makrofager. Hertil kommer, at analysen rapporterudtrykket (i udskrifter per million, eller TPM) af ti immun flugt gener: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1, og ARG1.
Reagenssættet bruges til at gøre biblioteker af høj kvalitet klar til sekventering på en Illumina-platform efter en hybrid opsamlingsbaseret biblioteksforberedelsesmetode, som vist i figur 1. Hvis en forsker ikke har en Illumina sekventering platform i deres laboratorium, kan de indsende deres prøver til et centralt laboratorium for sekventering. Når de er genereret, overføres sekventeringsdata til Prism-portalen til automatiseret analyse, og en omfattende, kvantitativ profil for hver enkelt prøve i form af immunrapporten (figur 2A) returneres til brugeren. Brugerne kan også definere prøvegrupper i Prism-portalen for at generere en Biomarkørrapport (figur 2B),der fremhæver statistisk signifikante biomarkører, der skelner mellem to patientkohorter. Det er vigtigt, at de data, der genereres af reagenssættet, kun anvendes til forskningsbrug og må ikke bruges til diagnostiske formål.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Figur 1: Oversigt over arbejdsgange. I denne protokol konverteres RNA først til cDNA. Sekventeringsadaptere er ligated, og adapter-ligated cDNA forstærkes og stregkodes af PCR for at skabe en pre-capture bibliotek. Biotinylated sonder derefter hybridiseres til specifikke cDNA mål, som derefter fanges ved hjælp af streptavidin perler. Ubundet, ikke-målrettet cDNA fjernes ved vask. En endelig PCR berigelse giver en post-capture bibliotek klar til sekventering. *Det samlede RNA skal være fra humane prøver. kan være intakt eller nedbrudt RNA(FFPE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figur 2: Repræsentative immunrapporter. Arbejdsprocessen genererer to rapporter, en individuel immunrapport (A) for hver behandlet prøve og en biomarkørrapport (B) for definerede patientkohorter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Protokollen kræver ca. 16 timers tilberedningstid (fra totalRNA til biblioteker, der er klar til sekventering). Der er dog en række valgfrie stoppesteder, som anført i protokollen. Analysen gør brug af den rige, dynamiske karakter af transskriptionomics at bevæge sig ud over arv enkelt-analysand biomarkører til flerdimensionale genekspression modeller, hvilket muliggør omfattende biologisk karakterisering af vævsprøver med standardiserede reagenser og brugervenlige softwareværktøjer. Det giver forskerne mulighed for at udnytte en moderne teknologi i deres eget laboratorium, ved at udnytte machine-learning og en database over Health Expression Models til at udlede mere præcise, kvantitative immunprofiler af dyrebare kliniske prøver, og opdage flerdimensionale RNA biomarkører med fuld statistisk analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Immunterapier viser lovende i behandlingen af onkologi patienter, men komplekse heterogenitet af tumor mikromiljøet gør forudsige behandling svar udfordrende. Evnen til at løse de relative populationer af immunceller til stede i og omkring tumorvævet har vist sig at være klinisk relevant for forståelse nikke, men er begrænset af traditionelle teknikker såsom flow cytometri og immunhistokemi ( IHC), på grund af den store mængde væv, der kræves, mangel på nøjagtige celle type markører, og mange tekniske og logistiske forhindringer. En analyse (f.eks ImmunoPrism Immune Profilering Assay) overvinder disse udfordringer ved at imødekomme både små mængder RNA og stærkt nedbrudt RNA, fælles træk ved RNA udvundet fra klinisk arkiveret fast tumorvæv. Analysen er tilgængelig via et reagenskit og skybaserede informatik, der giver en end-to-end kvantitativ, høj-throughput immun-profilering løsning til Illumina sekventering platforme. Forskere starter med så få som to sektioner af formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv eller 20-40 ng af den samlede RNA (afhængigt af prøvens kvalitet), og protokollen genererer en immunprofil rapport kvantificere otte immuncelletyper og ti immun flugt gener, indfange et komplet overblik over tumor mikromiljøet. Der kræves ingen yderligere bioinformatik analyse for at gøre brug af de resulterende data. Med de relevante stikprøvekohorter kan protokollen også anvendes til at identificere statistisk signifikante biomarkører inden for en patientpopulation af interesse.

Der er en række kontrolpunkter i hele protokollen, der gør det muligt for en bruger at evaluere kvaliteten og mængden af genererede materialer. Efter trin 12, der er beskrevet i protokollen, genereres der et elektrofherogram som vist i figur 3, der er repræsentativt for et typisk præfangstbibliotek for en intakt RNA-prøve (RIN = 7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Figur 3: Typisk forfange bibliotek Bioanalyzer spor for en intakt RNA prøve. Pre-capture biblioteker vises som en bred top omkring 250-400 base par (bp) i størrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Der bør udvises forsigtighed for at undgå overforstærkning, som det fremgår af den anden top på ca. 1.000 bp, der er vist i figur 4, et repræsentativt elektrofherogram af et forfangebibliotek, der er genereret fra en FFPE RNA-prøve (DV200 = 46). Hvis denne top er lille i forhold til de vigtigste peak (omkring 250-400 base par (bp), som vist), vil det ikke forstyrre nedstrøms trin eller analyse. Hvis den anden top er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket genskabes med færre PCR cykler for at reducere overforstærkning.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Figur 4: Typisk forhentningsbibliotekSbioanalysatorsporing til en FFPE RNA-prøve. Den anden top omkring 1.000 bp er tegn på over-forstærkning. Hvis dette højdepunkt er lille i forhold til de vigtigste top omkring 250-400 bp (som vist), vil det ikke forstyrre nedstrøms trin eller analyse. Hvis den anden top er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket genskabes med færre PCR cykler for at reducere over-forstærkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Som beskrevet i trin 12.1.3 bør tilstedeværelsen af adapterdimer evalueres for at afgøre, om yderligere oprydning er nødvendig. De elektropherogrammer, der er vist i figur 5, er repræsentative for uacceptable (figur 5A, DV200 = 33) og acceptable(figur 5B, DV200 = 46) niveauer af adapterdimer, der fremstår som den skarpe top omkring 128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Figur 5: Pre-capture bibliotek Bioanalyzer spor. Adapteren dimer viser sig som en skarp top omkring 128 bp. (A) Overdreven adapter dimers er til stede i denne elektropherogram. (B) Acceptable adapterdimer er afbildet i dette spor. Begge spor viser tegn på mild overforstærkning, men dette bør ikke forstyrre ImmunoPrism Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Ved afslutningen af protokollen, før sekvensering, er de endelige biblioteker igen evalueret ved hjælp af digital elektroforese. Biblioteker lavet af FFPE RNA tendens til at have en mindre gennemsnitlig størrelse fordeling end biblioteker lavet af intaktRNA. For intakte RNA-prøver skal det resulterende spor ligne figur 6 (RIN = 9.5). For nedbrudt RNA eller FFPE RNA skal det resulterende spor ligne figur 7 (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figur 6: Typisk testspor af det endelige bibliotek bioanalysator for en intakt RNA-prøve. Endelige biblioteker vises som en bred top omkring 250-400 base par (bp) i størrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Figur 7: Typisk testspor af det endelige bibliotek bioanalysator for en FFPE RNA-prøve. Biblioteker lavet af FFPE RNA tendens til at have en mindre gennemsnitlig størrelse fordeling end biblioteker lavet af intaktRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Som beskrevet kan de resultater, der genereres med denne protokol, anvendes på to nøglemåder, som vist i figur 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Figur 8: To anvendelsestilfælde i protokollen. Resultaterne genereret af denne immunprofilering assay anvendes i to centrale translationelle applikationer. (A) Den første brug sag starter fra humant fast tumorvæv (herunder FFPE arkiver) og genererer en individuel immunprofil for prøven. (B) Når dataene er genereret for en kohorte af humane prøver, kombineres de ved hjælp af Prism Portalen til at generere en flerdimensional biomarkør og tilsvarende Biomarkør-rapport. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
For at påvise hvert af disse use cases er repræsentative data fra en lille translationel undersøgelse inkluderet21. De prøver, der anvendes i denne undersøgelse, er et sæt prøver fra 7 patienter, der diagnosticeres og behandles for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Prøverne er patient-matchede solid tumorvæv fra før og efter behandling biopsier. For det første blev individuelle prøver analyseret for at generere en immunprofil, f.eks.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figur 9: Eksempel på individuel immunrapport for en NSCLC-prøve. Prism Portal-rørledningen genererer en grafisk rapport for hver prøve, der behandles, med en repræsentativ rapport genereret til en NSCLC solid tumor prøve vist her. (A) Forsiden af rapporten viser grafisk nedbrydningen af de immunceller, der findes i RNA-prøven, der er udvundet af FFPE-vævet. (B) Bagsiden af rapporten indeholder en tabel over immunceller (i absolutte procenter) og undslippe genekspression (i udskrifter pr. million, eller TPM), samt en erklæring om ydeevne for analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Immunprofilerne før og efter behandlingen kan anvendes til at forstå, hvordan en behandling (kemoterapi eller stråling, i denne undersøgelse) har ændret tumor mikromiljøet. Et eksempel er vist i figur 10, hvor ændringerne i procent for hver immuncelle og totalt immunindhold vises før og efter kemoterapi for en enkelt patient.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figur 10: Eksempel resultater før og efter behandling. Individuelle immuncelle- og totalimmunindholdsdata fra prøver før og efter behandling fra en enkelt NSCLC-patient vises. I dette eksempel fik patienten et kemoterapiregime som behandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Patienter kan grupperes efter kriterier såsom kliniske resultater eller fænotyper til sammenligning. I figur 11blev prøverne i NSCLC-studiet f.eks. En delmængde af patienterne viste sygdomstilbagefald i >18 måneder, og en anden delmængde udviklede sig hurtigere i ≤18 måneder. Mediandeltaværdien (forskellen mellem værdier før og efter behandling) sammenlignes for hver prøve for at identificere formodede biomarkører for sygdomsprogression.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figur 11: Sammenligning af kliniske resultatsammenligninger. Kvantitative ændringer mellem immuncelleprocenterne i matchede NSCLC-prøver før og efter behandlingen blev beregnet og rapporteret som "deltaværdien". De, der fremhæves med gult, viser klare signalændringer mellem overlevelsesstatus. Blå bjælker repræsenterer mediandeltaværdier for >18 måneder, indtil sygdomsprogression, orange stænger repræsenterer mediandeltaværdier for ≤18 måneder indtil sygdomsprogression. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Endelig kan lignende stikprøvegrupper anvendes til specifikt at se på prøver til forbehandling for at identificere prædiktive biomarkører ved hjælp af Prism-portalen til at udarbejde en Biomarkørrapport. I figur 12definerer den samme kliniske fænotype (sygdomsprogression) som beskrevet ovenfor prøvegrupperinger. I dette eksempel blev to immunflugtsgener identificeret som statistisk signifikante differentiatorer af prøvegrupperinger (CD47 og OX40, vist i det nederste panel i figur 12A). I dette eksempel, fordi de enkelte genbiomarkører er robuste med klar statistisk betydning, tilføjer den flerdimensionale biomarkør ikke signifikant prædiktiv værdi (ImmunoPrism, som mærket i det øverste højre søjlediagram i figur 12B). Den fulde datatabel, herunder resultater for alle 18 analysander til analysen, er sammenfattet på bagsiden af rapporten, herunder statistisk analyse og en kort oversigt over metoder.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Figur 12: Eksempel Biomarkørrapport for NSCLC-prøver. Biomarker Discovery-rørledningen leverer en visuel rapport over individuelle biomarkører og en flerdimensional biomarkør med maskinel læring med detaljerede statistikker. (A) I forbindelse med denne undersøgelse identificerede rørledningen to individuelle biomarkører (CD47 og OX40) som statistisk signifikante for at definere sygdomsprogression med en tærskel på 18 måneder. B) Nærmere oplysninger om metoden og de fuldstændige resultater er medtaget på bagsiden af rapporten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende tabel 1: Reagenskit materialer. En liste over materialer i ImmunoPrism Kit er opført, sammen med de varenumre, der refereres til i producentens protokol. Alt andet udstyr og andet materiale, der kræves, er opført i materialetabellen. Besøg <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> for sikkerhedsdatablade (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).</a>
Supplerende tabel 2: Termisk cycler programmer. De anbefalede cycler-programmer, der refereres til i hele protokollen, opsummeres for at gøre det nemmere at programmere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).</a>
Supplerende tabel 3: Indeksvejledning for sekvensering. Indeksprimere i reagenssættet er angivet. en unik primer føjes til hver reaktion til post-sekventering demultiplexing. Anbefalede kombinationer med multixing på lavt niveau er også til rådighed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Brugen af en RNA-baseret tilgang til at bestemme kvantitative immunprofiler af fast tumorvæv og udnytte kliniske kohorter til immun-onkologi biomarkør opdagelse er beskrevet gennem en molekylær og informatik protokoller.

Prædiktiv immunmodellering af solide tumorer

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Omfattende karakterisere tumor mikromiljø er afgørende i immun-onkologi forskning. Denne analyse er den første til at bruge RNA-baserede sundhedsudtryk modeller til at måle immunceller i fast tumorvæv. Denne analyse gør det muligt for forskere at få meget følsomme og specifikke målinger af immun contexture i FFB fast tumorvæv og til at kombinere disse resultater i en multi-dimensionel biomarkør.Alle kræftbehandlinger, ikke bare immunterapier, fremkalder en immunrespons på stedet af den faste tumor. Måling af denne immunrespons er vigtigt for at forstå sygdomsprogression og terapi reaktioner. Denne protokol kombinerer traditionelle RNA bibliotek forberedelse teknikker med målrettet fange.Mens tidskrævende, efter vask trin og overvågning af kvalitetskontrol checkpoints som foreslået er meget vigtigt for succes. For stærkt nedbrudte RNA fra formalinfaste paraffinindredte prøver samles den første strengsyntesereaktion på is i henhold til bordet. Bland reaktionerne grundigt ved at pipettere op og ned flere gange, før du kortvarigt drejer prøverne ned i en mikrocentrifuge.Ved centrifugeringsens afslutning indsættes prøverne straks i en forvarmet termiskcykelr efter program nummer tre fra bordet. For intakt RNA af høj kvalitet skal den første strengsyntesereaktion på is samles i et nukleosfri PCR-rør som beskrevet i tabellerne. For at begynde denne procedure, bland 200 nanogram af det stregkodede bibliotek af interesse med to mikrogram COT-1 DNA og to mikroliter af blokering oligos i en nuklease-fri PCR rør.Brug derefter en vakuumkoncentrator sat til 30 til 45 grader Celsius til at tørre indholdet af røret. Efter hybridisering, fjerne prøverne fra den termiske cycler og indstille den termiske cycler at inkubere på 65 grader Celsius med det opvarmede låg indstillet til 70 grader Celsius. Brug en multikanalpipette til at overføre 17 mikroliter af fuldt homogeniserede perler til prøverne og pipette grundigt op og ned 10 gange.For at binde DNA til perlerne, skal du placere rørene i den termiske cycler efter program 10 kort fjerne de strippede rør hver 10 til 12 minutter i tre sekunder af blid vortexing at holde perlerne resuspended. Umiddelbart efter indkuvningen fjernes en strimmel rør fra den termiske cykelr, og der tilsættes 100 mikroliter forvarmet vaskebuffer en til rørene. Pipette grundigt op og ned 10 gange og læg rørene på en magnetisk rack, så perlerne kan skilles helt fra vaskeopløsningen, før de indsugning af det ubundne DNA, der indeholder supernatant.Fjern rørene fra rack og tilsæt 150 mikroliter af forvarmet streng vask buffer med grundig blanding til helt resuspend perlerne passe på at undgå bobler. Sæt rørene tilbage i den termiske cykelr ved 65 grader Celsius i fem minutter, før rørene sættes tilbage på den magnetiske rist, så perlerne kan skilles helt fra supernatanterne. Kassér det ubundne DNA indeholdende supernatanter, vask perlerne igen med forvarmet streng vaskebuffer, som netop påvist for i alt to strenge vasker.Efter den sidste vask fjernes supernatanten, og der tilsættes 150 mikroliter af rumtemperaturvaskbuffer en til rørene. Pipette vasken 10 til 20 gange for helt at resuspendre perlerne og inkubere prøverne med låget forseglet i to minutter skiftevis mellem vortexing i 30 sekunder og hvile i 30 sekunder. Ved slutningen af inkubationen, centrifuge kort og placere rørene på den magnetiske rack og fjern supernatant, når perlerne har fuldt klæbet til magneten.Centrifuge rørene kortvarigt med hætterne lukket og returnere prøverne til den magnetiske rack. Brug en 10 mikroliterpipette til at fjerne eventuelle resterende vaskebuffer og tilsæt 150 mikroliter af rumtemperaturvaskbuffer to. Pipette vasken 10 til 20 gange for helt at resuspendre perlerne og inkubere prøverne med lågene forseglet i to minutter skiftevis mellem vortexing i 30 sekunder og hvile i 30 sekunder.Efter en kort centrifugering overføres hele mængden af perler fra hvert rør til rene nukleasefrie PCR-rør, og rørene anbringes på den magnetiske rist. Efter at have kasseret det ubundne DNA, der indeholder supernatanter, centrifuger prøverne kortvarigt igen og bruger en 10 mikroliterpipette til at fjerne eventuelle resterende vaskebuffer fra perlerne, mens de er i den magnetiske rist. Tilsæt 150 mikroliter af vaskebuffer tre til rørene og pipette op og ned 10 til 20 gange for helt at opslænne perlerne.Rørt inkuberrøret i to minutter skiftevis mellem 30 sekunders blid vortexing og 30 sekunders hvile, før det kortvarigt centrifugeres. Anvis rørene på den magnetiske rist for at aspirere supernatanterne og centrifuger kort perleprøverne igen. Brug en 10 mikroliterpipette til at fjerne eventuelle resterende vask buffer fra perlerne, mens de er i den magnetiske rack, før du fjerner rørene fra rack og resuspending perlerne i 20 mikroliter af nuklease-fri vand pr rør.Derefter pipette perlerne 10 gange for at sikre, at eventuelle perler fast på siden af rørene er blevet resuspended. Tilstedeværelsen af adapterdæmpne skal evalueres for at afgøre, om yderligere oprydning er nødvendig. For eksempel viser dette elektroferogram et acceptabelt niveau af adapterdæmpner, der vises som en skarp top på omkring 128 basispar, mens dette elektroferogram viser et uacceptabelt niveau af adapterdæmpner.Immunprofilerne før og efter behandlingen kan anvendes til at forstå virkningerne af en specifik behandling på tumormikro miljøet som i denne repræsentative analyse, for hvilken ændringerne i procent for hver immuncelle af interesse og det samlede immunindhold er vist før og efter kemoterapi for en enkelt patient. I denne analyse blev prøver mellem patientgrupper sammenlignet efter deres tid til sygdomsprogression efter behandling. En delmængde af patienterne viste sygdomsrecidiv efter 18 måneder, mens en anden delmængde udviklede sig hurtigere i 18 eller færre måneder.Mediandeltaværdien kan derefter sammenlignes for hver prøve for at identificere formodede biomarkører for sygdomsprogression. For eksempel blev to immunflugtsgener her identificeret som statistisk signifikante differentiatorer af prøvegrupperingerne. Da de enkelte genbiomarkører var robuste med klar statistisk signifikans, tilfører den flerdimensionale biomarkør ikke en signifikant prædiktiv værdi.Sørg for at udføre de opvarmede vasker en strimmel ad gangen for at forhindre prøvekøling og husk at overføre perlerne til friske rør for at undgå forurening uden for målet. Denne protokol viser brugen af genekspressionsmodeller til kvantificering af immunceller og tumorvæv. Nye modeller er ved at blive udviklet til at måle celle stater såsom udmattelse eller aktivering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering af Funktionel Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering af fedtvæv immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generering af lymfeknuder-fedt Pad kimærer for Studiet af lymfeknuder stromacelle Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissekere medfødte immunforsvar signalering i Viral Evasion af cytokinproduktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...