Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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Les auteurs tiennent à remercier TriStar Technology Group d’avoir fourni les spécimens biologiques pour les résultats représentatifs, ainsi que l’ensemble des équipes moléculaires, d’analyse, de produits et commerciaux de Cofactor Genomics pour leur expertise technique et Soutien.

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	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. 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American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Tous les auteurs sont employés par Cofactor Genomics, Inc., la société qui a développé et produit le kit de réactifs ImmunoPrism et les outils informatiques utilisés dans cet article. L’analyse ImmunoPrism est pour l’utilisation de la recherche seulement, et n’est pas pour une utilisation dans les procédures diagnostiques.

Le protocole exige 20 ng intacts ou 40 ng fortement dégradés (FFPE) ARN. L’échantillon d’ARN doit être exempt d’ADN, de sels (p. ex. Mg2MDou sels de guanidinium), d’agents chélateurs divalents (p. ex. EDTA, EGTA, citrate) ou de matières organiques (p. ex. phénol et éthanol). Il n’est pas recommandé de procéder à des échantillons d’ARN qui ont un DV200 lt;20%. L’utilisation de l’ARN témoin en kit est fortement recommandée car ces contrôles fournissent un moyen d’évaluer les performances tout au long du protocole, de la préparation de la bibliothèque à l’analyse.
Le protocole est conçu pour être exécuté à l’aide de tubes à bande PCR de 0,2 mL. Si vous préférez, le protocole peut également être exécuté à l’aide des puits dans une plaque PCR de 96 puits. Il suffit d’utiliser les puits d’une plaque PCR de 96 puits à la place de toutes les références aux tubes PCR ou aux tubes à bande. Utilisez des plaques PCR avec des puits clairs seulement, car il est essentiel de confirmer visuellement la résuspension complète des perles pendant les purifications de perles et les étapes de lavage.
Tout au long du protocole, garder les réactifs congelés ou sur la glace, sauf indication contraire. N’utilisez pas de réactifs jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés. Assurez-vous de bien mélanger tous les réactifs avant utilisation.
Maintenir les enzymes à -20 oC jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi et revenir rapidement à -20 oC après utilisation. N’utilisez que de l’eau sans nucléane de qualité moléculaire; il n’est pas recommandé d’utiliser de l’eau traitée par LE DEPC. Lors de la pipeàminage pour mélanger, aspirez doucement et distribuez au moins 50% du volume total jusqu’à ce que les solutions soient bien mélangées. Pipette mélanger tous les mélanges maîtres contenant des enzymes. L’utilisation du vortex pour mélanger les enzymes pourrait conduire à la dénaturation et compromettre leurs performances. Pendant les purifications de perles, utilisez des solutions d’éthanol fraîchement fabriquées à 80 % à partir d’éthanol de qualité moléculaire. L’utilisation de solutions d’éthanol qui ne sont pas fraîches peut entraîner des rendements plus faibles. Évitez de sécher les perles, car cela peut réduire l’efficacité de l’élution (les perles semblent fissurées si elles sont trop séchées).
Comme décrit à l’étape 10, des amorces d’index uniques sont ajoutées à chaque réaction. Sur la base des séquences de ces indices, pour le multiplexage de bas niveau, certaines combinaisons d’indices sont optimales. Les séquences de ces indices sont nécessaires pour démultiplexer les données post-séquençage. Les séquences et les combinaisons de multiplexage recommandées sont fournies dans le tableau supplémentaire 3. Dans cette même étape, il est important de noter que le nombre de cycles PCR recommandés varie en fonction de la qualité de l’ARN utilisé, et, une certaine optimisation peut être nécessaire pour prévenir la sur-amplification PCR. Pour l’ARN ImmunoPrism Intact Control et d’autres ARN de haute qualité, commencez l’optimisation avec 10 cycles PCR. Pour l’ARN de contrôle ImmunoPrism FFPE et d’autres ARN fortement dégradés/FFPE, commencez l’optimisation avec 15 cycles PCR. Il est recommandé de produire une bibliothèque d’essai à l’aide d’ARN représentant le matériau à analyser afin d’optimiser les cycles de PCR. Le nombre minimum de cycles PCR qui donnent constamment des rendements suffisants de bibliothèque pré-capture (-200 ng) devrait être utilisé. Un pic secondaire d’environ 1000 pb sur la trace de Bioanalyzer est révélateur d’une suramplification (figure 4). La suramplification doit être réduite au minimum, mais la présence d’un petit pic secondaire n’interfère pas avec les résultats d’analyse.
Pour minimiser la perte d’échantillon et éviter les tubes de commutation, l’étape 13 peut être effectuée dans des tubes PCR, des tubes à bande ou une plaque PCR de 96 puits au lieu de 1,5 ml de microtubes, si votre concentrateur à vide le permet. Le rotor peut être enlevé sur de nombreux concentrateurs. Cela permet aux tubes ou plaques à bande de s’insérer dans le vide. La concentration sous vide peut alors être exécuté en utilisant le réglage de dessiccation aqueuse sans centrifugation. Consultez le manuel pour votre concentrateur à vide pour les instructions. Si les échantillons sont séchés dans des tubes à bande ou une plaque de 96 puits, l’étape d’hybridation peut être effectuée dans le même récipient.
Au cours de l’étape 17, assurez-vous de vortex toutes les 10-12 min pour augmenter l’efficacité de capture de perles. Tenez soigneusement les bouchons des tubes à bande chaude lors du mélange pour empêcher les tubes de s’ouvrir.
Les lavages décrits à l’étape 18 sont essentiels pour éviter une contamination non spécifique élevée et doivent être suivis de près. Assurez-vous de resuspendre complètement les perles à chaque lavage, retirez complètement les tampons de lavage, et pendant le lavage de la tampon de lavage 2, transférez les échantillons dans un tube à bande fraîche (étape 18.6.5). Assurez-vous que les perles de streptavidin sont complètement suspendues et restent en suspension pendant toute l’incubation. Les éclaboussures sur les bouchons du tube n’auront pas d’impact négatif sur la capture. Pendant les lavages à température ambiante, un mélangeur de vortex microplaque peut être utilisé pour vortexles les échantillons pour l’ensemble de la période d’incubation de deux minutes pour une résuspension plus facile. Ne laissez pas sécher les perles de streptavidin. Au besoin, prolonger les incubations dans les tampons pour éviter de sécher les perles. Si vous utilisez plus d’un tube à bande, travaillez avec un tube à bande à la fois pour chaque lavage tandis que les autres tubes à bande sont assis dans le thermocycleur. Cela peut aider à éviter de sécher les perles ou de se précipiter, ce qui entraîne une mauvaise suspension ou d’autres techniques sous-optimales. Pour les utilisateurs débutants, il n’est pas recommandé de traiter plus de 8 réactions de bibliothèque à la fois.
Les techniques actuelles de profilage immunitaire fournissent un continuum d’information - de milliers de points de données qui nécessitent une interprétation significative (séquençage de l’ARN) à un point de données individuel et discret (IHC à plex unique). Le protocole décrit ici représente une approche qui se situe quelque part au milieu, avec une portée focalisée permettant une sensibilité élevée, mais ne capturant qu’un sous-ensemble de données transcriptomiques cliniquement pertinentes. En raison de la nature de l’extraction d’ARN en vrac, ce protocole ne fournit pas d’informations sur les relations spatiales entre les cellules immunitaires et le microenvironnement tumoral, cependant, les résultats peuvent être complétés par des technologies d’imagerie pour ajouter cette information. Il existe une myriade d’applications pour les données générées par ce protocole, car il ya beaucoup à apprendre sur la biologie du cancer comme une maladie, et les thérapies en cours de développement pour le traiter. Comme le montrent les résultats représentatifs, le rapport immunitaire individuel est utile pour comprendre comment le profil immunitaire d’un patient peut changer en réponse à des événements tels que la progression de la maladie ou le traitement. Bien que les résultats présentés ici fournissent quelques exemples de cas d’utilisation, d’autres applications, y compris l’étude du mécanisme d’action d’un traitement et l’identification des biomarqueurs putatifs des résultats cliniques tels que la progression libre et la survie globale sont également Pratique. Lorsque vous utilisez ce protocole pour les applications de découverte de biomarqueurs, il est important de pratiquer une bonne conception d’étude pour s’assurer que les populations homogènes sont analysées, que des échantillons suffisants sont inclus pour la puissance statistique et que des sources de biais sont prises en considération. En raison de la nature ciblée et rationalisée de l’analyse, il est possible d’imaginer une voie vers la validation clinique et l’application en aval de ces biomarqueurs une fois découverts.

Quantification des lymphocytes infiltrants tumorales (TIL) et d’autres molécules liées au système immunitaire dans des échantillons de tissus humains tumeur savants (FFPE) corrigés de la formaline et de la paraffine (FFPE) a démontré de la valeur dans la recherche clinique1,2,3. Les techniques courantes telles que la cytométrie du débit et le séquençage de l’acide ribonucléique unicellulaire (ARN) sont utiles pour les tissus frais et le sang4, mais ne conviennent pas à l’analyse des matériaux FFPE en raison de l’incapacité de créer des suspensions cellulaires viables. Les méthodes actuelles qui ont été employées pour quantifier ces cellules dans le tissu de FFPE souffrent des défis principaux. L’immunohistochimie (IHC) et d’autres flux de travail d’imagerie similaires nécessitent des anticorps spécifiques pour détecter les protéines de surface cellulaire, qui peuvent être difficiles à normaliser entre les laboratoires pour permettre une quantification reproductible5. Les plates-formes telles que le système nCounter s’appuient sur l’expression de gènes uniques pour définir les cellules immunitaires clés6, limitant la sensibilité et la spécificité de la détection. Des méthodes de séquençage plus génériques de l’ARN, couplées à des outils logiciels autonomes, sont disponibles mais nécessitent une optimisation et une validation significatives avant d’utiliser7,8,9,10,11,12. Les progrès récents dans la combinaison de la microdissection de capture de laser (LCM) avec le séquençage d’ARN pour le tissu de FFPE s’est avéré prometteur ; cependant, une solution clé en main plus haut débit est nécessaire pour les études translationnelles visant à identifier les biomarqueurs robustes13,14. Les méthodes pour générer des biomarqueurs multidimensionnels, tels que la modélisation immunitaire prédictive, qui définissent les cohortes de patients, y compris les répondeurs thérapeutiques, les sous-types de cancer, ou les résultats de survie avec une précision prédictive élevée et une signification statistique sont de plus en plus importants à l’ère de la médecine de précision et de l’immunothérapie15,16.
Pour répondre à ce besoin, un test de profilage immunitaire a été développé pour permettre la quantification sensible et spécifique des cellules immunitaires dans le tissu FFPE de tumeur solide utilisant les réactifs normalisés de Séquençage d’ARN et l’informatique basée sur le nuage. En plus d’accommoder l’ARN dégradé du tissu FFPE, le protocole est capable d’adapter l’ARN dérivé des échantillons de tissu limitants tels que des biopsies d’aiguille de noyau, des aspirates d’aiguille, et le tissu micro- ou macro-disséqué. Les données de l’ARN de chaque échantillon sont comparées à une base de données de modèles d’expression génique de cellules immunitaires, appelées modèles immunitaires d’expression de la santé, pour quantifier les cellules immunitaires en pourcentage du total des cellules présentes dans l’échantillon. En bref, ces modèles ont été construits à l’aide de méthodes d’apprentissage automatique pour identifier les modèles d’expression multigéniques uniques à partir de données de transcriptome entier générées à partir de populations de cellules immunitaires purifiées (isolées à l’aide de marqueurs canoniques de surface cellulaire)17,18. Les modèles multidimensionnels d’expression de santé sous-jacents à la technologie permettent à l’analyse de quantifier chaque cellule immunitaire en pourcentage du total des cellules présentes dans le mélange hétérogène. Cela permet au chercheur de générer des comparaisons de cellules immunitaires inter-échantillon et intra-échantillon, qui ont été montrés pour avoir une valeur clinique19,20. D’autres applications incluent la quantification de la réponse immunitaire avant et après le traitement, comme décrit dans les résultats représentatifs. L’analyse rend compte de multiples caractéristiques de la contexture immunitaire de la tumeur et du microenvironnement tumoral, y compris les pourcentages absolus de huit types de cellules immunitaires (dérivés de modèles d’expression génique) : CD4- lymphocytes T, CD8et lymphocytes T, CD56et cellules tueuses naturelles, cD19et cellules B, CD14, monocytes, Tregs, Macrophages M1 et macrophages M2. En outre, l’analyse rapporte l’expression (dans les transcriptions par million, ou TPM) de dix gènes d’évasion immunitaire : PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1, et ARG1.
Le kit de réactif est utilisé pour préparer les bibliothèques de haute qualité à se séquencer sur une plate-forme Illumina selon une méthode hybride de préparation de la bibliothèque basée sur la capture, comme le montre la figure 1. Si un chercheur n’a pas de plate-forme de séquençage de l’illumine dans son laboratoire, il peut soumettre ses échantillons à un laboratoire de base pour le séquençage. Une fois générées, les données de séquençage sont téléchargées sur le portail Prism pour analyse automatisée, et un profil quantitatif complet pour chaque échantillon individuel, sous la forme du rapport immunitaire (figure 2A), est retourné à l’utilisateur. Les utilisateurs peuvent également définir des groupes d’échantillons dans le portail Prism pour générer un rapport sur les biomarqueurs (figure 2B), mettant en évidence des biomarqueurs statistiquement significatifs qui distinguent deux cohortes de patients. Il est important de noter que les données générées par le kit de réactif sont destinées à une utilisation de recherche seulement et ne peuvent pas être utilisées à des fins diagnostiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Figure 1 : Aperçu du flux de travail. Dans ce protocole, l’ARN est d’abord converti en cDNA. Les adaptateurs de séquençage sont ligatés, et l’ADNc à ligature adaptateur est amplifié et codé à barres par PCR pour créer une bibliothèque de pré-capture. Les sondes biotinylated sont ensuite hybridées à des cibles spécifiques d’ADNc qui sont ensuite capturées à l’aide de perles de streptavidin. L’ADNc non lié et non ciblé est éliminé par lavage. Un enrichissement final de PCR donne une bibliothèque de poteau-capture prête pour le séquençage. L’ARN total doit être à partir d’échantillons humains; peut être intact ou dégradé (FFPE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figure 2 : Rapports immunisés représentatifs. Le flux de travail génère deux rapports, un rapport immunitaire individuel (A) pour chaque échantillon traité, et un rapport de biomarqueur (B) pour les cohortes de patients définies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Le protocole nécessite environ 16 h de temps de préparation (de l’ARN total aux bibliothèques prêtes pour le séquençage); cependant, il existe un certain nombre de points d’arrêt facultatifs, comme indiqué dans le protocole. L’analyse utilise la nature riche et dynamique de la transcriptomique pour aller au-delà des biomarqueurs mono-analytes hérités pour les modèles multidimensionnels d’expression génique, permettant ainsi une caractérisation biologique complète des échantillons de tissus avec des modèles normalisés réactifs et des outils logiciels faciles à utiliser. Il permet aux chercheurs d’utiliser une technologie contemporaine dans leur propre laboratoire, en tirant parti de l’apprentissage automatique et d’une base de données de modèles d’expression de la santé pour obtenir des profils immunitaires plus précis et quantitatifs de précieux échantillons cliniques, et découvrir biomarqueurs multidimensionnels de l’ARN avec une analyse statistique complète.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Les immunothérapies montrent la promesse dans le traitement des patients d’oncologie, mais l’hétérogénéité complexe du microenvironnement de tumeur rend la réponse de traitement de prévision provocante. La capacité de résoudre les populations relatives des cellules immunitaires présentes dans et autour du tissu de tumeur s’est avérée médicalement pertinente pour comprendre la réponse, mais est limitée par des techniques traditionnelles telles que la cytométrie de flux et l’immunohistochimie ( IHC), en raison de la grande quantité de tissu nécessaire, l’absence de marqueurs de type cellulaire précis, et de nombreux obstacles techniques et logistiques. Un essai (p. ex., l’immunoprisme ImmunoPrism Immune Profiling Assay) surmonte ces défis en accommodant à la fois de petites quantités d’ARN et d’ARN hautement dégradé, caractéristiques communes de l’ARN extraitdu du tissu tumoral solide cliniquement archivé. L’essai est accessible via un kit réactif et une informatique basée sur le cloud qui fournit une solution d’immunoprofiling quantitative à haut débit de bout en bout pour les plates-formes de séquençage Illumina. Les chercheurs commencent avec aussi peu que deux sections de tissu paraffine-intégré (FFPE) de formaline-fixe (FFPE) ou 20-40 ng de l’ARN total (selon la qualité d’échantillon), et le protocole génère un rapport de profil immunitaire quantifiant huit types de cellules immunitaires et dix évasion immunisée gènes, capturant une vue complète du microenvironnement tumoral. Aucune analyse bioinformatique supplémentaire n’est requise pour utiliser les données obtenues. Avec les cohortes d’échantillon appropriées, le protocole peut également être utilisé pour identifier des biomarqueurs statistiquement significatifs au sein d’une population de patients d’intérêt.

Il existe un certain nombre de points de contrôle tout au long du protocole qui permettent à un utilisateur d’évaluer la qualité et la quantité des matériaux générés. Après l’étape 12 décrite dans le protocole, un électrophétogramme est généré comme le montre la figure 3, représentant d’une bibliothèque pré-capture typique pour un échantillon d’ARN intact (RIN 7,8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Figure 3 : Trace typique de bioanalyseur de la bibliothèque de pré-capture pour un échantillon d’ARN intact. Les bibliothèques pré-captureapparaissent comme un large pic d’environ 250 à 400 paires de base (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Il faut prendre soin d’éviter la suramplification, comme l’indique le deuxième pic d’environ 1 000 pb indiqué à la figure 4, un électrophétigramme représentatif d’une bibliothèque pré-capture générée à partir d’un échantillon d’ARN FFPE (DV200 à 46). Si ce pic est faible par rapport au pic principal (environ 250-400 paires de base (bp), comme indiqué), il n’interfèrera pas avec les étapes en aval ou l’analyse. Si le deuxième pic est important par rapport au pic de 250-400 pb, la bibliothèque de pré-capture peut être refaite avec moins de cycles PCR afin de réduire la suramplification.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Figure 4 : Trace typique de bioanalyseur de la bibliothèque pré-capture pour un échantillon d’ARN FFPE. Le deuxième pic autour de 1000 bp est révélateur d’une sur-amplification. Si ce pic est faible par rapport au pic principal autour de 250-400 bp (comme indiqué), il n’interférera pas avec les étapes en aval ou l’analyse. Si le deuxième pic est important par rapport au pic de 250-400 pb, la bibliothèque de pré-capture peut être refaite avec moins de cycles PCR afin de réduire la sur-amplification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Comme décrit à l’étape 12.1.3, la présence de dieux adaptateurs devrait être évaluée afin de déterminer si un nettoyage supplémentaire est nécessaire. Les électrophétographies présentées à la figure 5 sont représentatives des niveaux inacceptables(figure 5A, DV200 et 33) et acceptables(figure 5B, DV200 à 46) des niveaux de dimère adaptateur, apparaissant comme le pic fort autour de 128 pb.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Figure 5 : Pré-capture de la bibliothèque Bioanalyser traces. Le dimère adaptateur apparaît comme un pic abrupt autour de 128 bp. (A) Des dimères adaptateurs excessifs sont présents dans cet électrophétigramme. (B) Les niveaux acceptables de dimère adaptateur sont représentés dans cette trace. Les deux traces montrent des signes de légère sur-amplification, mais cela ne devrait pas interférer avec l’immunoprisme Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
À l’achèvement du protocole, avant le séquençage, les bibliothèques finales sont à nouveau évaluées à l’aide d’électrophoresis numériques. Les bibliothèques faites à partir de l’ARN FFPE ont tendance à avoir une distribution de taille moyenne plus petite que les bibliothèques faites à partir d’ARN intact. Pour les échantillons d’ARN intacts, la trace résultante devrait ressembler à la figure 6 (RIN no 9,5). Pour l’ARN dégradé ou FFPE, la trace résultante devrait ressembler à la figure 7 (DV200 -36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figure 6 : Trace de bioanalyseur de bibliothèque finale typique pour un échantillon d’ARN intact. Les bibliothèques finales apparaissent comme un large pic autour de 250-400 paires de base (bp) de taille. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Figure 7 : Trace typique de bioanalyseur de bibliothèque finale pour un échantillon d’ARN de FFPE. Les bibliothèques faites à partir de l’ARN FFPE ont tendance à avoir une distribution de taille moyenne plus petite que les bibliothèques faites à partir d’ARN intact. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Tel que décrit, les résultats générés par ce protocole peuvent être appliqués de deux façons clés, comme le montre la figure 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Figure 8 : Deux cas d’utilisation du protocole. Les résultats générés par cet analyse de profilage immunitaire sont appliqués dans deux applications translationnelles clés. (A) Le premier cas d’utilisation commence à partir du tissu humain solide de tumeur (y compris des archives de FFPE) et génère un profil immunitaire individuel pour l’échantillon. (B) Une fois générées pour une cohorte d’échantillons humains, les données sont combinées à l’aide du portail Prism pour générer un biomarqueur multidimensionnel et un rapport de biomarqueur correspondant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Pour démontrer chacun de ces cas d’utilisation, les données représentatives d’une petite étude translationnelle sont incluses21. Les échantillons utilisés dans cette étude sont un ensemble de spécimens de 7 patients diagnostiqués et traités pour un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Les échantillons sont des tissus tumoraux solides appariés par le patient provenant de biopsies avant et après le traitement. Premièrement, des échantillons individuels ont été analysés pour générer un profil immunitaire, comme le rapport d’exemple présenté à la figure 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figure 9 : Exemple de rapport immunitaire individuel pour un échantillon de NSCLC. Le pipeline Prism Portal génère un rapport graphique pour chaque échantillon traité, avec un rapport représentatif généré pour un échantillon de tumeur solide NSCLC montré ici. (A) La partie avant du rapport représente graphiquement la dégradation des cellules immunitaires présentes dans l’échantillon d’ARN extrait du tissu FFPE. (B) L’envers du rapport comprend un tableau des cellules immunitaires (en pourcentages absolus) et l’expression des gènes d’évasion (dans les transcriptions par million, ou TPM), ainsi qu’une déclaration de performance pour l’analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Les profils immunitaires avant et après le traitement peuvent être utilisés pour comprendre comment une thérapie (chimiothérapie ou radiothérapie, dans cette étude) a modifié le microenvironnement tumoral. Un exemple est montré à la figure 10, où les changements en pourcentage pour chaque cellule immunitaire et le contenu immunitaire total sont montrés avant et après la chimiothérapie, pour un seul patient.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figure 10 : Exemple de résultats avant et après le traitement. Des données individuelles sur les cellules immunitaires et le contenu immunitaire total générées à partir d’échantillons avant et après le traitement d’un seul patient de NSCLC sont montrées. Dans cet exemple, le patient a reçu un régime de chimiothérapie comme traitement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Les patients peuvent être regroupés par des critères tels que les résultats cliniques ou les phénotypes à des fins de comparaison. Par exemple, à la figure 11, les échantillons de l’étude du NSCLC ont été comparés en fonction du temps à la progression de la maladie après le traitement. Un sous-ensemble des patients a montré la répétition de la maladie dans les mois de 'gt;18, et un autre sous-ensemble a progressé plus rapidement, en '18 mois. La valeur médiane du delta (différence entre les valeurs avant et après le traitement) est comparée pour chaque échantillon afin d’identifier les biomarqueurs putatifs de la progression de la maladie.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figure 11 : Exemple de comparaison des résultats cliniques. Les variations quantitatives entre les pourcentages de cellules immunitaires dans les échantillons de NSCLC avant et après le traitement ont été calculées et déclarées comme la valeur « delta ». Ceux qui sont mis en évidence en jaune montrent des changements de signal clairs entre l’état de survie. Les barres bleues représentent les valeurs médianes du delta pendant 18 mois jusqu’à la progression de la maladie, les barres oranges représentent les valeurs médianes du delta pendant 18 mois jusqu’à la progression de la maladie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Enfin, des groupes d’échantillons similaires peuvent être utilisés pour examiner spécifiquement les échantillons de prétraitement afin d’identifier les biomarqueurs prédictifs en utilisant le portail Prism pour produire un rapport sur les biomarqueurs. Montré à la figure 12, le même phénotype clinique (progression de la maladie) comme décrit ci-dessus définit les groupes d’échantillons. Dans cet exemple, deux gènes d’évasion immunitaire ont été identifiés comme des différenciateurs statistiquement significatifs des groupes d’échantillons (CD47 et OX40, indiqués dans le panneau inférieur de la figure 12A). Dans cet exemple, parce que les biomarqueurs génétiques individuels sont robustes avec une signification statistique claire, le biomarqueur multidimensionnel n’ajoute pas de valeur prédictive significative (ImmunoPrism, tel qu’il est étiqueté dans le graphique de la barre supérieure droite de la figure 12B). Le tableau complet des données, y compris les résultats des 18 analytes pour l’analyse, est résumé à l’envers du rapport, y compris l’analyse statistique et un bref résumé des méthodes.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Figure 12 : Exemple de rapport de biomarqueur pour les échantillons du NSCLC. Le pipeline Biomarker Discovery fournit un rapport visuel de biomarqueurs individuels et un biomarqueur multidimensionnel à apprentissage automatique, avec des statistiques détaillées. (A) Dans le cadre de cette étude, le pipeline a identifié deux biomarqueurs individuels (CD47 et OX40) comme statistiquement significatifs pour définir la progression de la maladie avec un seuil de 18 mois. (B) Les détails sur la méthode et les résultats complets sont inclus sur le revers du rapport. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Matériaux de kit de réactif. Une liste des documents fournis dans le kit ImmunoPrism sont énumérés, ainsi que les numéros de pièces qui ont fait référence dans le protocole du fabricant. Tous les autres équipements et matériaux requis sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. Visitez <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> pour les fiches de données de sécurité (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).</a>
Tableau supplémentaire 2 : Programmes de cycle thermique. Les programmes de cycler recommandés référencés tout au long du protocole sont résumés pour faciliter la programmation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).</a>
Tableau supplémentaire 3 : Guide de l’indice de séquençage. Les amorces d’index fournies dans le kit de réactif sont énumérées ; une amorce unique est ajoutée à chaque réaction pour le démultiplexage post-séquençage. Des combinaisons de multiplexage de bas niveau recommandées sont également fournies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

L’utilisation d’une approche basée sur l’ARN pour déterminer les profils immunitaires quantitatifs des tissus tumoraux solides et tirer parti des cohortes cliniques pour la découverte de biomarqueurs immuno-oncologie est décrite au moyen d’un protocole moléculaire et informatique.

Modélisation immunitaire prédictive des tumeurs solides

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

La caractérisation complète du microenvironnement tumoral est essentielle dans la recherche en immuno-oncologie. Cet essai est le premier à utiliser des modèles d’expression de santé basés sur l’ARN pour mesurer les cellules immunitaires dans le tissu tumoral solide. Cet essai permet aux chercheurs d’obtenir des mesures très sensibles et spécifiques de la contexturation immunitaire dans les tissus tumoraux solides FFB et de combiner ces résultats en un biomarqueur multidimensionnel.Tous les traitements contre le cancer, pas seulement les immunothérapies, provoquent une réponse immunitaire à l’emplacement de la tumeur solide. La mesure de cette réponse immunitaire est importante pour comprendre la progression de la maladie et les réponses thérapeutique. Ce protocole combine les techniques traditionnelles de préparation de la bibliothèque d’ARN avec la capture ciblée.Bien que long, suivre les étapes de lavage et surveiller les points de contrôle de la qualité comme suggéré est très important pour le succès. Pour l’ARN fortement dégradé provenant d’échantillons incorporés de paraffine fixe à la formaline, assemblez la première réaction de synthèse des brins sur la glace selon le tableau. Bien mélanger les réactions en descendant plusieurs fois avant de faire tourner brièvement les échantillons dans une microcentrifugeuse.À la fin de la centrifugation, placez immédiatement les échantillons dans un cycleur thermique préchauffé suivant le programme numéro trois de la table. Pour un ARN intact de haute qualité, assemblez la première réaction de synthèse des brins sur la glace dans un tube PCR sans nucléase tel que décrit dans les tableaux. Pour commencer cette procédure, mélangez 200 nanogrammes de la bibliothèque d’intérêt codée à barres avec deux microgrammes d’ADN COT-1 et deux microlitres d’oligos bloquants dans un tube PCR sans nucléase.Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide réglé à 30 à 45 degrés Celsius pour sécher le contenu du tube. Après hybridation, retirez les échantillons du cycleur thermique et réglez le cycleur thermique à incuber à 65 degrés Celsius avec le couvercle chauffé fixé à 70 degrés Celsius. Utilisez une pipette multicanal pour transférer 17 microlitres de perles entièrement homogénéisées aux échantillons et pipette complètement de haut en bas 10 fois.Pour lier l’ADN aux perles, placez les tubes dans le cycleur thermique suivant le programme 10 en enlevant brièvement les tubes dépouillés toutes les 10 à 12 minutes pendant trois secondes de vortex doux pour garder les perles résuspendus. Immédiatement après l’incubation de liaison, retirer une bande de tubes du cycleur thermique et ajouter 100 microlitres de tampon de lavage préchauffé aux tubes. Pipette complètement de haut en bas 10 fois et placer les tubes sur une grille magnétique pour permettre aux perles de se séparer complètement de la solution de lavage avant d’aspirer l’ADN non lié contenant du surnatant.Retirer les tubes de la grille et ajouter 150 microlitres de tampon de lavage rigoureux préchauffé avec un mélange complet pour résuspendre complètement les perles en prenant soin d’éviter les bulles. Remettre les tubes dans le cycleur thermique à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de remettre les tubes sur la grille magnétique pour permettre aux perles de se séparer complètement des surnatants. Jetez l’ADN non lié contenant des supernatants, lavez les perles une fois de plus avec un tampon de lavage rigoureux préchauffé comme il vient de le démontrer pour un total de deux lavages rigoureux.Après le dernier lavage, retirer le supernatant et ajouter 150 microlitres de tampon de lavage à température ambiante aux tubes. Pipette le lavage 10 à 20 fois pour résusquer complètement les perles et incuber les échantillons avec le couvercle scellé pendant deux minutes en alternant entre le vortex pendant 30 secondes et le repos pendant 30 secondes. À la fin de l’incubation, centrifugeuse brièvement et placer les tubes sur la grille magnétique et enlever le supernatant une fois que les perles ont pleinement adhéré à l’aimant.Centrifuger brièvement les tubes avec les bouchons fermés et retourner les échantillons à la grille magnétique. Utilisez une pipette de 10 microlitres pour éliminer tout tampon de lavage résiduel et ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage à température ambiante deux. Pipette le lavage 10 à 20 fois pour résusquer complètement les perles et incuber les échantillons avec les couvercles scellés pendant deux minutes en alternant entre le vortex pendant 30 secondes et le repos pendant 30 secondes.Après une brève centrifugation, transférer tout le volume de perles de chaque tube dans des tubes PCR propres sans nucléase et placer les tubes sur le support magnétique. Après avoir jeté l’ADN non lié contenant des supernatants, centrifugez brièvement les échantillons à nouveau et utilisez une pipette de 10 microlitres pour enlever tout tampon de lavage résiduel des perles pendant qu’ils sont dans la grille magnétique. Ajouter 150 microlitres de tampon de lavage trois aux tubes et pipette de haut en bas 10 à 20 fois pour résuspendre complètement les perles.Incuber le tube pendant deux minutes en alternant entre 30 secondes de vortex doux et 30 secondes de repos avant de centrifuger brièvement. Placez les tubes sur la grille magnétique pour aspirer les supernatants et centrifugez brièvement les échantillons de perles à nouveau. Utilisez une pipette de 10 microlitres pour enlever tout tampon de lavage résiduel des perles pendant qu’elles sont dans la grille magnétique avant d’enlever les tubes de la grille et de réutiliser les perles dans 20 microlitres d’eau sans nucléase par tube.Puis pipette les perles 10 fois pour s’assurer que toutes les perles collées sur le côté des tubes ont été résuspendus. La présence de dimers adaptateur doit être évaluée pour déterminer si un nettoyage supplémentaire est nécessaire. Par exemple, cet électrophétogramme montre un niveau acceptable de dimère adaptateur qui apparaît comme un pic aigu autour de 128 paires de base tandis que cet électrophétogramme montre un niveau inacceptable de dimère adaptateur.Les profils immunitaires avant et après le traitement peuvent être utilisés pour comprendre les effets d’une thérapie spécifique sur le microenvironnement tumoral comme dans cette analyse représentative pour laquelle les changements de pourcentage pour chaque cellule immunitaire d’intérêt et la teneur immunitaire totale sont montrés avant et après la chimiothérapie pour un seul patient. Dans cette analyse, des échantillons entre les groupes de patients ont été comparés selon leur temps à la progression de la maladie après traitement. Un sous-ensemble des patients a montré la répétition de la maladie après 18 mois tandis qu’un autre sous-ensemble a progressé plus rapidement en 18 mois ou moins.La valeur médiane du delta pourrait alors être comparée pour chaque échantillon afin d’identifier les biomarqueurs putatifs de la progression de la maladie. Par exemple, ici, deux gènes d’évasion immunitaire ont été identifiés comme différenciateurs statistiquement significatifs des groupements d’échantillons. Puisque les biomarqueurs individuels de gène étaient robustes avec la signification statistique claire, le biomarqueur multidimensionnel n’a pas ajouté la valeur prédictive significative.Assurez-vous d’effectuer les lavages chauffés une bande à la fois pour empêcher le refroidissement de l’échantillon et n’oubliez pas de transférer les perles dans des tubes frais pour éviter la contamination hors cible. Ce protocole démontre l’utilisation de modèles d’expression génétique pour quantifier les cellules immunitaires et les tissus tumoraux. De nouveaux modèles sont en cours de développement pour mesurer les états cellulaires tels que l’épuisement ou l’activation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Recherche

Immunologie et infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sept étapes pour Stellate Cellules

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Différencier les rôles fonctionnels de l&#39;expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l&#39;intestin de souris par greffe de moelle osseuse

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...