Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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Gli autori desiderano riconoscere TriStar Technology Group per aver fornito gli esemplari biologici per i risultati rappresentativi, nonché l'intero team molecolare, di analisi, di prodotto e commerciale di Cofactor Genomics per le loro competenze tecniche e Supporto.

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	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. 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Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. 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American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Tutti gli autori sono impiegati da Cofactor Genomics, Inc., l'azienda che ha sviluppato e prodotto il kit di reagente ImmunoPrism e gli strumenti informatici utilizzati in questo articolo. Il test immunoprisma è solo per uso di ricerca e non è per l'uso nelle procedure diagnostiche.

Il protocollo richiede 20 ng intatto o 40 ng RNA altamente degradato (FFPE). Il campione di RNA deve essere privo di DNA, sali (ad es. sali mg2o sali di guanidinium), agenti di chelatazione di cation divalent (ad esempio, EDTA, EGTA, Citrate) o organici (ad esempio, fenolo ed etanolo). Non è consigliabile procedere con campioni di RNA con un DV200 <20%. L'uso dell'RNA di controllo in-kit è fortemente raccomandato in quanto questi controlli forniscono un mezzo per valutare le prestazioni durante l'intero protocollo, dalla preparazione della libreria all'analisi.
Il protocollo è progettato per essere eseguito utilizzando tubi a strisce PCR da 0,2 mL. Se si preferisce, il protocollo può essere eseguito anche utilizzando i pozze in una piastra PCR 96-well. Basta usare i pozze di una piastra PCR 96-well al posto di tutti i riferimenti atubi PCR o tubi a strisce. Utilizzare piastre PCR solo con pozzi chiari, in quanto è fondamentale confermare visivamente la sospensione completa delle perline durante le purificazioni del tallone e le fasi di lavaggio.
Per tutto il protocollo, mantenere i reagenti congelati o sul ghiaccio se non diversamente specificato. Non utilizzare reagenti fino a quando non sono completamente scongelati. Assicurarsi di mescolare accuratamente tutti i reagenti prima dell'uso.
Mantenere gli enzimi a -20 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'uso e si ritorna a -20 gradi centigradi prontamente dopo l'uso. Utilizzare solo acqua priva di nuclea sinuosità molecolare; non è consigliabile utilizzare acqua trattata con DEPC. Durante la miscelaggio da miscelare, aspirare delicatamente e erogare almeno il 50% del volume totale fino a quando le soluzioni sono ben miscelate. Pipette mescolare tutte le miscele master contenenti enzimi. L'uso del vortice per mescolare gli enzimi potrebbe portare alla denaturazione e compromettere le loro prestazioni. Durante le purificazioni del tallone, utilizzare soluzioni di etanolo appena fatte all'80% da etanolo di grado molecolare. L'utilizzo di soluzioni di etanolo che non sono fresche può comportare rese inferiori. Evitare di asciugare eccessivamente le perline, in quanto ciò può ridurre l'efficienza di eluizione (le perle sembrano incrinate se asciugate troppo).
Come descritto nel passaggio 10, i primer dell'indice univoco vengono aggiunti a ogni reazione. In base alle sequenze di questi indici, per il multiplexing di basso livello, alcune combinazioni di indici sono ottimali. Le sequenze di questi indici sono necessarie per la demultiplexing dei dati dopo la sequenza. Le sequenze e le combinazioni di multiplexing consigliate sono disponibili nella Tabella supplementare 3. In questo stesso passaggio, è importante notare che il numero di cicli PCR raccomandati varia a seconda della qualità dell'RNA utilizzato e, potrebbe essere necessaria qualche ottimizzazione per prevenire l'amplificazione PCR. Per l'RNA di controllo intact OimmunoPrism e altri RNA di alta qualità, inizia l'ottimizzazione con 10 cicli PCR. Per l'RNA di controllo ImmunoPrism FFPE e altri RNA di controllo altamente degradati/FFPE, avviare l'ottimizzazione con 15 cicli PCR. Si consiglia di produrre una libreria di prova utilizzando il rappresentante RNA del materiale da analizzare al fine di ottimizzare i cicli di PCR. Deve essere utilizzato il numero minimo di cicli PCR che producono in modo coerente rendimenti di librerie pre-cattura sufficienti (>200 ng). Un picco secondario di circa 1000 bp sulla traccia Bioanalyzer è indicativo di sovraamplificazione (Figura 4). L'amplificazione eccessiva deve essere ridotta al minimo, ma la presenza di un piccolo picco secondario non interferisce con i risultati del test.
Per ridurre al minimo la perdita del campione ed evitare tubi di commutazione, il passaggio 13 può essere eseguito in tubi PCR, tubi a strisce o in una piastra PCR da 96 pozzeprima invece di microtubi da 1,5 mL, se il concentratore a vuoto lo consente. Il rotore può essere rimosso su molti concentratori. Ciò consente ai tubi a strisce o alle piastre di adattarsi nel vuoto. La concentrazione del vuoto può quindi essere eseguita utilizzando l'impostazione di disidratazione acquosa senza centrifugazione. Consultare il manuale per il concentratore di vuoto per istruzioni. Se i campioni vengono essiccati in tubi a strisce o in una piastra da 96 pozze, la fase di ibridazione può essere eseguita nello stesso recipiente.
Durante la fase 17, assicurarsi di vortice ogni 10-12 min per aumentare l'efficienza di cattura del tallone. Tenere con attenzione i tappi dei tubi a strisce calde durante la miscelazione per evitare l'apertura dei tubi.
I lavamenti descritti al punto 18 sono fondamentali per evitare un'elevata contaminazione non specifica e devono essere seguiti da vicino. Assicurarsi di risospendere completamente le perline ad ogni lavaggio, rimuovere completamente i tamponi di lavaggio e, durante il lavaggio del buffer di lavaggio 2, trasferire i campioni in un tubo a striscia fresca (Passaggio 18.6.5). Assicurarsi che le perle streptavidin siano completamente sospese e rimangano in sospensione durante l'intera incubazione. Spruzzare sui tappi del tubo non avrà un impatto negativo sulla cattura. Durante i fusti a temperatura ambiente, un miscelatore di vortice a micropiastra può essere utilizzato per vorticare i campioni per l'intero periodo di incubazione di due minuti per una sospensione più facile. Non lasciare asciugare le perline streptavidin. Se necessario, estendere le incubazioni nei cuscinetti per evitare di asciugare le perline. Se si utilizza più di un tubo a strisce, lavorare con un tubo a strisce alla volta per ogni lavaggio mentre gli altri tubi striscia sedersi nel termociclore. Questo può aiutare a evitare di asciugare eccessivamente le perline o correre, con conseguente scarsa sospensione o altre tecniche sub-ottimali. Per gli utenti per la prima volta, non è consigliabile elaborare più di 8 reazioni della libreria alla volta.
Le attuali tecniche di profilazione immunitaria forniscono un continuum di informazioni - da migliaia di punti dati che richiedono un'interpretazione significativa (sequenziamento dell'RNA) a un singolo punto dati discreto (IHC monoplesso). Il protocollo qui descritto rappresenta un approccio che si trova da qualche parte nel mezzo, con un ambito mirato che consente un'elevata sensibilità, ma cattura solo un sottoinsieme di dati trascrittomici clinicamente rilevanti. A causa della natura dell'estrazione di massa di RNA, questo protocollo non fornisce informazioni sulle relazioni spaziali tra le cellule immunitarie e il microambiente tumorale, tuttavia, i risultati possono essere integrati con tecnologie di imaging per aggiungere queste informazioni. Ci sono una miriade di applicazioni per i dati generati da questo protocollo, in quanto c'è molto da imparare sulla biologia del cancro come una malattia, e le terapie in fase di sviluppo per trattarlo. Come mostrato nei risultati rappresentativi, il rapporto immunitario individuale è utile per comprendere come il profilo immunitario di un paziente può cambiare in risposta a eventi come la progressione della malattia o il trattamento. Mentre i risultati qui presentati forniscono alcuni esempi di casi d'uso, altre applicazioni, tra cui lo studio del meccanismo di azione di una terapia e l'identificazione di biomarcatori putativi degli esiti clinici come progressione libera e sopravvivenza globale sono anche Pratico. Quando si utilizza questo protocollo per le applicazioni di scoperta di biomarcatori, è importante praticare una buona progettazione di studio per garantire che le popolazioni omogenee vengano analizzate, che siano inclusi campioni sufficienti per l'energia statistica e che vengano considerate le fonti di bias. A causa della natura mirata e snella del saggio, è possibile immaginare un percorso verso la convalida clinica e l'applicazione a valle di questi biomarcatori una volta scoperti.

La quantificazione dei linfociti infiltranti di tumore (TIL) e di altre molecole immunitarie correlate nei campioni di tumore umano solido (FFPE) fissati in formalina e paraffina (FFPE) ha dimostrato valore nella ricerca clinica1,2,3. Tecniche comuni come la citometria di flusso e il sequenziamento dell'acido ribonucleico a cellule singole (RNA) sono utili per i tessuti freschi e il sangue4, ma non sono adatte per l'analisi dei materiali FFPE a causa dell'incapacità di creare sospensioni cellulari vitali. Gli attuali metodi che sono stati utilizzati per quantificare queste cellule nel tessuto FFPE soffrono di grandi sfide. L'immunoistochimica (IHC) e altri flussi di lavoro di imaging simili richiedono anticorpi specifici per rilevare le proteine della superficie cellulare, che possono essere difficili da standardizzare tra i laboratori per consentire la quantificazione riproducibile5. Piattaforme come il sistema nCounter si basano sull'espressione di singoli geni per definire le principali cellule immunitarie6,limitando la sensibilità e la specificità del rilevamento. Sono disponibili metodi di sequenziamento dell'RNA più generici, insieme a strumenti software autonomi, ma richiedono un'ottimizzazione e una convalida significative prima dell'usodi 7,8,9,10,11,12. Recenti progressi nella combinazione della microdissezione di cattura laser (LCM) con il sequenziamento dell'RNA per il tessuto FFPE hanno mostrato una promessa; tuttavia, per gli studi traslazionali, è necessaria una soluzione più ad alta produttività e chiavi in mano, che mira a identificare biomarcatori robusti13,14. Metodi per generare biomarcatori multidimensionali, come la modellazione immunitaria predittiva, che definiscono le coorti dei pazienti, tra cui i soccorritori terapeutici, i sottotipi di cancro o gli esiti di sopravvivenza con elevata precisione predittiva e significato statistico stanno diventando sempre più importanti nell'era della medicina di precisione e dell'immunoterapia15,16.
Per rispondere a questa esigenza, è stato sviluppato un test di profilazione immunitaria per consentire la quantificazione sensibile e specifica delle cellule immunitarie nel tessuto FFPE del tumore solido utilizzando reagenti standardizzati di sequenziamento dell'RNA e informazione basata su nubi. Oltre ad accomodare l'RNA degradato dal tessuto FFPE, il protocollo è in grado di ospitare l'RNA derivato dalla limitazione di campioni di tessuto come biopsie di aghi centrali, aspirati di aghi e tessuto micro o macro-sezionato. I dati dell'RNA di ogni campione vengono confrontati con un database di modelli di espressione genica di cellule immunitarie, chiamati modelli di espressione immunitaria dell'integrità, per quantificare le cellule immunitarie come percentuale delle cellule totali presenti nel campione. In breve, questi modelli sono stati costruiti utilizzando metodi di apprendimento automatico per identificare modelli di espressione multigenici unici da dati di interi trascrittiomi generati da popolazioni di cellule immunitarie purificate (utilizzando marcatori di superficie cellulare canonica isolati)17,18. I modelli multidimensionali di Health Expression Models alla base della tecnologia consentono al saggio di quantificare ogni cellula immunitaria come percentuale delle cellule totali presenti nella miscela eterogenea. Ciò consente al ricercatore di generare confronti di cellule immunitarie tra e intracampioni, che hanno dimostrato di avere un valore clinico19,20. Altre applicazioni includono la quantificazione della risposta immunitaria pre e post-trattamento, come descritto nei risultati rappresentativi. Il saggio riporta molteplici caratteristiche della contesto immunitaria del microambiente tumorale e tumorale, comprese le percentuali assolute di otto tipi di cellule immunitarie (derivati da modelli di espressione genica): CD4- cellule T, CD8- cellule T, CD56- Cellule Killer naturale, CD19- cellule B, CD14- monociti, Treg, macrofagi M1 e macrofagi M2. Inoltre, il saggio riporta l'espressione (in trascrizioni per milione, o TPM) di dieci geni di fuga immunitaria: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 e ARG1.
Il kit di reagent viene utilizzato per rendere le librerie di alta qualità pronte per la sequenziazione su una piattaforma Illumina seguendo un metodo di preparazione della libreria ibrida basata sull'acquisizione, come illustrato nella Figura 1. Se un ricercatore non ha una piattaforma di sequenziamento Illumina nel loro laboratorio, possono inviare i loro campioni a un laboratorio di base per il sequenziamento. Una volta generati, i dati di sequenziamento vengono caricati nel portale Prism per l'analisi automatizzata e un profilo quantitativo completo per ogni singolo campione, sotto forma di Rapporto Immunosito(Figura 2A), viene restituito all'utente. Gli utenti possono anche definire raggruppamenti di campioni nel portale Prism per generare un rapporto sui biomarcatori (Figura 2B),evidenziando biomarcatori statisticamente significativi che distinguono due coorti di pazienti. È importante sottolineare che i dati generati dal kit di reagenti sono solo per uso di ricerca e non possono essere utilizzati per scopi diagnostici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro. In questo protocollo, l'RNA viene prima convertito in cDNA. Gli adattatori di sequenziamento sono legati e cDNA con collegamento adattatore viene amplificato e codificato a barre da PCR per creare una libreria di pre-cattura. Le sonde biotinylated vengono quindi ibridate a specifici obiettivi cDNA che vengono poi catturati utilizzando perline streptavidine. Il cDNA non associato e non mirato viene rimosso mediante lavaggio. Un arricchimento PCR finale produce una libreria post-cattura pronta per il sequenziamento. L'RNA totale deve provenire da campioni umani; rna può essere intatto o degradato (FFPE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figura 2: Rapporti immunitari rappresentativi. Il flusso di lavoro genera due report, un rapporto immunitario individuale (A) per ogni campione elaborato e un rapporto di biomarcatore (B) per le coorti di pazienti definite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il protocollo richiede circa 16 h di tempo di preparazione (dall'RNA totale alle librerie pronte per il sequenziamento); tuttavia, esistono diversi punti di arresto facoltativi, come indicato nel protocollo. Il saggio si avvale della natura ricca e dinamica della trascrittomica per andare oltre i biomarcatori a singolo analita legacy a modelli multidimensionali di espressione genica, consentendo così una caratterizzazione biologica completa dei campioni di tessuto con standardizzazione reagenti e strumenti software facili da usare. Permette ai ricercatori di utilizzare una tecnologia contemporanea nel proprio laboratorio, sfruttando l'apprendimento automatico e un database di health Expression Models per ricavare profili immunitari quantitativi più accurati di preziosi campioni clinici e scoprire biomarcatori multidimensionali dell'RNA con analisi statistiche complete.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Le immunoterapie mostrano una promessa nel trattamento dei pazienti oncologici, ma l'eterogeneità complessa del microambiente tumorale rende difficile prevedere la risposta al trattamento. La capacità di risolvere le popolazioni relative di cellule immunitarie presenti dentro e intorno al tessuto tumorale ha dimostrato di essere clinicamente rilevante per comprendere la risposta, ma è limitata da tecniche tradizionali come la citometria di flusso e l'immunoistochimica ( IHC), a causa della grande quantità di tessuto richiesto, mancanza di indicatori di tipo cellulare accurati, e molti ostacoli tecnici e logistici. Un test (ad esempio, l'ImmunoPrism Immune Profiling Assay) supera queste sfide accogliendo sia piccole quantità di RNA che RNA altamente degradato, caratteristiche comuni dell'RNA estratto dal tessuto tumorale solido clinicamente archiviato. Il saggio è accessibile tramite un kit di reagenti e un'informatica basata su cloud che fornisce una soluzione di immunoprofiling quantitativa e ad alta velocità finale per le piattaforme di sequenziamento Illumina. I ricercatori iniziano con un minimo di due sezioni di tessuto incorporato in paraffina fissata in formalina (FFPE) o 20-40 ng di RNA totale (a seconda della qualità del campione), e il protocollo genera un rapporto del profilo immunitario che quantifica otto tipi di cellule immunitarie e dieci fuga immunitaria geni, catturando una visione completa del microambiente tumorale. Non è necessaria alcuna ulteriore analisi bioinformatica per utilizzare i dati risultanti. Con le coorti campione appropriate, il protocollo può essere utilizzato anche per identificare biomarcatori statisticamente significativi all'interno di una popolazione di pazienti di interesse.

Ci sono un certo numero di punti di controllo in tutto il protocollo che consentono all'utente di valutare la qualità e la quantità dei materiali generati. Dopo la fase 12 descritta nel protocollo, viene generato un elettroferogramma come illustrato nella Figura 3, rappresentativo di una tipica libreria di pre-cattura per un campione di RNA intatto (RIN - 7,8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Figura 3: Tipica traccia di Bioanalyzer della libreria pre-cattura per un campione di RNA intatto. Le librerie di pre-cattura appaiono come un picco ampio di circa 250-400 coppie di base (bp) di dimensioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Occorre prestare attenzione a evitare la sovraamplificazione, come indicato dal secondo picco di circa 1.000 bp illustrato nella Figura 4, un elettroferogramma rappresentativo di una libreria di pre-cattura generata da un campione di RNA FFPE (DV200 x 46). Se questo picco è piccolo rispetto al picco principale (circa 250-400 coppie di basi (bp), come mostrato), non interferirà con i passaggi a valle o l'analisi. Se il secondo picco è grande rispetto al picco di 250-400 bp, la libreria di pre-cattura può essere rifatta con meno cicli PCR al fine di ridurre la sovraamplificazione.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Figura 4: Tipica traccia di bioanalisi della libreria pre-cattura per un campione di RNA FFPE. Il secondo picco di circa 1.000 bp è indicativo di sovra-amplificazione. Se questo picco è piccolo rispetto al picco principale di circa 250-400 bp (come mostrato), non interferirà con i passaggi a valle o l'analisi. Se il secondo picco è grande rispetto al picco di 250-400 bp, la libreria di pre-cattura può essere rifatta con meno cicli PCR al fine di ridurre l'amplificazione eccessiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Come descritto nel passaggio 12.1.3, la presenza di dimeri adattatori deve essere valutata per determinare se è necessaria una pulizia aggiuntiva. Gli elettroferigrammi illustrati nella Figura 5 sono rappresentativi di livelli inaccettabili(Figura 5A, DV200 , 33) e accettabili (Figura 5B, DV200 x 46), che appaiono come il picco forte intorno ai 128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Figura 5: Tracce di Bioanalyzer della libreria pre-cattura. Il dimero dell'adattatore si presenta come un picco forte di circa 128 bp. (A) Sono presenti dimeri di adattatori eccessivi in questo elettroferogramma. (B) In questa traccia sono rappresentati livelli accettabili di dimeri di adattatori. Entrambe le tracce mostrano prove di una lieve eccessivamente amplificazione, ma questo non dovrebbe interferire con il saggio immunoprismo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Al completamento del protocollo, prima del sequenziamento, le librerie finali vengono nuovamente valutate utilizzando l'elettroforesi digitale. Le biblioteche a base di RNA FFPE tendono ad avere una distribuzione di dimensioni medie più piccole rispetto alle librerie fatte di RNA intatto. Per i campioni di RNA intatti, la traccia risultante dovrebbe essere simile alla Figura 6 (RIN - 9,5). Per l'RNA degradato o FFPE, la traccia risultante dovrebbe essere simile alla Figura 7 (DV200 x 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figura 6: Tipica traccia di Bioanalyzer della libreria finale per un campione di RNA intatto. Le librerie finali appaiono come un picco ampio di circa 250-400 coppie di base (bp) di dimensioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Figura 7: Tipica traccia di bioanalyzer della libreria finale per un campione di RNA FFPE. Le biblioteche a base di RNA FFPE tendono ad avere una distribuzione di dimensioni medie più piccole rispetto alle librerie fatte di RNA intatto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Come descritto, i risultati generati con questo protocollo possono essere applicati in due modi chiave, come illustrato nella Figura 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Figura 8: Due casi d'uso del protocollo. I risultati generati da questo test di profilazione immunitaria vengono applicati in due applicazioni traslazionali chiave. (A) Il primo caso d'uso parte dal tessuto tumorale solido umano (compresi gli archivi FFPE) e genera un profilo immunitario individuale per il campione. (B) Una volta generati per una coorte di campioni umani, i dati vengono combinati utilizzando il portale Prism per generare un biomarcatore multidimensionale e il corrispondente rapporto sui biomarcatori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per dimostrare ciascuno di questi casi d'uso, i dati rappresentativi di un piccolo studio traslazionale sono inclusi21. I campioni utilizzati in questo studio sono una serie di campioni da 7 pazienti diagnosticati e trattati per il cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC). I campioni sono tessuti tumorali solidi abbinati al paziente da biopsie pre e post-trattamento. In primo luogo, sono stati analizzati singoli campioni per generare un profilo immunitario, ad esempio il report di esempio illustrato nella figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figura 9: Esempio di rapporto immunitario individuale per un campione NSCLC. La pipeline del portale Prism genera un report grafico per ogni campione elaborato, con un report rappresentativo generato per un campione di tumore solido NSCLC illustrato di seguito. (A) Il lato anteriore della relazione illustra graficamente la ripartizione delle cellule immunitarie presenti nel campione di RNA estratto dal tessuto FFPE. (B) Il rovescio della relazione comprende una tabella delle cellule immunitarie (in percentuale assoluta) e l'espressione genica di fuga (in trascrizioni per milione, o TPM), nonché una dichiarazione di prestazioni per il saggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I profili immunitari pre e post-trattamento possono essere utilizzati per capire come una terapia (chemioterapia o radiazione, in questo studio) ha modificato il microambiente tumorale. Un esempio è illustrato nella figura 10, in cui i cambiamenti di percentuale per ogni cellula immunitaria e il contenuto immunitario totale sono mostrati prima e post chemioterapia, per un singolo paziente.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figura 10: Risultati di esempio pre e post-trattamento. Vengono mostrati i dati delle singole cellule immunitarie e del contenuto immunitario totale generati da campioni pre e post-trattamento provenienti da un singolo paziente NSCLC. In questo esempio, il paziente ha ricevuto un regime di chemioterapia come trattamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I pazienti possono essere raggruppati in base a criteri quali esiti clinici o fenotipi per il confronto. Ad esempio, nella figura 11, i campioni nello studio NSCLC sono stati confrontati in base al tempo alla progressione della malattia dopo il trattamento. Un sottoinsieme dei pazienti ha mostrato la recidiva della malattia in >18 mesi, e un altro sottoinsieme è progredito più velocemente, in 18 mesi. Il valore delta mediano (differenza tra i valori pre e post-trattamento) viene confrontato per ogni campione per identificare i biomarcatori putativi della progressione della malattia.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figura 11: Esempio di confronto dei risultati clinici. Le variazioni quantitative tra le percentuali di cellule immunitarie nei campioni NSCLC pre e post-trattamento corrispondenti sono state calcolate e segnalate come valore "delta". Quelli evidenziati in giallo mostrano chiari cambiamenti di segnale tra lo stato di sopravvivenza. Le barre blu rappresentano valori delta mediani per >18 mesi fino alla progressione della malattia, le barre arancioni rappresentano valori delta mediani per 18 mesi fino alla progressione della malattia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Infine, raggruppamenti di campioni simili possono essere utilizzati per esaminare in modo specifico i campioni pre-trattamento per identificare i biomarcatori predittivi utilizzando il portale Prism per generare un rapporto sui biomarcatori. Mostrato nella figura 12, lo stesso fenotipo clinico (progressione della malattia) come descritto sopra definisce i raggruppamenti di campioni. In questo esempio, due geni di fuga immunitaria sono stati identificati come differenziatori statisticamente significativi dei raggruppamenti di campioni (CD47 e OX40, mostrati nel pannello inferiore della figura 12A). In questo esempio, poiché i singoli biomarcatori genici sono robusti con una chiara significatività statistica, il biomarcatore multidimensionale non aggiunge un valore predittivo significativo (ImmunoPrism, come etichettato nel grafico a barre in alto a destra della figura 12B). La tabella completa dei dati, compresi i risultati di tutti i 18 analiti per il saggio, è riassunta sul retro della relazione, compresa l'analisi statistica e una breve sintesi dei metodi.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Figura 12: Esempio di rapporto Biomarker per i campioni NSCLC. La pipeline Biomarker Discovery fornisce un rapporto visivo dei singoli biomarcatori e un biomarcatore multidimensionale di apprendimento automatico, con statistiche dettagliate. (A) Per questo studio, la conduttura ha identificato due singoli biomarcatori (CD47 e OX40) statisticamente significativi per definire la progressione della malattia con una soglia di 18 mesi. (B) I dettagli sul metodo e i risultati completi sono inclusi sul retro del report. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella supplementare 1: Materiali del kit di reagenti. Viene elencato un elenco dei materiali forniti nel kit ImmunoPrism, insieme ai numeri di parte a cui si fa riferimento nel protocollo del produttore. Tutte le altre attrezzature e materiali necessari sono elencati nella Tabella dei Materiali. Visitare <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> per schede tecniche di sicurezza (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>
Tabella supplementare 2: Programmi del ciclore termico. I programmi cycler consigliati a cui si fa riferimento durante il protocollo sono riepilogati per semplificare la programmazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>
Tabella supplementare 3: Guida all'indice di sequenziamento. Sono elencati i primer dell'indice forniti nel kit di reagenti; a ogni reazione viene aggiunto un primer univoco per la demultiplexing post-sequenziamento. Sono inoltre disponibili combinazioni di multiplexing di basso livello consigliate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

L'uso di un approccio basato sull'RNA per determinare i profili immunitari quantitativi dei tessuti tumorali solidi e sfruttare le coorti cliniche per la scoperta di biomarcatori immuno-oncologici è descritto attraverso un protocollo molecolare e informatico.

Modellazione immunitaria predittiva dei tumori solidi

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Caratterizzare in modo completo il microambiente tumorale è essenziale nella ricerca immuno-oncologica. Questo test è il primo a utilizzare modelli di espressione della salute basati sull'RNA per misurare le cellule immunitarie nel tessuto tumorale solido. Questo test consente ai ricercatori di ottenere misurazioni altamente sensibili e specifiche della contestualità immunitaria nei tessuti tumorali solidi FFB e di combinare questi risultati in un biomarcatore multidimensionale.Tutti i trattamenti contro il cancro, non solo le immunoterapie, suscitano una risposta immunitaria nel sito del tumore solido. Misurare questa risposta immunitaria è importante per comprendere la progressione della malattia e le risposte terapeutiche. Questo protocollo combina le tradizionali tecniche di preparazione della libreria di RNA con l'acquisizione mirata.Sebbene dispendioso in termini di tempo, seguire le fasi di lavaggio e monitorare i checkpoint di controllo qualità come suggerito è molto importante per il successo. Per l'RNA altamente degradato da campioni incorporati di paraffina fissa alla formalina, assemblare la prima reazione di sintesi del filamento sul ghiaccio secondo la tabella. Mescolare accuratamente le reazioni pipettando su e giù più volte prima di girare brevemente i campioni in un microcentrifugo.Al termine della centrifugazione, posizionare immediatamente i campioni in un ciclore termico preriscaldato seguendo il programma numero tre dalla tabella. Per l'RNA intatto di alta qualità, assemblare la prima reazione di sintesi del filamento sul ghiaccio in un tubo PCR privo di nucleasi come delineato nelle tabelle. Per iniziare questa procedura, mescolare 200 nanogrammi della libreria di interesse codificata a barre con due microgrammi di DNA COT-1 e due microlitri di oligo bloccanti in un tubo PCR privo di nucleasi.Quindi utilizzare un concentratore sottovuoto impostato su 30-45 gradi Celsius per asciugare il contenuto del tubo. Dopo l'ibridazione, rimuovere i campioni dal ciclore termico e impostare il ciclore termico in modo da incubare a 65 gradi Celsius con il coperchio riscaldato impostato su 70 gradi Celsius. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 17 microlitri di perline completamente omogeneizzate sui campioni e pipettare accuratamente su e giù 10 volte.Per legare il DNA alle perline, posizionare i tubi nel ciclore termico seguendo il programma 10 rimuovendo brevemente i tubi spogliati ogni 10-12 minuti per tre secondi di vortice delicato per mantenere le perline rimonite. Immediatamente dopo l'incubazione di legame, rimuovere una striscia di tubi dal ciclore termico e aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio preriscaldato uno ai tubi. Pipettare accuratamente su e giù 10 volte e posizionare i tubi su un rack magnetico per consentire alle perline di separarsi completamente dalla soluzione di lavaggio prima di aspirare il DNA non legato contenente supernatante.Rimuovere i tubi dal rack e aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio rigoroso preriscaldato con miscelazione accurata per rimescolare completamente le perline facendo attenzione ad evitare bolle. Riposizionare i tubi nel ciclore termico a 65 gradi Celsius per cinque minuti prima di riposizionare i tubi sul rack magnetico per consentire alle perline di separarsi completamente dai supernatanti. Scartare il DNA non legato contenente supernatanti, lavare ancora una volta le perline con un rigoroso tampone di lavaggio preriscaldato, come appena dimostrato per un totale di due lavaggi rigorosi.Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il supernatante e aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente uno ai tubi. Pipettare il lavaggio da 10 a 20 volte per riprestare completamente le perline e incubare i campioni con il coperchio sigillato per due minuti alternando tra vortice per 30 secondi e riposo per 30 secondi. Alla fine dell'incubazione, centrifugare brevemente e posizionare i tubi sul rack magnetico e rimuovere il supernatante una volta che le perline hanno aderito completamente al magnete.Centrifugare brevemente i tubi con i tappi chiusi e riportare i campioni al rack magnetico. Utilizzare una pipetta da 10 microlitri per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo e aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente due. Pipettare il lavaggio da 10 a 20 volte per riprestare completamente le perline e incubare i campioni con i coperchi sigillati per due minuti alternando il vortice per 30 secondi e riposando per 30 secondi.Dopo una breve centrifugazione, trasferire l'intero volume di perline da ogni tubo in tubi PCR puliti senza nucleasi e posizionare i tubi sul rack magnetico. Dopo aver scartato il DNA non legato contenente supernatanti, centrifugare brevemente i campioni di nuovo e utilizzare una pipetta da 10 microliter per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo dalle perline mentre si trova nel rack magnetico. Aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio tre ai tubi e pipetta su e giù da 10 a 20 volte per rimpioderare completamente le perline.Incubare il tubo per due minuti alternando tra 30 secondi di vortice delicato e 30 secondi di riposo prima di centrifugarsi brevemente. Posizionare i tubi sul rack magnetico per aspirare i supernatanti e centrifugare brevemente nuovamente i campioni di perline. Utilizzare una pipetta da 10 microlitri per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio residuo dalle perline mentre si trovano nel rack magnetico prima di rimuovere i tubi dal rack e rimescolare le perline in 20 microlitri di acqua senza nucleasi per tubo.Quindi pipettare le perline 10 volte per assicurarsi che eventuali perline attaccate al lato dei tubi siano state riprenite. La presenza di dimeri adattatore deve essere valutata per determinare se è necessaria una pulizia aggiuntiva. Ad esempio, questo elettroferogramma mostra un livello accettabile di dimero dell'adattatore che appare come un picco acuto intorno a 128 coppie di basi mentre questo elettroferogramma mostra un livello inaccettabile di dimero dell'adattatore.I profili immunitari pre e post-trattamento possono essere utilizzati per comprendere gli effetti di una terapia specifica sul microambiente tumorale come in questa analisi rappresentativa per la quale vengono mostrati i cambiamenti di percentuale per ogni cellula immunitaria di interesse e il contenuto immunitario totale pre e post-chemioterapia per un singolo paziente. In questa analisi, i campioni tra gruppi di pazienti sono stati confrontati in base al loro tempo alla progressione della malattia dopo il trattamento. Un sottoinsieme dei pazienti ha mostrato la recidiva della malattia dopo 18 mesi, mentre un altro sottoinsieme è progredito più velocemente in 18 o meno mesi.Il valore del delta mediano potrebbe quindi essere confrontato per ciascun campione per identificare i biomarcatori putativi della progressione della malattia. Ad esempio, qui due geni di fuga immunitaria sono stati identificati come diversiatori statisticamente significativi dei raggruppamenti di campioni. Poiché i singoli biomarcatori genetici erano robusti con una chiara significatività statistica, il biomarcatore multidimensionale non aggiungeva un significativo valore predittivo.Assicurarsi di eseguire i lavaggi riscaldati una striscia alla volta per evitare il raffreddamento del campione e ricordarsi di trasferire le perline in tubi freschi per evitare contaminazioni fuori bersaglio. Questo protocollo dimostra l'uso di modelli di espressione genica per quantificare le cellule immunitarie e il tessuto tumorale. Sono in fase di sviluppo nuovi modelli per misurare gli stati delle celle come l'esaurimento o l'attivazione.

Research

JoVE Journal

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