Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

De auteurs willen TriStar Technology Group erkennen voor het leveren van de biologische specimens voor de representatieve resultaten, evenals de gehele moleculaire, analyse-, product- en commerciële teams van Cofactor Genomics voor hun technische expertise en Ondersteuning.

<ol>
	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Alle auteurs zijn in dienst van Cofactor Genomics, Inc., het bedrijf dat de ImmunoPrism reagent kit en informatica tools ontwikkeld en produceert die in dit artikel worden gebruikt. De ImmunoPrism Assay is alleen voor onderzoek gebruik, en is niet voor gebruik in diagnostische procedures.

Het protocol vereist 20 ng intact of 40 ng hoogst gedegradeerd (FFPE) RNA. Het RNA-monster moet vrij zijn van DNA, zouten (bijvoorbeeld Mg2+of guanidiniumzouten), divalente kationchechedelende stoffen (bijvoorbeeld EDTA, EGTA, citraat) of organische stoffen (bijvoorbeeld fenol en ethanol). Het wordt niet aanbevolen om verder te gaan met RNA-monsters die een DV200 <20% hebben. Het gebruik van het rna in-kitcontrole wordt sterk aanbevolen, omdat deze besturingselementen een middel bieden om de prestaties gedurende het hele protocol te evalueren, van bibliotheekvoorbereiding tot analyse.
Het protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd met behulp van 0,2 mL PCR stripbuizen. Indien gewenst kan het protocol ook worden uitgevoerd met behulp van de putten in een 96-well PCR-plaat. Gebruik gewoon de putten van een 96-well PCR plaat in plaats van alle verwijzingen naar PCR buizen of stripbuizen. Gebruik PCR platen met duidelijke putten alleen, want het is van cruciaal belang om visueel te bevestigen volledige resuspension van kralen tijdens kraal zuiveringen en wassen stappen.
Houd reagentia gedurende het protocol bevroren of op ijs, tenzij anders aangegeven. Gebruik geen reagentia totdat ze volledig ontdooid zijn. Zorg ervoor dat u alle reagentia grondig mengt voor gebruik.
Houd enzymen op -20 °C tot ze na gebruik klaar zijn voor gebruik en keer na gebruik terug naar -20 °C. Gebruik alleen nuclease-vrij water van moleculaire kwaliteit; het wordt afgeraden om met DEPC behandeld water te gebruiken. Bij het beaien om te mengen, zachtjes aanzuigen en afzien van ten minste 50% van het totale volume totdat de oplossingen goed gemengd zijn. Pipette meng alle master mixen met enzymen. Het gebruik van vortex om de enzymen te mengen kan leiden tot denaturatie en hun prestaties in gevaar brengen. Gebruik tijdens de kraalzuiveringen vers gemaakte 80% ethanoloplossingen van moleculaire ethanol. Het gebruik van ethanoloplossingen die niet vers zijn, kan leiden tot lagere opbrengsten. Vermijd over het drogen van de kralen, omdat dit kan verminderen elutie efficiëntie (kralen kijken gebarsten als over gedroogd).
Zoals beschreven in stap 10, worden unieke indexprimers toegevoegd aan elke reactie. Op basis van de sequenties van deze indexen, voor laagmultiplexing, zijn bepaalde indexcombinaties optimaal. De sequenties van deze indices zijn nodig voor het demultiplexeren van de gegevens na de sequencing. De sequenties en aanbevolen multiplexing combinaties zijn opgenomen in aanvullende tabel 3. In dezelfde stap is het belangrijk op te merken dat het aantal aanbevolen PCR-cycli varieert afhankelijk van de kwaliteit van het gebruikte RNA en dat enige optimalisatie nodig kan zijn om overversterking van PCR te voorkomen. Voor het ImmunoPrism Intact Control RNA en ander hoogwaardig RNA start optimalisatie met 10 PCR cycli. Voor het ImmunoPrism FFPE Control RNA en andere sterk gedegradeerde/FFPE RNA start optimalisatie met 15 PCR cycli. Het produceren van een testbibliotheek met behulp van RNA representatief voor het materiaal dat moet worden geanalyseerd om PCR-cycli te optimaliseren wordt aanbevolen. Het minimumaantal PCR-cycli dat consistent voldoende pre-capture bibliotheekopbrengsten oplevert (>200 ng) moet worden gebruikt. Een secundaire piek rond 1000 bp op het Bioanalyzer-spoor is indicatief voor overversterking (figuur 4). Overversterking moet worden geminimaliseerd, maar de aanwezigheid van een kleine secundaire piek zal de resultaten van de test niet verstoren.
Om monsterverlies te minimaliseren en te voorkomen dat u van buizen wisselt, kan stap 13 worden uitgevoerd in PCR-buizen, stripbuizen of een 96-well PCR-plaat in plaats van 1,5 mL-microbuisjes, als uw vacuümconcentrator dit toelaat. De rotor kan op veel concentrators worden verwijderd. Hierdoor passen de stripbuizen of platen in het vacuüm. De vacuümconcentratie kan dan worden uitgevoerd met behulp van de waterige uitdroging instelling zonder centrifugering. Raadpleeg de handleiding voor uw vacuümconcentrator voor instructies. Als de monsters worden gedroogd in stripbuizen of een 96-put plaat, kan de hybridisatiestap in hetzelfde vat worden uitgevoerd.
Tijdens stap 17 moet u elke 10-12 min vortexen om de efficiëntie van de kraalafte vast te leggen. Houd de doppen van de warme stripbuizen voorzichtig vast bij het mengen om te voorkomen dat buizen opengaan.
De in stap 18 beschreven wasbeurten zijn van cruciaal belang om hoge niet-specifieke verontreiniging te voorkomen en moeten op de voet worden gevolgd. Zorg ervoor dat u de kralen bij elke wasbeurt volledig opnieuw opschort, de wasbuffers volledig verwijdert en tijdens de wasbuffer 2-wasbuffer 2 de monsters naar een verse stripbuis brengt (stap 18.6.5). Zorg ervoor dat de streptavidin kralen volledig opnieuw worden opgehangen en blijven in suspensie tijdens de gehele incubatie. Spatten op de buisdoppen heeft geen negatieve invloed op de opname. Tijdens de wasbeurten van de kamertemperatuur kan een microplate vortexmixer worden gebruikt om de monsters gedurende het geheel van de incubatietijd van twee minuten te vortexen voor een gemakkelijkere resuspensie. Laat de streptavidin kralen niet uitdrogen. Indien nodig, uitte broedtijd in de buffers om te voorkomen dat het drogen van de kralen. Als u meer dan één stripbuis gebruikt, werkt u met één stripbuis tegelijk voor elke wasbeurt, terwijl de andere stripbuizen in de thermocycler zitten. Dit kan helpen voorkomen dat over het drogen van de kralen of haasten, wat resulteert in een slechte resuspension of andere sub-optimale technieken. Voor gebruikers voor het eerst wordt het niet aanbevolen om meer dan 8 bibliotheekreacties tegelijk te verwerken.
De huidige immuunprofileringstechnieken leveren een continuüm van informatie - van duizenden gegevenspunten die significante interpretatie (RNA-sequencing) vereisen tot een individueel, discreet datapunt (single-plex IHC). Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een benadering die zich ergens in het midden bevindt, met een gerichte reikwijdte die een hoge gevoeligheid mogelijk maakt, maar slechts een subset van klinisch relevante transcriptomische gegevens vastlegt. Vanwege de aard van bulk RNA extractie, dit protocol biedt geen informatie over de ruimtelijke relaties tussen immuuncellen en de tumor micro-omgeving, echter, resultaten kunnen worden aangevuld met imaging technologieën om deze informatie toe te voegen. Er zijn een groot aantal toepassingen voor de gegevens gegenereerd door dit protocol, want er is veel te leren over de biologie van kanker als een ziekte, en de therapieën worden ontwikkeld om het te behandelen. Zoals blijkt uit de representatieve resultaten, is het individuele immuunrapport nuttig om te begrijpen hoe het immuunsysteemprofiel van een patiënt kan veranderen in reactie op gebeurtenissen zoals ziekteprogressie of behandeling. Hoewel de hier gepresenteerde resultaten enkele voorbeelduse cases bieden, zijn ook andere toepassingen, waaronder het onderzoeken van het werkingsmechanisme van een therapie en het identificeren van vermeende biomarkers van klinische resultaten zoals progressievrij en algehele overleving, Praktische. Bij het gebruik van dit protocol voor biomarker detectie toepassingen, is het belangrijk om goede studie ontwerp te oefenen om ervoor te zorgen homogene populaties worden geanalyseerd, voldoende monsters worden opgenomen voor statistische kracht, en bronnen van bias worden overwogen. Vanwege de gerichte, gestroomlijnde aard van de test, is het haalbaar om een pad naar klinische validatie en downstream toepassing van deze biomarkers voorstellen eenmaal ontdekt.

Kwantificering van tumor-infiltrerende lymfocyten (IL's) en andere immuungerelateerde moleculen in formaline-fixed en paraffine embedded (FFPE) solid tumor human tissue samples has demonstrateed value in clinical research1,2,3. Gemeenschappelijke technieken zoals flow cytometrie en eencellige ribonucleic acid (RNA) sequencing zijn nuttig voor vers weefsel en bloed4,maar zijn ongeschikt voor analyse van FFPE materialen als gevolg van het onvermogen om levensvatbare celsuspenss te creëren. De huidige methoden die zijn gebruikt om deze cellen in FFPE-weefsel te kwantificeren, lijden aan grote uitdagingen. Immunohistochemie (IHC) en andere soortgelijke imaging workflows vereisen specifieke antilichamen om cel-oppervlakte eiwitten te detecteren, die moeilijk te standaardiseren kunnen zijn tussen laboratoria om reproduceerbare kwantificering mogelijk te maken5. Platforms zoals het nCounter-systeem vertrouwen op de expressie van afzonderlijke genen om belangrijke immuuncellen te definiëren6,waardoor de gevoeligheid en specificiteit van detectie worden beperkt. Meer generieke RNA sequencing methoden, in combinatie met standalone software tools, zijn beschikbaar, maar vereisen aanzienlijke optimalisatie en validatie voorafgaand aan het gebruik7,8,9,10,11,12. Recente vooruitgang in het combineren van laser capture microdissectie (LCM) met RNA sequencing voor FFPE weefsel heeft aangetoond belofte; er is echter een meer krachtige, turnkey-oplossing nodig voor translationele studies die gericht zijn op het identificeren van robuuste biomarkers13,14. Methoden om multidimensionale biomarkers te genereren, zoals Predictive Immune Modeling, die patiëntencohorten definiëren, waaronder therapieresponders, subtypen van kanker of overlevingsresultaten met een hoge voorspellende nauwkeurigheid en statistische significantie, worden steeds belangrijker in het tijdperk van precisiegeneeskunde en immunotherapie15,16.
Om aan deze behoefte tegemoet te komen, werd een immuunprofileringstest ontwikkeld om gevoelige en specifieke kwantificering van immuuncellen in vast tumor FFPE-weefsel mogelijk te maken met behulp van gestandaardiseerde RNA-sequencing reagentia en cloudgebaseerde informatica. Naast de opvang van gedegradeerd RNA uit FFPE-weefsel, is het protocol in staat om RNA te huisvesten dat is afgeleid van het beperken van weefselmonsters zoals kernnaaldbiopten, naaldpiraten en micro- of macro-ontleed weefsel. RNA-gegevens van elk monster worden vergeleken met een database van genexpressiemodellen van immuuncellen, genaamd immune Health Expression Models, om immuuncellen te kwantificeren als een percentage van de totale cellen die in het monster aanwezig zijn. Kortom, deze modellen werden gebouwd met behulp van machine-learning methoden om unieke multigene expressie patronen te identificeren uit whole-transcriptome gegevens gegenereerd uit gezuiverde immuuncelpopulaties (geïsoleerd met behulp van canonieke cel-oppervlak markers)17,18. De multidimensionale Health Expression Modellen die aan de technologie ten grondslag liggen, stelt de test in staat om elke immuuncel te kwantificeren als een procent van de totale cellen die aanwezig zijn in het heterogene mengsel. Dit stelt de onderzoeker in staat om inter- en intra-sample immuuncelvergelijkingen te genereren, waarvan is aangetoond dat ze klinische waardehebben 19,20. Andere toepassingen zijn kwantificering van de immuunrespons voor en na de behandeling, zoals beschreven in de representatieve resultaten. De test rapporten over meerdere kenmerken van immuun contexture van de tumor en tumor micro-omgeving met inbegrip van de absolute percentages van acht immuunceltypes (afgeleid van genexpressie modellen): CD4+ T cellen, CD8+ T cellen, CD56+ Natural Killer cellen, CD19+ B cellen, CD14+ monocyten, Tregs, M1 macrofagen, en M2 macrofagen. Bovendien rapporteert de test de uitdrukking (in transcripties per miljoen, of TPM) van tien immuunvluchtgenen: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 en ARG1.
De reagent kit wordt gebruikt om bibliotheken van hoge kwaliteit klaar te maken voor sequencing op een Illumina-platform volgens een hybride op capture gebaseerde bibliotheekbereidingsmethode, zoals weergegeven in figuur 1. Als een onderzoeker geen Illumina sequencing-platform in zijn laboratorium heeft, kunnen hij zijn monsters voor sequencing indienen bij een kernlaboratorium. Eenmaal gegenereerd, sequencing gegevens wordt geüpload naar de Prism Portal voor geautomatiseerde analyse, en een uitgebreid, kwantitatief profiel voor elk individueel monster, in de vorm van het Immune Report(Figuur 2A), wordt teruggestuurd naar de gebruiker. Gebruikers kunnen ook voorbeeldgroepen definiëren in de Prism Portal om een Biomarker Report(figuur 2B)te genereren, waarbij statistisch significante biomarkers worden gemarkeerd die twee patiëntcohorten onderscheiden. Belangrijk is dat de gegevens die door de reagentkit worden gegenereerd, alleen voor onderzoek zijn gebruikt en mogelijk niet voor diagnostische doeleinden worden gebruikt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de workflow. In dit protocol wordt RNA eerst omgezet in cDNA. Sequencing adapters zijn geligated, en adapter-ligated cDNA wordt versterkt en gebarcoded door PCR om een pre-capture bibliotheek te creëren. Biotinylated sondes worden vervolgens gehybridiseerd naar specifieke cDNA-doelen die vervolgens worden vastgelegd met behulp van streptavidin kralen. Niet-gebonden, niet-gerichte cDNA wordt verwijderd door wassen. Een definitieve PCR-verrijking levert een post-capture bibliotheek op die klaar is voor sequencing. *Totaal RNA moet afkomstig zijn van menselijke monsters; kan intact of gedegradeerd (FFPE) RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figuur 2: Representatieve immuunrapporten. De workflow genereert twee rapporten, een individueel immuunrapport(A)voor elk verwerkt monster en een biomarkerrapport(B)voor gedefinieerde patiëntcohorten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Het protocol vereist ongeveer 16 uur voorbereidingstijd (van totaal RNA tot bibliotheken die klaar zijn voor sequencing); Er zijn echter een aantal optionele stoppunten, zoals vermeld in het protocol. De test maakt gebruik van de rijke, dynamische aard van transcriptomics om verder te gaan dan legacy single-analyte biomarkers naar multidimensionale genexpressiemodellen, waardoor uitgebreide biologische karakterisering van weefselmonsters met gestandaardiseerde reagentia en gebruiksvriendelijke softwaretools. Het stelt onderzoekers in staat om een hedendaagse technologie te gebruiken in hun eigen laboratorium, door gebruik te maken van machine learning en een database van Health Expression Models om nauwkeurigere, kwantitatieve immuunprofielen van kostbare klinische monsters af te leiden en te ontdekken multidimensionale RNA biomarkers met volledige statistische analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Immunotherapieën tonen belofte bij de behandeling van oncologische patiënten, maar complexe heterogeniteit van de tumormicroomgeving maakt het voorspellen van de respons op de behandeling uitdagend. Het vermogen om de relatieve populaties van immuuncellen in en rond het tumorweefsel op te lossen, is aangetoond dat het klinisch relevant is voor het begrijpen van de respons, maar wordt beperkt door traditionele technieken zoals flow cytometrie en immunohistochemie ( IHC), vanwege de grote hoeveelheid weefsel die nodig is, gebrek aan nauwkeurige cel type markers, en vele technische en logistieke hindernissen. Een test (bijvoorbeeld de ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overwint deze uitdagingen door het opvangen van zowel kleine hoeveelheden RNA en sterk gedegradeerd RNA, gemeenschappelijke kenmerken van RNA geëxtraheerd uit klinisch gearchiveerd solide tumorweefsel. De test wordt geopend via een reagent kit en cloud-based informatica die een end-to-end kwantitatieve, high-throughput immuno-profiling oplossing biedt voor Illumina sequencing platforms. Onderzoekers beginnen met zo weinig als twee secties van formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) weefsel of 20-40 ng van de totale RNA (afhankelijk van de kwaliteit van het monster), en het protocol genereert een immuunprofiel rapport kwantificeren acht immuunceltypes en tien immuun ontsnappen genen, het vastleggen van een compleet beeld van de tumor micro-omgeving. Er is geen aanvullende bio-informaticaanalyse nodig om gebruik te maken van de resulterende gegevens. Met de juiste steekproefcohorten kan het protocol ook worden gebruikt om statistisch significante biomarkers te identificeren binnen een patiëntenpopulatie van belang.

Er zijn een aantal controlepunten in het protocol waarmee een gebruiker de kwaliteit en kwantiteit van gegenereerde materialen kan evalueren. Na stap 12, beschreven in het protocol, wordt een elektropherogram gegenereerd zoals weergegeven in figuur 3, representatief voor een typische pre-capture bibliotheek voor een intact RNA-monster (RIN = 7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Figuur 3: Typische Pre-capture Library Bioanalyzer trace voor een intact RNA-monster. Pre-capture bibliotheken verschijnen als een brede piek rond 250-400 basisparen (bp) in grootte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Er moet voor worden gezorgd dat overversterking wordt voorkomen, zoals aangegeven in de tweede piek rond 1.000 bp in figuur 4, een representatief elektropherogram van een pre-capture bibliotheek gegenereerd uit een FFPE RNA-monster (DV200 = 46). Als deze piek klein is ten opzichte van de hoofdpiek (ongeveer 250-400 basisparen (bp), zoals afgebeeld), zal deze niet interfereren met downstream stappen of analyse. Als de tweede piek groot is ten opzichte van de 250-400 bp piek, kan de pre-capture bibliotheek opnieuw worden gemaakt met minder PCR-cycli om overversterking te verminderen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Figuur 4: Typische Pre-capture Library Bioanalyzer trace voor een FFPE RNA monster. De tweede piek rond 1.000 bp is indicatief voor overversterking. Als deze piek is klein ten opzichte van de belangrijkste piek rond 250-400 bp (zoals afgebeeld), zal het niet interfereren met downstream stappen of analyse. Als de tweede piek groot is ten opzichte van de 250-400 bp piek, kan de pre-capture bibliotheek opnieuw worden gemaakt met minder PCR-cycli om overversterking te verminderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Zoals beschreven in stap 12.1.3, moet de aanwezigheid van adapters dimers worden geëvalueerd om te bepalen of extra opruiming nodig is. De elektropherogrammen in figuur 5 zijn representatief voor onaanvaardbaar (figuur 5A, DV200 = 33) en aanvaardbaar(figuur 5B, DV200 = 46) niveaus van adapterdimer, verschijnen als de scherpe piek rond 128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Figuur 5: Pre-capture bibliotheek Bioanalyzer sporen. De adapterdimer verschijnt als een scherpe piek rond 128 bp. (A) Overmatige adapters dimers zijn aanwezig in dit elektropherogram. (B) Aanvaardbare adapter dimer niveaus zijn afgebeeld in dit spoor. Beide sporen tonen bewijs van milde overversterking, maar dit mag niet interfereren met de ImmunoPrism Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Bij de voltooiing van het protocol, voorafgaand aan de sequencing, worden de definitieve bibliotheken opnieuw geëvalueerd met behulp van digitale elektroforese. Bibliotheken gemaakt van FFPE RNA hebben de neiging om een kleinere gemiddelde grootte distributie dan bibliotheken gemaakt van intact RNA. Voor intacte RNA-monsters moet het resulterende spoor lijken op figuur 6 (RIN = 9.5). Voor gedegradeerd of FFPE RNA moet het resulterende spoor er vergelijkbaar uitzien met figuur 7 (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figuur 6: Typische Final Library Bioanalyzer trace voor een intact RNA monster. Definitieve bibliotheken worden weergegeven als een brede piek rond 250-400 basisparen (bp) in grootte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Figuur 7: Typische Final Library Bioanalyzer trace voor een FFPE RNA monster. Bibliotheken gemaakt van FFPE RNA hebben de neiging om een kleinere gemiddelde grootte distributie dan bibliotheken gemaakt van intact RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Zoals beschreven, kunnen de resultaten die met dit protocol worden gegenereerd, op twee belangrijke manieren worden toegepast, zoals aangegeven in figuur 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Figuur 8: Twee use cases van het protocol. De resultaten gegenereerd door deze immuunprofilering se test worden toegepast in twee belangrijke translationele toepassingen. (A) De eerste use case begint bij menselijk vast tumorweefsel (inclusief FFPE-archieven) en genereert een individueel immuunprofiel voor het monster. (B) Eenmaal gegenereerd voor een cohort van menselijke monsters, worden de gegevens gecombineerd met behulp van de Prism Portal om een multidimensionale biomarker en bijbehorend Biomarker Report te genereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Om elk van deze use cases aan te tonen, zijn representatieve gegevens uit een kleine translationele studie opgenomen21. De monsters die in deze studie worden gebruikt zijn een reeks exemplaren van 7 patiënten gediagnosticeerd en behandeld voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC). De monsters zijn patiënt-matched solide tumorweefsel van pre en post behandeling biopten. Ten eerste werden individuele monsters geanalyseerd om een immuunprofiel te genereren, zoals het voorbeeldrapport in figuur 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figuur 9: Voorbeeld van individueel immuunrapport voor een NSCLC-monster. De Prism Portal-pijplijn genereert een grafisch rapport voor elk verwerkt monster, waarbij een representatief rapport wordt gegenereerd voor een nsclc-vast tumormonster dat hier wordt weergegeven. (A) De voorzijde van het rapport toont grafisch de afbraak van immuuncellen aanwezig in het RNA monster gewonnen uit het FFPE weefsel. (B) De keerzijde van het rapport omvat een tabel met immuuncellen (in absolute percentages) en escape genexpressie (in transcripties per miljoen, of TPM), evenals een prestatieverklaring voor de test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De immuunprofielen voor- en nabehandeling kunnen worden gebruikt om te begrijpen hoe een therapie (chemotherapie of bestraling, in deze studie) de tumormicroomgeving heeft gewijzigd. Een voorbeeld wordt weergegeven in figuur 10, waar de veranderingen in procenten voor elke immuuncel en het totale immuunsysteem worden getoond pre- en na chemotherapie, voor een enkele patiënt.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figuur 10: Voorbeeld resultaten voor en na de behandeling. Individuele immuuncel en totale immuuninhoud gegevens gegenereerd uit pre- en post-behandeling monsters van een enkele NSCLC patiënt worden getoond. In dit voorbeeld kreeg de patiënt een chemotherapieregime als behandeling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Patiënten kunnen worden gegroepeerd op criteria zoals klinische uitkomsten of fenotypes ter vergelijking. In figuur 11werden de monsters in de NSCLC-studie bijvoorbeeld vergeleken op basis van de tijd van de ziekteprogressie na de behandeling. Een subgroep van de patiënten vertoonde ziekterecidief in >18 maanden, en een andere subgroep vorderde sneller, in ≤18 maanden. De mediane deltawaarde (verschil tussen waarden voor en na de behandeling) wordt voor elk monster vergeleken om vermeende biomarkers van ziekteprogressie te identificeren.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figuur 11: Voorbeeld Vergelijking van klinische uitkomsten. Kwantitatieve veranderingen tussen de immuuncelpercentages in overeenkomende NSCLC-monsters voor en na de behandeling werden berekend en gerapporteerd als de "delta"-waarde. Die gemarkeerd in geel vertonen duidelijke signaalveranderingen tussen de overlevingsstatus. Blauwe balken vertegenwoordigen mediane deltawaarden voor >18 maanden tot ziekteprogressie, oranje balken vertegenwoordigen mediane deltawaarden gedurende ≤18 maanden tot de progressie van de ziekte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Ten slotte kunnen vergelijkbare voorbeeldgroepen worden gebruikt om specifiek te kijken naar prebehandelingsmonsters om voorspellende biomarkers te identificeren met behulp van de Prism Portal om een Biomarker Report te genereren. Hetzelfde klinische fenotype (progressie van de ziekte) als hierboven beschreven definieert de monstergroepen. In dit voorbeeld werden twee immuunontsnappingsgenen geïdentificeerd als statistisch significante differentiators van de steekproefgroepen (CD47 en OX40, weergegeven in het onderste paneel van figuur 12A). In dit voorbeeld, omdat de individuele genbiomarkers robuust zijn met duidelijke statistische significantie, voegt de multidimensionale biomarker geen significante voorspellende waarde toe (ImmunoPrism, zoals gelabeld in de bovenste staafdiagram van figuur 12B). De volledige tabel met gegevens, inclusief resultaten voor alle 18 analyten voor de test, wordt samengevat aan de achterzijde van het rapport, inclusief statistische analyse en een korte samenvatting van methoden.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Figuur 12: Voorbeeld biomarkerrapport voor NSCLC-monsters. De Biomarker Discovery-pijplijn levert een visueel rapport van individuele biomarkers en een multidimensionale biomarker voor machine learning, met gedetailleerde statistieken. (A) Voor deze studie identificeerde de pijpleiding twee individuele biomarkers (CD47 en OX40) als statistisch significant voor het definiëren van ziekteprogressie met een drempel van 18 maanden. (B) Details over de methode en de volledige resultaten zijn opgenomen aan de achterzijde van het verslag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende tabel 1: Reagent Kit Materialen. Een lijst van materialen die in de ImmunoPrism Kit worden vermeld, samen met de deelnummers die in het protocol van de fabrikant verwezen. Alle andere benodigde apparatuur en materialen zijn opgenomen in de Tabel met materialen. Bezoek <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> voor Veiligheidsgegevensbladen (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Aanvullende tabel 2: Thermal Cycler Programma's. De aanbevolen cycler programma's waarnaar wordt verwezen in het protocol worden samengevat voor het gemak van programmeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>
Aanvullende tabel 3: Sequencing Index Guide. De indexprimers in de reagentkit worden vermeld; een unieke primer wordt toegevoegd aan elke reactie voor post-sequencing demultiplexing. Aanbevolen multiplexingcombinaties op laag niveau zijn ook aanwezig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Het gebruik van een RNA-gebaseerde benadering om kwantitatieve immuunprofielen van vaste tumorweefsels te bepalen en klinische cohorten te benutten voor immuun-oncologische biomarkerontdekking wordt beschreven door middel van een moleculaire en informaticaprotocollen.

Voorspellende immuunmodellering van vaste tumoren

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Het volledig karakteriseren van de tumormicro-omgeving is essentieel in immuno-oncologieonderzoek. Deze test is de eerste die RNA-gebaseerde gezondheidsexpressiemodellen gebruikt om immuuncellen in vast tumorweefsel te meten. Deze test stelt onderzoekers in staat om zeer gevoelige en specifieke metingen van de immuuncontextuur in FFB vaste tumorweefsels te krijgen en deze resultaten te combineren tot een multidimensionale biomarker.Alle kankerbehandelingen, niet alleen immunotherapieën, ontlokken een immuunrespons op de plaats van de vaste tumor. Het meten van deze immuunrespons is belangrijk voor het begrijpen van de progressie van de ziekte en de reacties op therapie. Dit protocol combineert traditionele RNA bibliotheek voorbereidingstechnieken met gerichte opname.Hoewel tijdrovend, na de wasstappen en het toezicht op de kwaliteitscontrole checkpoints zoals voorgesteld is zeer belangrijk voor succes. Voor sterk gedegradeerd RNA van formaline-vaste paraffine ingebedde monsters, monteren de eerste streng synthese reactie op ijs volgens de tabel. Meng de reacties grondig door meerdere keren op en neer te pipetten voordat u de monsters kort in een microcentrifuge naar beneden draait.Plaats aan het einde van de centrifugatie de monsters onmiddellijk in een voorverwarmde thermische cycler volgens programma nummer drie van de tabel. Voor een intact RNA van hoge kwaliteit, monteer de eerste strengsynthesereactie op ijs in een nuclease-vrije PCR buis zoals beschreven in de tabellen. Om deze procedure te beginnen, meng 200 nanogram van de barcodebibliotheek van belang met twee microgram COT-1 DNA en twee microliters van het blokkeren van oligo's in een nuclease-vrije PCR buis.Gebruik vervolgens een vacuüm concentrator ingesteld op 30 tot 45 graden Celsius om de inhoud van de buis te drogen. Na hybridisatie, verwijder de monsters uit de thermische cycler en zet de thermische cycler in te broeden op 65 graden Celsius met de verwarmde deksel ingesteld op 70 graden Celsius. Gebruik een multichannel pipet om 17 microliter volledig gehomogeniseerde kralen over te brengen naar de monsters en pipet grondig op en neer 10 keer.Om het DNA te binden aan de kralen, plaats de buizen in de thermische cycler volgende programma 10 kort verwijderen van de gestripte buizen om de 10 tot 12 minuten gedurende drie seconden van zachte vortexing om de kralen resuspended te houden. Onmiddellijk na de bindende incubatie, verwijder een strook buizen uit de thermische cycler en voeg 100 microliters van voorverwarmde wasbuffer een aan de buizen. Pipet grondig op en neer 10 keer en plaats de buizen op een magnetisch rek om de kralen volledig te scheiden van de wasoplossing voordat het ongebonden DNA met supernatant aspirating.Haal de buizen uit het rek en voeg 150 microliters van voorverwarmde strenge wasbuffer met grondig mengen om de kralen volledig te hersuspend die ervoor zorgen om bellen te vermijden. Plaats de buizen terug in de thermische cycler op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten voor het plaatsen van de buizen terug op het magnetische rek om de kralen volledig te scheiden van de supernatants. Gooi het ongebonden DNA met supernatants weg, was de kralen nogmaals met voorverwarmde strenge wasbuffer, zoals zojuist is aangetoond voor in totaal twee strenge wasbeurten.Na de laatste wasbeurt, verwijder de supernatant en voeg 150 microliter van kamertemperatuur wassen buffer een aan de buizen. Pipette de was 10 tot 20 keer om de kralen volledig te herhalen en de monsters uit te broeden met het deksel gedurende twee minuten afgesloten afwisselend 30 seconden en 30 seconden rusten. Aan het einde van de incubatie, centrifuge kort en plaats de buizen op het magnetische rek en verwijder de supernatant zodra de kralen volledig hebben gehecht aan de magneet.Centrifugeren de buizen kort met de doppen gesloten en terug te keren de monsters naar het magnetische rek. Gebruik een 10 microliter pipet om eventuele resterende wasbuffers te verwijderen en voeg 150 microliters kamertemperatuur wasbuffer twee toe. Pipette de was 10 tot 20 keer om de kralen volledig te herhalen en de monsters uit te broeden met de deksels gedurende twee minuten verzegeld afwisselend vortexing gedurende 30 seconden en 30 seconden rusten.Breng na een korte centrifugatie het volledige volume kralen van elke buis over in schone nuclease-vrije PCR-buizen en plaats de buizen op het magnetische rek. Na het weggooien van het ongebonden DNA met supernatants, even centrifugeren de monsters opnieuw en gebruik een 10 microliter pipet om eventuele resterende wasbuffer te verwijderen uit de kralen terwijl ze in het magnetische rek. Voeg 150 microliter wasbuffer drie aan de buizen en pipet op en neer 10 tot 20 keer om de kralen volledig opnieuw op te zetten.Incubeer de buis gedurende twee minuten afwisselend tussen 30 seconden zachte vortexen en 30 seconden rust voordat kort centrifugeren. Plaats de buizen op het magnetische rek om de supernatants aan te trekken en de kraalmonsters kort opnieuw te centrifugeren. Gebruik een 10 microliter pipet om eventuele resterende wasbuffers uit de kralen te verwijderen terwijl ze zich in het magnetische rek bevinden voordat ze de buizen uit het rek verwijderen en de kralen opnieuw in 20 microliter nuclease-vrij water per buis.Dan pipette de kralen 10 keer om ervoor te zorgen dat eventuele kralen vast aan de zijkant van de buizen zijn geresuspended. De aanwezigheid van adapter dimers moet worden geëvalueerd om te bepalen of extra opschoning nodig is. Dit elektropherogram vertoont bijvoorbeeld een aanvaardbaar niveau van adapterverkleter dat verschijnt als een scherpe piek rond 128 basisparen, terwijl dit elektropherogram een onaanvaardbaar niveau van adapterverkleinter vertoont.De immuunprofielen voor en na de behandeling kunnen worden gebruikt om de effecten van een specifieke therapie op de tumormicro-omgeving te begrijpen, zoals in deze representatieve analyse waarvoor de veranderingen in percentage voor elke immuuncel van belang en het totale immuunsysteem voor en na chemotherapie voor één patiënt worden getoond. In deze analyse werden monsters tussen patiëntengroepen vergeleken op basis van hun tijd tot ziekteprogressie na de behandeling. Een subgroep van de patiënten vertoonde ziekterecidief na 18 maanden, terwijl een andere subset sneller vorderde in 18 of minder maanden.De mediane deltawaarde kan vervolgens voor elk monster worden vergeleken om vermeende biomarkers van ziekteprogressie te identificeren. Hier werden bijvoorbeeld twee immuunvluchtgenen geïdentificeerd als statistisch significante differentiators van de steekproefgroepen. Omdat de individuele genbiomarkers robuust waren met duidelijke statistische significantie, heeft de multidimensionale biomarker geen significante voorspellende waarde toegevoegd.Zorg ervoor dat u de verwarmde wasbeurten een strip tegelijk uitvoert om monsterkoeling te voorkomen en vergeet niet om de kralen over te brengen naar verse buizen om besmetting met off-target te voorkomen. Dit protocol toont het gebruik van genexpressiemodellen aan om immuuncellen en tumorweefsel te kwantificeren. Er worden nieuwe modellen ontwikkeld om celtoestanden te meten, zoals uitputting of activering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolatie van Vetweefsel immuuncellen

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...