Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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Die Autoren möchten die TriStar Technology Group für die Bereitstellung der biologischen Proben für die repräsentativen Ergebnisse sowie die gesamten molekularen, Analyse-, Produkt- und Handelsteams von Cofactor Genomics für ihr technisches Know-how und ihre Unterstützung.

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	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Alle Autoren sind bei Cofactor Genomics, Inc. beschäftigt, dem Unternehmen, das das ImmunPrism Reagenzkit und die in diesem Artikel verwendeten Informatik-Tools entwickelt und produziert. Der ImmunoPrism Assay ist nur für Die Forschung und ist nicht für den Einsatz in diagnostischen Verfahren.

Das Protokoll benötigt 20 ng intakte oder 40 ng stark abgebaute (FFPE) RNA. Die RNA-Probe sollte frei von DNA, Salzen (z. B. Mg2+oder Guanidiniumsalzen), divalenten Kationenchelisierungsmitteln (z. B. EDTA, EGTA, Citrat) oder organischen Stoffen (z. B. Phenol und Ethanol) sein. Es wird nicht empfohlen, mit RNA-Proben fortzufahren, die eine DV200 <20% haben. Die Verwendung der In-Kit-Kontroll-RNA wird dringend empfohlen, da diese Kontrollen eine Möglichkeit bieten, die Leistung im gesamten Protokoll zu bewerten, von der Bibliotheksvorbereitung bis zur Analyse.
Das Protokoll ist für die Verwendung von 0,2 ml PCR-Streifenrohren ausgelegt. Falls gewünscht, kann das Protokoll auch mit den Brunnen in einer 96-Well-PCR-Platte durchgeführt werden. Verwenden Sie einfach die Bohrungen einer 96-Well-PCR-Platte anstelle aller Verweise auf PCR-Röhren oder Bandröhren. Verwenden Sie PCR-Platten nur mit klaren Brunnen, da es wichtig ist, die vollständige Resuspension von Perlen während der Perlenreinigung und Waschschritte visuell zu bestätigen.
Während des gesamten Protokolls reagenzien gefroren oder auf Eis aufbewahren, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie Reagenzien erst, wenn sie vollständig aufgetaut sind. Achten Sie darauf, alle Reagenzien vor der Verwendung gründlich zu mischen.
Die Enzyme bei -20 °C aufbewahren, bis sie einsatzbereit sind, und nach Gebrauch sofort auf -20 °C zurückkehren. Verwenden Sie nur molekulartaugliches Nuklease-freies Wasser; es wird nicht empfohlen, DEPC-behandeltes Wasser zu verwenden. Beim Pipetieren zum Mischen, vorsichtig ansaugen und mindestens 50% des Gesamtvolumens abgeben, bis die Lösungen gut vermischt sind. Pipette mischen alle Master-Mischungen, die Enzyme enthalten. Die Verwendung von Wirbel zum Mischen der Enzyme könnte zu Einer Denaturierung führen und ihre Leistung beeinträchtigen. Verwenden Sie bei der Perlenreinigung frisch hergestellte 80% Ethanollösungen aus molekularem Ethanol. Die Verwendung von Ethanollösungen, die nicht frisch sind, kann zu geringeren Erträgen führen. Vermeiden Sie das Übertrocknen der Perlen, da dies die Elutionseffizienz reduzieren kann (Perlen sehen geknackt aus, wenn sie übergetrocknet sind).
Wie in Schritt 10 beschrieben, werden jeder Reaktion eindeutige Indexprimer hinzugefügt. Basierend auf den Sequenzen dieser Indizes sind für Low-Level-Multiplexing bestimmte Indexkombinationen optimal. Die Sequenzen dieser Indizes sind für die Entmultiplexung der Daten nach der Sequenzierung erforderlich. Die Sequenzen und empfohlenen Multiplex-Kombinationen sind in Der Ergänzenden Tabelle 3aufgeführt. In diesem Schritt ist es wichtig zu beachten, dass die Anzahl der empfohlenen PCR-Zyklen je nach qualität der verwendeten RNA variiert, und, einige Optimierung kann erforderlich sein, um PCR-Überverstärkung zu verhindern. Für die ImmunoPrism Intact Control RNA und andere hochwertige RNA starten Sie die Optimierung mit 10 PCR-Zyklen. Für die ImmunoPrism FFPE Control RNA und andere stark degradierte/FFPE RNA starten Sie die Optimierung mit 15 PCR-Zyklen. Es wird empfohlen, eine Testbibliothek mit RNA zu erstellen, die für das zu analysierende Material repräsentativ ist, um die PCR-Zyklen zu optimieren. Es sollte die minimale Anzahl von PCR-Zyklen verwendet werden, die konsistent ausreichende Ausbeuten von Bibliotheksergebnissen vor der Erfassung (>200 ng) liefern. Ein sekundärer Spitzenwert um 1000 bp auf der Bioanalyzer-Spur deutet auf eine Überverstärkung hin (Abbildung 4). Die Überverstärkung sollte minimiert werden, aber das Vorhandensein einer kleinen sekundären Spitze wird die Testergebnisse nicht beeinträchtigen.
Um den Probenverlust zu minimieren und Schaltrohre zu vermeiden, kann Schritt 13 in PCR-Röhren, Streifenrohren oder einer 96-Well-PCR-Platte anstelle von 1,5 ml Mikroröhren durchgeführt werden, wenn Ihr Vakuumkonzentrator dies zulässt. Der Rotor kann auf vielen Konzentratoren entfernt werden. Dadurch können die Bandrohre oder Platten in das Vakuum passen. Die Vakuumkonzentration kann dann ohne Zentrifugation mit der wässrigen Trocknungseinstellung ausgeführt werden. Anweisungen finden Sie im Handbuch ihres Vakuumkonzentrators. Werden die Proben in Bandröhren oder einer 96-Well-Platte getrocknet, kann der Hybridisierungsschritt im selben Gefäß durchgeführt werden.
Achten Sie in Schritt 17 darauf, alle 10-12 min zu wirbeln, um die Effizienz der Perlenerfassung zu erhöhen. Halten Sie die Kappen der warmen Bandrohre beim Mischen vorsichtig fest, um zu verhindern, dass sich Die Rohre öffnen.
Die in Schritt 18 beschriebenen Wähdaten sind entscheidend, um eine hohe unspezifische Kontamination zu vermeiden, und müssen genau beobachtet werden. Achten Sie darauf, die Perlen bei jeder Wäsche vollständig wieder aufzuhängen, die Waschpuffer vollständig zu entfernen und während des Waschpuffers 2 die Proben in ein frisches Streifenrohr zu geben (Schritt 18.6.5). Stellen Sie sicher, dass die Streptavidin-Perlen vollständig resuspendiert sind und während der gesamten Inkubation in Suspension bleiben. Das Spritzen auf den Rohrkappen wirkt sich nicht negativ auf die Erfassung aus. Während der Raumtemperaturwähungen kann ein Mikroplattenwirbelmischer verwendet werden, um die Proben während der gesamten zweiminütigen Inkubationszeit für eine einfachere Resuspension zu wirbeln. Lassen Sie die Streptavidin-Perlen nicht austrocknen. Bei Bedarf in den Puffern Brutmittel ausdehnen, um das Trocknen der Perlen zu vermeiden. Wenn Sie mehr als ein Streifenrohr verwenden, arbeiten Sie für jede Wäsche mit einem Streifenrohr nach dem anderen, während die anderen Streifenrohre im Thermocycler sitzen. Dies kann dazu beitragen, über das Trocknen der Perlen oder Rauschen zu vermeiden, was zu einer schlechten Resuspension oder anderen suboptimalen Techniken führt. Für Erstbenutzer wird nicht empfohlen, mehr als 8 Bibliotheksreaktionen gleichzeitig zu verarbeiten.
Aktuelle Immunprofilierungstechniken liefern ein Kontinuum an Informationen - von Tausenden von Datenpunkten, die eine signifikante Interpretation (RNA-Sequenzierung) erfordern, bis hin zu einem individuellen, diskreten Datenpunkt (Single-Plex IHC). Das hier beschriebene Protokoll stellt einen Ansatz dar, der sich irgendwo in der Mitte befindet, mit einem fokussierten Bereich, der eine hohe Empfindlichkeit ermöglicht, aber nur eine Teilmenge klinisch relevanter transkriptomischer Daten erfasst. Aufgrund der Art der Massen-RNA-Extraktion liefert dieses Protokoll keine Informationen über die räumlichen Beziehungen zwischen Immunzellen und der Tumormikroumgebung, jedoch können die Ergebnisse durch bildgebende Technologien ergänzt werden, um diese Informationen hinzuzufügen. Es gibt eine Vielzahl von Anwendungen für die durch dieses Protokoll generierten Daten, da es viel über die Biologie von Krebs als Krankheit und die Therapien, die entwickelt werden, um es zu behandeln, zu lernen gibt. Wie aus den repräsentativen Ergebnissen hervorgeht, ist der individuelle Immunbericht nützlich, um zu verstehen, wie sich das Immunprofil eines Patienten als Reaktion auf Ereignisse wie das Fortschreiten der Erkrankung oder die Behandlung ändern kann. Während die hier vorgestellten Ergebnisse einige Beispielanwendungsfälle liefern, sind andere Anwendungen, einschließlich der Untersuchung des Wirkmechanismus einer Therapie und der Identifizierung von vermeintlichen Biomarkern klinischer Ergebnisse wie progressionsfrei und Gesamtüberleben, ebenfalls praktisch. Bei der Verwendung dieses Protokolls für Biomarker-Erkennungsanwendungen ist es wichtig, ein gutes Studiendesign zu praktizieren, um sicherzustellen, dass homogene Populationen analysiert werden, ausreichende Proben für die statistische Leistung enthalten sind und Verzerrungsquellen berücksichtigt werden. Aufgrund der fokussierten, schlanken Natur des Assays ist es möglich, sich einen Weg zur klinischen Validierung und nachgelagerten Anwendung dieser Biomarker vorzustellen, sobald sie entdeckt wurden.

Quantifizierung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) und anderen immunbedingten Molekülen in formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) soliden Tumor-Humangewebeproben hat in der klinischen Forschung einen Wert gezeigt1,2,3. Häufige Techniken wie Durchflusszytometrie und singlezellige Ribonukleinsäure (RNA) Sequenzierung sind nützlich für frisches Gewebe und Blut4, aber sind ungeeignet für die Analyse von FFPE-Materialien aufgrund der Unfähigkeit, lebensfähige Zellsuspensionen zu schaffen. Aktuelle Methoden, die zur Quantifizierung dieser Zellen im FFPE-Gewebe verwendet wurden, leiden unter großen Herausforderungen. Die Immunhistochemie (IHC) und andere ähnliche bildgebende Arbeitsabläufe erfordern spezifische Antikörper zum Nachweis von Zelloberflächenproteinen, die laborübergreifend nur schwer zu standardisieren sind, um eine reproduzierbare Quantifizierung zu ermöglichen5. Plattformen wie das nCounter-System verlassen sich auf die Expression einzelner Gene, um wichtige Immunzellen zu definieren6, wodurch die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises begrenzt wird. Allgemeinere RNA-Sequenzierungsmethoden, gekoppelt mit eigenständigen Software-Tools, sind verfügbar, erfordern jedoch eine signifikante Optimierung und Validierung vor der Verwendung7,8,9,10,11,12. Die jüngsten Fortschritte bei der Kombination von Lasercapture Microdissection (LCM) mit RNA-Sequenzierung für FFPE-Gewebe haben sich als vielversprechend erwiesen; Für translationale Studien zur Identifizierung robuster Biomarker13,14ist jedoch eine schlüsselfertigere Lösung mit höherem Durchsatz erforderlich. Methoden zur Erzeugung multidimensionaler Biomarker, wie z. B. Predictive Immune Modeling, die Patientenkohorten einschließlich Therapie-Responder, Krebssubtypen oder Überlebensergebnisse mit hoher Vorhersagegenauigkeit und statistischer Signifikanz definieren, werden im Zeitalter der Präzisionsmedizin und Immuntherapie immerwichtiger.
Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurde ein Immunprofiling-Assay entwickelt, um eine empfindliche und spezifische Quantifizierung von Immunzellen in soliden Tumor-FFPE-Geweben mit standardisierten RNA-Sequenzierungsreagenzien und Cloud-basierter Informatik zu ermöglichen. Neben der Aufnahme degradierter RNA aus FFPE-Gewebe ist das Protokoll in der Lage, RNA aus begrenzenden Gewebeproben wie Kernnadelbiopsien, Nadelaspirierungen und mikro- oder makroseziertem Gewebe aufzunehmen. RNA-Daten aus jeder Probe werden mit einer Datenbank von Genexpressionsmodellen von Immunzellen, den so genannten Immun-Gesundheitsexpressionsmodellen, verglichen, um Immunzellen als Prozentsatz der gesamtin der Probe vorhandenen Zellen zu quantifizieren. Kurz gesagt, wurden diese Modelle mit maschinellen Lernmethoden erstellt, um einzigartige multigene Expressionsmuster aus Ganzentranskriptomdaten zu identifizieren, die aus gereinigten Immunzellpopulationen (isoliert mit kanonischen Zell-Oberflächen-Markern)17,18erzeugt wurden. Die der Technologie zugrunde liegenden multidimensionalen Gesundheitsexpressionsmodelle ermöglichen es dem Assay, jede Immunzelle als Prozent der gesamtin der heterogenen Mischung vorhandenen Zellen zu quantifizieren. Dies ermöglicht es dem Forscher, Inter- und Intra-Sample-Immunzellvergleiche zu erzeugen, die nachweislich einen klinischen Wertvon 19,20haben. Weitere Anwendungen sind die Quantifizierung der Immunantwort vor und nach der Behandlung, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. Der Assay berichtet über mehrere Merkmale der Immunkontexturierung des Tumors und der Tumormikroumgebung, einschließlich der absoluten Prozentsätze von acht Immunzelltypen (abgeleitet aus Genexpressionsmodellen): CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD56+ Natural Killer-Zellen, CD19+ B-Zellen, CD14+ Monozyten, Tregs, M1-Makrophagen und M2-Makrophagen. Darüber hinaus meldet der Assay die Expression (in Transkripten pro Million oder TPM) von zehn Immun-Escape-Genen: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 und ARG1.
Das Reagenzien-Kit wird verwendet, um qualitativ hochwertige Bibliotheken für die Sequenzierung auf einer Illumina-Plattform nach einer hybriden Capture-basierten Bibliotheksvorbereitungsmethode bereit zu machen, wie in Abbildung 1dargestellt. Wenn ein Forscher keine Illumina-Sequenzierungsplattform in seinem Labor hat, kann er seine Proben zur Sequenzierung an ein Kernlabor übermitteln. Nach der Erstellung werden Sequenzierungsdaten zur automatisierten Analyse in das Prism-Portal hochgeladen, und dem Benutzer wird ein umfassendes, quantitatives Profil in Form des Immunberichts (Abbildung 2A) zurückgegeben. Benutzer können auch Stichprobengruppierungen im Prismenportal definieren, um einen Biomarker-Bericht zu erstellen (Abbildung 2B), in dem statistisch signifikante Biomarker hervorgehoben werden, die zwei Patientenkohorten unterscheiden. Wichtig ist, dass die vom Reagenzien-Kit generierten Daten nur für Forschungszwecke bestimmt sind und nicht für diagnostische Zwecke verwendet werden dürfen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über den Workflow. In diesem Protokoll wird DIE RNA zuerst in cDNA umgewandelt. Sequenzierungsadapter sind ligattiert, und adaptor-ligated cDNA wird von PCR verstärkt und barcodet, um eine Pre-Capture-Bibliothek zu erstellen. Biotinylierte Sonden werden dann zu bestimmten cDNA-Zielen hybridisiert, die dann mit Streptavidinperlen erfasst werden. Ungebundene, nicht zielgerichtete cDNA wird durch Waschen entfernt. Eine abschließende PCR-Anreicherung ergibt eine Nach-Capture-Bibliothek, die für die Sequenzierung bereit ist. *Die gesamte RNA muss aus menschlichen Proben stammen; intakte oder degradierte (FFPE) RNA sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Immunberichte. Der Workflow generiert zwei Berichte, einen individuellen Immunbericht (A) für jede verarbeitete Probe und einen Biomarker-Bericht (B) für definierte Patientenkohorten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das Protokoll benötigt ca. 16 h Vorbereitungszeit (von der gesamten RNA bis zu Bibliotheken, die für die Sequenzierung bereit sind); Es gibt jedoch eine Reihe von optionalen Haltepunkten, wie im Protokoll erwähnt. Der Assay nutzt die reiche, dynamische Natur der Transkriptomik, um über ältere Einzelanalyten-Biomarker zu multidimensionalen Genexpressionsmodellen überzugehen und so eine umfassende biologische Charakterisierung von Gewebeproben mit standardisierten Reagenzien und benutzerfreundliche Software-Tools. Es versetzt Forscher in die Lage, eine moderne Technologie in ihrem eigenen Labor zu nutzen, indem sie maschinelles Lernen und eine Datenbank von Health Expression Models nutzen, um genauere, quantitative requantitative Immunprofile wertvoller klinischer Proben abzuleiten und multidimensionale RNA-Biomarker mit vollständiger statistischer Analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Immuntherapien versprechen die Behandlung von onkologischen Patienten, aber die komplexe Heterogenität der Tumormikroumgebung macht die Vorhersage des Behandlungsreaktionens schwierig. Die Fähigkeit, die relativen Populationen von Immunzellen im und um das Tumorgewebe aufzulösen, hat sich als klinisch relevant für das Verständnis der Reaktion erwiesen, ist jedoch durch traditionelle Techniken wie Durchflusszytometrie und Immunhistochemie eingeschränkt ( IHC), aufgrund der großen Menge an Gewebe erforderlich, Mangel an genauen Zelltyp Marker, und viele technische und logistische Hürden. Ein Assay (z.B. der ImmunoPrism Immune Profiling Assay) überwindet diese Herausforderungen, indem er sowohl kleine Mengen an RNA als auch stark degradierte RNA, gemeinsame Merkmale von RNA, die aus klinisch archiviertem festem Tumorgewebe extrahiert werden, aufträgt. Der Zugriff auf den Test erfolgt über ein Reagenzien-Kit und Cloud-basierte Informatik, die eine durchgängige quantitative Immunprofilierungslösung mit hohem Durchsatz für Illumina-Sequenzierungsplattformen bietet. Die Forscher beginnen mit nur zwei Abschnitten formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE)-Gewebe oder 20-40 ng der gesamten RNA (je nach Probenqualität), und das Protokoll erzeugt einen Immunprofilbericht, der acht Immunzelltypen und zehn Immunescape- eine vollständige Sicht auf die Tumormikroumgebung. Für die Nutzung der resultierenden Daten ist keine zusätzliche bioinformatische Analyse erforderlich. Mit den entsprechenden Stichprobenkohorten kann das Protokoll auch verwendet werden, um statistisch signifikante Biomarker innerhalb einer Patientenpopulation von Interesse zu identifizieren.

Es gibt eine Reihe von Prüfpunkten im gesamten Protokoll, die es einem Benutzer ermöglichen, die Qualität und Quantität der generierten Materialien zu bewerten. Nach Schritt 12, der im Protokoll beschrieben wird, wird ein Elektropherogramm erzeugt, wie in Abbildung 3dargestellt, das für eine typische Pre-Capture-Bibliothek für eine intakte RNA-Probe (RIN = 7.8) steht.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Abbildung 3: Typische Pre-Capture Library Bioanalyzer-Spur für eine intakte RNA-Probe. Pre-Capture-Bibliotheken erscheinen als breiter Spitzenwert von etwa 250-400 Basenpaaren (bp) in der Größe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Es sollte darauf geachtet werden, eine Überverstärkung zu vermeiden, wie aus dem zweiten Peak um 1.000 bp in Abbildung 4,einem repräsentativen Elektropherogramm einer aus einer FFPE-RNA-Probe erzeugten FFPE-RNA-Probe (DV200 = 46), hervorgeht. Wenn dieser Peak im Verhältnis zum Hauptgipfel (etwa 250-400 Basenpaare (bp), wie gezeigt), klein ist, wird er nicht mit nachgelagerten Schritten oder Analysen stören. Wenn der zweite Peak im Verhältnis zum 250-400 bp-Peak groß ist, kann die Pre-Capture-Bibliothek mit weniger PCR-Zyklen neu hergestellt werden, um die Überverstärkung zu reduzieren.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Abbildung 4: Typische Pre-Capture Library Bioanalyzer-Ablaufverfolgung für eine FFPE-RNA-Probe. Der zweite Spitzenwert um 1.000 bp deutet auf eine Überverstärkung hin. Wenn dieser Peak im Verhältnis zum Hauptgipfel um 250-400 bp klein ist (wie gezeigt), wird er die nachgelagerten Schritte oder die Analyse nicht beeinträchtigen. Wenn der zweite Peak im Verhältnis zum 250-400 bp-Peak groß ist, kann die Pre-Capture-Bibliothek mit weniger PCR-Zyklen neu hergestellt werden, um eine Überverstärkung zu reduzieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Wie in Schritt 12.1.3 beschrieben, sollte das Vorhandensein von Adapterdimermen bewertet werden, um festzustellen, ob eine zusätzliche Bereinigung erforderlich ist. Die in Abbildung 5 dargestellten Elektropherogramme sind repräsentativ für inakzeptable (Abbildung 5A, DV200 = 33) und akzeptable(Abbildung 5B, DV200 = 46) Mengen des Adapter-Dimers, der als scharfer Spitzenwert um 128 bp erscheint.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Abbildung 5: Voraberfassungsbibliothek Bioanalyzer-Spuren. Der Adapter-Dimer zeigt sich als scharfer Peak um 128 bp. (A) Übermäßige Adapter-Dimere sind in diesem Elektropherogramm vorhanden. (B) In dieser Spur sind akzeptable Adapter-Dimer-Ebenen dargestellt. Beide Spuren zeigen Hinweise auf eine leichte Überverstärkung, aber dies sollte den ImmunoPrism-Assay nicht stören. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Nach Abschluss des Protokolls werden vor der Sequenzierung die endgültigen Bibliotheken erneut mittels digitaler Elektrophorese ausgewertet. Bibliotheken aus FFPE-RNA haben tendenziell eine geringere durchschnittliche Größenverteilung als Bibliotheken aus intakter RNA. Bei intakten RNA-Proben sollte die resultierende Spur bild 6 ähnlich aussehen (RIN = 9.5). Bei degradierter oder FFPE-RNA sollte die resultierende Spur abbildung 7 (DV200 = 36) ähnlich aussehen.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Abbildung 6: Typische Endbibliothek Bioanalyzer-Spur für eine intakte RNA-Probe. Endgültige Bibliotheken erscheinen als breiter Peak um 250-400 Basenpaare (bp) in der Größe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Abbildung 7: Typische Endbibliothek Bioanalyzer-Ablaufverfolgung für eine FFPE-RNA-Probe. Bibliotheken aus FFPE-RNA haben tendenziell eine geringere durchschnittliche Größenverteilung als Bibliotheken aus intakter RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Wie beschrieben, können die mit diesem Protokoll generierten Ergebnisse auf zwei wichtige Arten angewendet werden, wie in Abbildung 8dargestellt.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Abbildung 8: Zwei Anwendungsfälle des Protokolls. Die Ergebnisse dieses Immunprofiling-Assays werden in zwei wichtigen Translationsanwendungen angewendet. (A) Der erste Anwendungsfall beginnt mit menschlichem, solidem Tumorgewebe (einschließlich FFPE-Archiven) und erzeugt ein individuelles Immunprofil für die Probe. (B) Einmal für eine Kohorte menschlicher Proben generiert, werden die Daten mit dem Prismportal kombiniert, um einen multidimensionalen Biomarker und den entsprechenden Biomarker-Bericht zu generieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um jeden dieser Anwendungsfälle zu veranschaulichen, sind repräsentative Daten aus einer kleinen translationalen Studie enthalten21. Bei den in dieser Studie verwendeten Proben handelt es sich um eine Reihe von Proben von 7 Patienten, die bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) diagnostiziert und behandelt wurden. Die Proben sind patientengerechtes, festes Tumorgewebe aus Biopsien vor und nach der Behandlung. Zunächst wurden einzelne Proben analysiert, um ein Immunprofil zu erzeugen, wie z. B. der in Abbildung 9dargestellte Beispielbericht .
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Abbildung 9: Beispiel für einen individuellen Immunbericht für eine NSCLC-Probe. Die Prism Portal-Pipeline generiert für jede verarbeitete Probe einen grafischen Bericht, wobei ein repräsentativer Bericht für eine NSCLC-Volumentumorprobe generiert wird. (A) Die Vorderseite des Berichts zeigt grafisch den Abbau von Immunzellen in der aus dem FFPE-Gewebe extrahierten RNA-Probe. (B) Die Rückseite des Berichts enthält eine Tabelle der Immunzellen (in absoluten Prozentsätzen) und der Escape-Genexpression (in Transkriptionen pro Million oder TPM) sowie eine Leistungsaufstellung für den Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Immunprofile vor und nach der Behandlung können verwendet werden, um zu verstehen, wie eine Therapie (Chemotherapie oder Bestrahlung, in dieser Studie) die Tumormikroumgebung verändert hat. Ein Beispiel ist in Abbildung 10dargestellt, in dem die prozentualen Veränderungen für jede Immunzelle und der Gesamtimmungehalt vor und nach der Chemotherapie für einen einzelnen Patienten dargestellt werden.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Abbildung 10: Beispiel ergebnisse für die Vor- und Nachbehandlung. Gezeigt werden individuelle Immunzellen- und Gesamtimmuninhaltsdaten, die aus Proben vor und nach der Behandlung eines einzelnen NSCLC-Patienten generiert wurden. In diesem Beispiel erhielt der Patient eine Chemotherapie als Behandlung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Patienten können nach Kriterien wie klinischen Ergebnissen oder Phänotypen zum Vergleich gruppiert werden. In Abbildung 11wurden beispielsweise die Proben in der NSCLC-Studie nach der Zeit bis zur Krankheitsprogression nach der Behandlung verglichen. Eine Teilmenge der Patienten zeigte ein Wiederauftreten der Erkrankung in >18 Monaten, und eine andere Teilmenge schritt schneller voran, in 18 Monaten. Der mediane Deltawert (Differenz zwischen Vor- und Nachbehandlungswerten) wird für jede Probe verglichen, um vermeintliche Biomarker des Krankheitsverlaufs zu identifizieren.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Abbildung 11: Beispiel Für den Vergleich mit dem klinischen Ergebnis. Quantitative Veränderungen zwischen den Immunzellprozentsätzen in übereinstimmenden NSCLC-Proben vor und nach der Behandlung wurden berechnet und als "Delta"-Wert gemeldet. Die gelb markierten zeigen deutliche Signalwechsel zwischen dem Überlebensstatus. Blaue Balken stellen mediane Deltawerte für >18 Monate bis zum Fortschreiten der Erkrankung dar, orange Balken stellen mediane Deltawerte für 18 Monate bis zum Fortschreiten der Erkrankung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Schließlich können ähnliche Stichprobengruppierungen verwendet werden, um probenspezifisch zu untersuchen, um prädiktive Biomarker zu identifizieren, indem sie das Prismportal verwenden, um einen Biomarker-Bericht zu erstellen. In Abbildung 12ist der gleiche klinische Phänotyp (Krankheitsprogression) wie oben beschrieben definiert die Stichprobengruppierungen. In diesem Beispiel wurden zwei Immun-Escape-Gene als statistisch signifikante Unterscheidungsmerkmale der Stichprobengruppierungen identifiziert (CD47 und OX40, dargestellt im unteren Bereich von Abbildung 12A). Da in diesem Beispiel die einzelnen Genbiomarker robust mit klarer statistischer Signifikanz sind, fügt der multidimensionale Biomarker keinen signifikanten Vorhersagewert hinzu (ImmunoPrism, wie im oberen rechten Balkendiagramm von Abbildung 12B). Die vollständige Tabelle der Daten, einschließlich der Ergebnisse für alle 18 Analyten für den Assay, ist auf der Rückseite des Berichts zusammengefasst, einschließlich statistischer Analysen und einer kurzen Zusammenfassung der Methoden.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Abbildung 12: Beispiel Biomarker-Bericht für NSCLC-Proben. Die Biomarker Discovery-Pipeline liefert einen visuellen Bericht über einzelne Biomarker und einen maschinell lernenden multidimensionalen Biomarker mit detaillierten Statistiken. (A) Für diese Studie identifizierte die Pipeline zwei einzelne Biomarker (CD47 und OX40) als statistisch signifikant für die Definition des Krankheitsverlaufs mit einem Schwellenwert von 18 Monaten. (B) Auf der Rückseite des Berichts sind Einzelheiten zur Methode und zu den vollständigen Ergebnissen enthalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Zusatztabelle 1: Reagenz-Kit-Materialien. Eine Liste der im ImmunoPrism Kit bereitgestellten Materialien wird zusammen mit den Teilenummern aufgeführt, auf die im Herstellerprotokoll verwiesen wird. Alle anderen erforderlichen Ausrüstungen und Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Besuchen Sie <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> für Sicherheitsdatenblätter (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Ergänzende Tabelle 2: Thermische Cycler-Programme. Die empfohlenen Cycler-Programme, auf die im gesamten Protokoll verwiesen wird, werden zur Vereinfachung der Programmierung zusammengefasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Ergänzende Tabelle 3: Sequencing Index Guide. Die im Reagenz-Kit enthaltenen Indexprimer sind aufgeführt; Jeder Reaktion für die Entmultiplexing nach der Sequenzierung wird eine einzigartige Grundierung hinzugefügt. Empfohlene Low-Level-Multiplex-Kombinationen sind ebenfalls vorhanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Die Verwendung eines RNA-basierten Ansatzes zur Bestimmung quantitativer Immunprofile von soliden Tumorgeweben und zur Nutzung klinischer Kohorten für die Entdeckung von bioonkologischen Biomarkern wird durch molekulare und informatikische Protokolle beschrieben.

Predictive Immune Modeling von Solid Tumoren

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Eine umfassende Charakterisierung der Tumormikroumgebung ist in der immunonkologischen Forschung unerlässlich. Dieser Test ist der erste, der RNA-basierte Gesundheitsexpressionsmodelle verwendet, um Immunzellen in festem Tumorgewebe zu messen. Dieser Test ermöglicht es Forschern, hochempfindliche und spezifische Messungen der Immunkontexture in FFB-Volumenkörpern zu gewinnen und diese Ergebnisse zu einem mehrdimensionalen Biomarker zu kombinieren.Alle Krebsbehandlungen, nicht nur Immuntherapien, lösen eine Immunantwort an der Stelle des soliden Tumors aus. Die Messung dieser Immunantwort ist wichtig für das Verständnis der Krankheitsprogression und der Therapiereaktionen. Dieses Protokoll kombiniert traditionelle RNA-Bibliotheksvorbereitungstechniken mit gezielter Erfassung.Während zeitaufwändig, die Einhaltung der Waschschritte und überwachung der Qualitätskontrollpunkte wie vorgeschlagen ist sehr wichtig für den Erfolg. Für stark degradierte RNA aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Proben, montieren Sie die erste Strangsynthesereaktion auf Eis nach der Tabelle. Mischen Sie die Reaktionen gründlich, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen, bevor Sie die Proben in einer Mikrozentrifuge kurz herunterdrehen.Am Ende der Zentrifugation die Proben sofort in einen vorgewärmten Thermocycler nach Programm Nummer drei vom Tisch legen. Für hochwertige intakte RNA, montieren Sie die erste Strangsynthesereaktion auf Eis in einem nukleasefreien PCR-Rohr, wie in den Tabellen beschrieben. Um dieses Verfahren zu beginnen, mischen Sie 200 Nanogramm der Barcode-Bibliothek von Interesse mit zwei Mikrogramm COT-1 DNA und zwei Mikroliter blockierenden Oligos in einem nukleasefreien PCR-Rohr.Verwenden Sie dann einen Vakuumkonzentrator, der auf 30 bis 45 Grad Celsius eingestellt ist, um den Inhalt des Rohres zu trocknen. Nach der Hybridisierung entfernen Sie die Proben aus dem thermischen Cycler und stellen Sie den Thermischen Cycler auf 65 Grad Celsius ein, wobei der beheizte Deckel auf 70 Grad Celsius eingestellt ist. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 17 Mikroliter vollständig homogenisierte Perlen auf die Proben und Pipette gründlich nach oben und unten 10 Mal zu übertragen.Um die DNA an die Perlen zu binden, legen Sie die Röhren nach Programm 10 nach Programm 10 kurz die abgestreiften Rohre alle 10 bis 12 Minuten für drei Sekunden sanften Wirbels zu entfernen, um die Perlen resuspended zu halten. Unmittelbar nach der Bindungsinkubation einen Rohrstreifen aus dem Thermocycler entfernen und 100 Mikroliter vorgewärmten Waschpuffer sanieren. Pipette gründlich 10 Mal nach oben und unten und legen Sie die Rohre auf einem magnetischen Rack, damit die Perlen vollständig von der Waschlösung trennen können, bevor Sie die ungebundene DNA, die Überstand enthält, ansischen.Entfernen Sie die Rohre aus dem Rack und fügen Sie 150 Mikroliter vorgewärmten strengen Waschpuffer mit gründlicher Mischung, um die Perlen vollständig wieder zu suspendieren, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Rohre fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius wieder in den Thermocycler, bevor Sie die Rohre wieder auf das Magnetgestell legen, damit sich die Perlen vollständig von den Überräufern trennen können. Entsorgen Sie die ungebundene DNA, die Überwasserungsmittel enthält, waschen Sie die Perlen noch einmal mit einem vorgewärmten strengen Waschpuffer, wie gerade für insgesamt zwei strenge Waschungen nachgewiesen wurde.Nach der letzten Wäsche den Überstand entfernen und 150 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer in die Rohre geben. Die Wäsche 10 bis 20 Mal waschen, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen und die Proben mit dem Deckel zwei Minuten lang abgedichtet, abwechselnd zwischen Wirbeln für 30 Sekunden und 30 Sekunden ruhend. Am Ende der Inkubation zentrieren Sie kurz und legen Sie die Rohre auf das magnetische Rack und entfernen Sie den Überstand, sobald die Perlen vollständig am Magneten haften.Zentrifugieren Sie die Rohre kurz mit geschlossenen Kappen und geben Sie die Proben an das Magnetgestell zurück. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um einen Restwaschpuffer zu entfernen und 150 Mikroliter Raumtemperatur-Waschpuffer zwei hinzuzufügen. Die Wäsche 10 bis 20 Mal waschen, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen und die Proben mit den für zwei Minuten versiegelten Deckeln zwischen wirbelnden 30 Sekunden und 30 Sekunden ruhenden Proben zu bebrüten.Nach einer kurzen Zentrifugation das gesamte Volumen der Perlen aus jedem Rohr in saubere nukleasefreie PCR-Rohre übertragen und die Rohre auf das Magnetgestell legen. Nachdem Sie die ungebundene DNA, die Überdringungsmittel enthält, entsorgt haben, zentrieren Sie die Proben kurz wieder und verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um Restwaschpuffer aus den Perlen zu entfernen, während sie sich im magnetischen Rack befinden. Fügen Sie 150 Mikroliter Waschpuffer drei in die Rohre und Pipette nach oben und unten 10 bis 20 Mal, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen.Inkubieren Sie das Rohr für zwei Minuten abwechselnd zwischen 30 Sekunden sanfter Wirbelung und 30 Sekunden Ruhe vor kurzzentrifugieren. Legen Sie die Rohre auf das Magnetgestell, um die Überräube zu aspirieren und die Perlenproben kurz wieder zentrifugieren. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um Restwaschpuffer aus den Perlen zu entfernen, während sie sich im magnetischen Rack befinden, bevor Sie die Rohre aus dem Rack entfernen und die Perlen in 20 Mikroliter nukleasefreiem Wasser pro Rohr wieder aufhängen.Dann Pipette die Perlen 10 mal, um sicherzustellen, dass alle Perlen an der Seite der Rohre geklebt wurden resuspended. Das Vorhandensein von Adapter-Dimeren sollte ausgewertet werden, um festzustellen, ob eine zusätzliche Bereinigung erforderlich ist. Zum Beispiel zeigt dieses Elektropherogramm einen akzeptablen Füllstand von Adapterdimer, der als scharfe Spitze um 128 Basenpaare erscheint, während dieses Elektropherogramm einen inakzeptablen Füllstand an Adapterdimer zeigt.Die Immunprofile vor und nach der Behandlung können verwendet werden, um die Auswirkungen einer spezifischen Therapie auf die Tumormikroumgebung zu verstehen, wie in dieser repräsentativen Analyse, für die die prozentualen Veränderungen für jede Immunzelle von Interesse und der gesamte Immungehalt vor und nach der Chemotherapie für einen einzelnen Patienten angezeigt werden. In dieser Analyse wurden die Proben zwischen den Patientengruppen nach ihrer Zeit bis zum Krankheitsverlauf nach der Behandlung verglichen. Eine Teilmenge der Patienten zeigte ein Wiederauftreten der Erkrankung nach 18 Monaten, während eine andere Teilmenge in 18 oder weniger Monaten schneller voranschritt.Der mediane Deltawert könnte dann für jede Probe verglichen werden, um vermeintliche Biomarker des Krankheitsverlaufs zu identifizieren. So wurden hier beispielsweise zwei Immun-Escape-Gene als statistisch signifikante Unterscheidungsmerkmale der Probengruppierungen identifiziert. Da die einzelnen Genbiomarker robust und statistisch klar signifikant waren, hat der mehrdimensionale Biomarker keinen signifikanten Vorhersagewert beigemessen.Achten Sie darauf, die erhitzten Wärvorgänge einen Streifen nach dem anderen durchzuführen, um eine Probenkühlung zu verhindern, und denken Sie daran, die Perlen in frische Rohre zu übertragen, um eine Verunreinigung außerhalb des Ziels zu vermeiden. Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von Genexpressionsmodellen zur Quantifizierung von Immunzellen und Tumorgewebe. Neue Modelle werden entwickelt, um Zellzustände wie Erschöpfung oder Aktivierung zu messen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolation von Fettgewebe Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...