Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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著者らは、TriStarテクノロジーグループが代表的な結果に生物学的標本を提供し、コファクターゲノミクスの分子、分析、製品、商業チーム全体を技術的専門知識のために提供し、かつサポート。

<ol>
	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. 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American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

すべての著者は、この記事で使用される免疫Prism試薬キットおよびインフォマティクスツールを開発し、生産するCofactor Genomics, Inc.に採用されています。免疫プリズムアッセイは研究用のみであり、診断手順で使用するためのものではありません。

このプロトコルには、20 ng の無傷または 40 ng の高度に分解された RNA (FFPE) が必要です。RNAサンプルは、DNA、塩(例えば、Mg2+、またはグアニジン塩)、二価カチオンキレート剤(例えば、EDTA、EGTA、クエン酸塩)、または有機物(例えば、フェノールおよびエタノール)を含まないべきである。DV200 <20%を持つ RNA サンプルを続行することはお勧めしません。これらの制御は、ライブラリの準備から分析まで、プロトコル全体を通してパフォーマンスを評価する手段を提供するので、キット内コントロールRNAの使用が強く推奨されます。
プロトコルは0.2 mL PCRストリップ管を使用して行われるように設計されています。好ましい場合、プロトコルは96ウェルPCRプレートのウェルを用いて行うこともできます。PCRチューブまたはストリップチューブのすべてのリファレンスの代わりに、96ウェルPCRプレートのウェルを使用してください。ビーズの精製や洗浄工程の間にビーズの完全な再懸濁を視覚的に確認することが重要であるため、透明な井戸のみを使用してPCRプレートを使用してください。
プロトコル全体を通して、特に指定がない限り、試薬を凍結または氷上に保管してください。完全に解凍されるまで試薬を使用しないでください。使用前に、すべての試薬を完全に混ぜるようにしてください。
使用後は、すぐに-20°Cに戻るまで、酵素を-20°Cに保ちます。分子グレードのヌクレアーゼフリー水のみを使用します。DEPC 処理水を使用することは推奨されません。ピペットを混ぜるときは、溶液がよく混ざるまで、穏やかに吸引し、全体の体積の少なくとも50%を分配する。ピペットは酵素を含むすべてのマスターミックスを混合します。渦を使用して酵素を混合すると、変性を引き起こし、その性能を損なう可能性があります。ビーズ精製の際には、分子グレードのエタノールから作ったての80%エタノール溶液を使用します。新鮮ではないエタノール溶液を使用すると、収率が低下する可能性があります。これは溶出効率を低下させることができるので、ビーズを過度に乾燥しないでください(過乾燥するとビーズはひび割れたように見えます)。
ステップ10で説明したように、一意のインデックスプライマーが各反応に追加されます。これらのインデックスのシーケンスに基づいて、低レベル多重化のために、特定のインデックスの組み合わせが最適です。これらのインデックスのシーケンスは、データのシーケンス後の変換を解除するために必要です。シーケンスと推奨される多重化の組み合わせは、補足表 3に記載されています。この同じステップでは、推奨されるPCRサイクルの数は、使用されるRNAの品質によって異なり、PCRの過剰増幅を防ぐためにいくつかの最適化が必要な場合があることに注意することが重要です。免疫プリズムインタクトコントロールRNAおよびその他の高品質RNAについては、10 PCRサイクルで最適化を開始します。免疫プリズム FFPE コントロール RNA およびその他の高度に分解/FFPE RNA の場合、15 PCR サイクルで最適化を開始します。PCRサイクルを最適化するために、解析する材料を代表するRNAを用いた試験ライブラリの作成をお勧めします。プリキャプチャー・ライブラリーの収量が一貫して得られる PCR サイクルの最小数 (>200 ng) を使用する必要があります。バイオアナライザのトレースで1000bp前後の二次ピークは、過剰増幅を示しています(図4)。過剰増幅は最小限に抑えるべきであるが、小さい二次ピークの存在はアッセイ結果を妨げない。
サンプル損失を最小限に抑え、チューブのスイッチングを回避するために、真空濃縮器で可能な場合、ステップ13はPCRチューブ、ストリップチューブ、または1.5 mLマイクロチューブの代わりに96ウェルPCRプレートで実行できます。ローターは多くのコンセントレーターで取り外すことができる。これにより、ストリップチューブまたはプレートが真空中に収まります。真空濃縮は、遠心分離無しの水性乾燥を使用して実行することができます。手順については、真空濃縮器のマニュアルを参照してください。サンプルをストリップチューブまたは96ウェルプレートで乾燥させた場合、ハイブリダイゼーション工程は同じ容器内で行うことができる。
ステップ17の間、ビード捕獲効率を高めるために10-12分ごとにボルテックスするようにしてください。チューブが開くのを防ぐために混合するときは、慎重に暖かいストリップチューブのキャップを保持します。
ステップ18で説明したワッシュは、高い非特異的汚染を避けるために重要であり、密接に従わなければなりません。洗浄のたびにビーズを完全に再懸濁し、洗浄バッファを完全に取り除き、洗浄バッファ2洗浄中にサンプルを新鮮なストリップチューブに移します(ステップ18.6.5)。ストレプトアビジンビーズが完全に再懸濁され、全体のインキュベーション中にサスペンションに残っていることを確認してください。チューブキャップに飛び散ってキャプチャに悪影響を与えるわけではありません。室温の洗い上がりの間、マイクロプレート渦ミキサーは、より容易な再懸濁のために2分間のインキュベーション期間全体のサンプルをボルテックスするために使用され得る。ストレプトアビジンビーズを乾燥させないでください。必要に応じて、ビーズの乾燥を避けるためにバッファー内のインキュベーションを拡張します。複数のストリップチューブを使用する場合は、一度に1つのストリップチューブを使用して、他のストリップチューブがサーモサイクラーに座っている間、各洗浄のために一度に作業します。これは、ビーズの乾燥や急いで過ぎないようにし、再懸濁液の不良や他の最適でない技術を生じさせるのに役立ちます。初めてのユーザーの場合は、一度に 8 つ以上のライブラリの反応を処理することはお勧めしません。
現在の免疫プロファイリング技術は、重要な解釈(RNAシーケンシング)を必要とする何千ものデータポイントから個々の離散データポイント(単一プレックスIHC)まで、連続した情報を提供します。ここで説明するプロトコルは、高感度を可能にする焦点を当てたスコープを持つ真ん中のどこかにあるアプローチを表しますが、臨床的に関連する転写データのサブセットのみをキャプチャします。バルクRNA抽出の性質上、このプロトコルは免疫細胞と腫瘍微小環境との間の空間的関係に関する情報を提供しないが、結果はこの情報を追加するイメージング技術と補完され得る。このプロトコルによって生成されたデータには、がんの生物学を病気として学び、治療を行うための治療法について学ぶ必要があります。代表的な結果に示すように、個々の免疫報告は、患者の免疫プロファイルが疾患の進行または治療などの事象に応答してどのように変化するかを理解するのに有用である。ここで示した結果はいくつかのユースケースを提供しますが、治療の作用機序を調査し、進行フリーおよび全体的な生存などの臨床結果の推定バイオマーカーを特定するなど、他のアプリケーションも同様です実用的。バイオマーカー発見用途にこのプロトコルを使用する場合、均質な集団が分析され、統計的な力のために十分なサンプルが含まれ、偏りの源が考慮されるように、良い研究設計を実践することが重要です。アッセイの焦点を絞った合理化された性質のために、一度発見されたこれらのバイオマーカーの臨床検証および下流適用への道を想像することは可能である。

ホルマリン固定およびパラフィン埋込み(FFPE)のヒト組織サンプルにおける腫瘍浸潤リンパ球(TILs)および他の免疫関連分子の定量化は、臨床研究1、2、3において示された値を示している。フローサイトメトリーや単細胞リボ核酸(RNA)シーケンシングなどの一般的な技術は、新鮮な組織および血液4に有用であるが、生存可能な細胞懸濁液を作ることができないため、FFPE材料の分析には適さない。FFPE組織においてこれらの細胞を定量化するために使用されている現在の方法は、大きな課題に苦しんでいます。免疫組織化学(IHC)および他の同様のイメージングワークフローは、細胞表面タンパク質を検出するための特異的抗体を必要とし、再現性定量を可能にするために実験室間で標準化することは困難である可能性があります 5。nCounterシステムのようなプラットホームは、検出の感度および特異性を制限する主要な免疫細胞6を定義するために単一の遺伝子の発現に依存する。スタンドアロンのソフトウェアツールと組み合わせたより一般的なRNAシーケンシング方法は、利用可能ですが、7、8、9、10、11、12を使用する前に、大幅な最適化と検証が必要です。レーザー捕捉マイクロ解剖(LCM)とFFPE組織のRNAシーケンシングを組み合わせた最近の進歩は、約束を示しています。しかし、より高いスループット、ターンキーソリューションは、堅牢なバイオマーカー13、14を同定することを目的としたトランスレーショナル研究に必要とされる。多次元バイオマーカーを生成する方法は、予測免疫モデリング、治療応答者、癌サブタイプ、または高い予測精度および統計的有意性を有する生存結果を含む患者コホートを定義する15、16の精密医療の時代においてますます重要になってきている。
このニーズに対応するために、標準化されたRNAシーケンシング試薬および雲ベースのインフォマティクスを使用して、固形腫瘍FFPE組織における免疫細胞の感受性および特異的定量を可能にする免疫プロファイリングアッセイが開発されました。FFPE組織から分解されたRNAを収容することに加えて、プロトコルは、コア針生検、針吸引、およびミクロまたはマクロ解剖組織などの制限組織サンプルから得られるRNAを収容することができる。各サンプルからのRNAデータは、免疫細胞の遺伝子発現モデルのデータベースと比較され、免疫健康発現モデルと呼ばれ、免疫細胞をサンプル中に存在する全細胞の割合として定量する。簡単に言えば、これらのモデルは、機械学習法を用いて構築され、精製免疫細胞集団(正規細胞表面マーカーを用いて単離された)から生成された全トランスクリプトームデータからユニークな多原性発現パターンを同定した(正規細胞表面マーカーを用いて分離された)17,18。この技術の基礎となる多次元健康発現モデルにより、アッセイは異種混合物中に存在する全細胞のパーセントとして各免疫細胞を定量化することができます。これにより、研究者は、臨床値19、20を有することが示されているインターおよびイントラサンプル免疫細胞比較を生成することができます。その他の用途としては、代表的な結果に記載されているように、治療前および後の免疫応答の定量が挙げられる。アッセイは、8種類の免疫細胞型(遺伝子発現モデル由来)の絶対割合を含む腫瘍および腫瘍微小環境の免疫コンテクスチャの複数の特徴について報告する:CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD56+ナチュラルキラー細胞、CD19+B細胞、CD14+単球、Tregs、M1マクロファージ、およびM2マクロファージ。 さらに、アッセイは、10個の免疫脱出遺伝子(PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、TIM-3、BTLA、ICOS、CD47、IDO1、およびARG1)の発現(100万回当たりのトランスクリプト、またはTPM)を報告する。
この試薬キットは、図 1に示すように、ハイブリッド キャプチャ ベースのライブラリ準備方法に従って、高品質のライブラリを、イユミナ プラットフォームでシーケンス処理の準備を整えるために使用します。研究者が実験室にIlluminaシーケンシングプラットフォームを持っていない場合、彼らはシーケンシングのためにコアラボにサンプルを提出することができます。生成されると、シーケンスデータは、自動化された分析のためにPrism Portalにアップロードされ、個々のサンプルに対する包括的で定量的なプロファイルを、免疫レポート(図2A)の形でユーザに返されます。ユーザーは、プリズムポータルでサンプルグループを定義してバイオマーカーレポート(図2B)を生成し、2つの患者コホートを区別する統計的に有意なバイオマーカーを強調することもできる。重要なことに、試薬キットによって生成されたデータは研究用のみであり、診断目的で使用することはできません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> 図1:ワークフローの概要このプロトコルでは、RNAはまずcDNAに変換される。シーケンシングアダプタは、リゲーションされ、アダプター-リゲーテッドcDNAを増幅し、PCRによってバーコード化してプリキャプチャライブラリを作成します。ビオチン化プローブは、特定のcDNA標的にハイブリダイズされ、ストレプトアビジンビーズを使用して捕捉されます。非結合、非標的cDNAは洗浄によって除去される。最終的な PCR エンリッチメントにより、キャプチャ後のライブラリをシーケンス処理の準備ができます。*総RNAはヒトサンプルからのものでなければなりません。無傷または分解(FFPE)RNAである可能性があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> 図2:代表免疫報告ワークフローは、処理された各サンプルに対する個別の免疫レポート(A)と、定義された患者コホートのバイオマーカーレポート(B)の2つのレポートを生成します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このプロトコルは、約16時間の準備時間(全RNAからシーケンシングの準備ができたライブラリまで)を必要とします。ただし、プロトコルに記載されているように、いくつかのオプションの停止点があります。このアッセイは、トランスクリプトミクスの豊かでダイナミックな性質を利用して、従来の単一分析体バイオマーカーを超えて多次元遺伝子発現モデルに移行し、標準化された組織サンプルの包括的な生物学的特徴付けを可能にします。試薬および使いやすいソフトウェア用具。機械学習と健康発現モデルのデータベースを活用して、貴重な臨床サンプルのより正確で定量的な免疫プロファイルを導き出し、発見することで、研究者は自分の研究室で現代的な技術を活用することができます。完全な統計解析を用いて多次元RNAバイオマーカー。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

免疫療法は腫瘍学患者の治療において約束を示すが、腫瘍微小環境の複雑な不均一性は治療応答の予測を困難にする。腫瘍組織とその周辺に存在する免疫細胞の相対的集団を解決する能力は、臨床的に理解応答に関連することが示されているが、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学などの伝統的な技術によって制限されている(IHC)は、必要な組織の大量性、正確な細胞型マーカーの欠如、および多くの技術的および物流上のハードルのために。1つのアッセイ(例えば、免疫プリズムプロファイリングアッセイ)は、少量のRNAと高度に分解されたRNAの両方に対応することによってこれらの課題を克服し、臨床的にアーカイブされた固形腫瘍組織から抽出されたRNAの共通の特徴である。このアッセイは、試薬キットとクラウドベースのインフォマティクスを介してアクセスされ、Illuminaシーケンシングプラットフォーム向けのエンドツーエンドの定量的、ハイスループットな免疫プロファイリングソリューションを提供します。研究者は、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の2つのセクションまたは(サンプルの品質に応じて)総RNAの20〜40ngから始まり、プロトコルは8つの免疫細胞タイプと10の免疫脱出を定量化する免疫プロファイルレポートを生成します遺伝子は、腫瘍微小環境の完全なビューを捕捉する。得られたデータを利用するために追加のバイオインフォマティクス分析は必要ありません。適切なサンプルコホートを使用すると、プロトコルはまた、関心のある患者集団内の統計的に有意なバイオマーカーを識別するために使用され得る。

プロトコル全体を通して、生成された材料の品質と量を評価するためのチェックポイントが多数あります。プロトコルに記載されたステップ12に続いて、図3に示すように、インタクトRNAサンプルの典型的なプリキャプチャーライブラリの代表であるエレクトロフェログラムが生成される(RIN = 7.8)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> 図 3: インタクト RNA サンプルの典型的なプリキャプチャー ライブラリ バイオアナライザー トレースプリキャプチャー・ライブラリは、250~400塩基対(bp)の大きさの大きなピークとして表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図4に示す1,000bp前後の第2のピークで示されるように、過剰増幅を避けるために注意を払う必要があり、FFPE RNAサンプルから生成されたプリキャプチャーライブラリの代表的なエレクトロフェログラム(DV200= 46)。.このピークがメインピークに対して小さい場合(図に示すように、約 250 -400 塩基対 (bp) )、下流のステップまたは解析に干渉しません。2 番目のピークが 250-400 bp ピークに対して大きい場合、過剰増幅を減らすために、プリキャプチャー・ライブラリーを PCR サイクルを少なくしてリメイクできます。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> 図4:FFPE RNAサンプルの典型的なプリキャプチャーライブラリバイオアナライザートレース2番目のピークは約1,000 bpで、過剰増幅を示しています。このピークが250〜400bp前後の主ピークに対して小さい場合、下流の工程や解析に干渉しません。2 番目のピークが 250-400 bp ピークに対して大きい場合、過剰増幅を減らすために、プリキャプチャー・ライブラリーを PCR サイクルを少なくしてリメイクできます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ステップ 12.1.3 で説明したように、追加のクリーンアップが必要かどうかを判断するために、アダプター・ダイマーの存在を評価する必要があります。図5に示す電気泳動グラムは、受け入れられない(図5A、DV200=33)および許容可能な(図5B、DV200=46)レベルのアダプターダイマーを表すものであり、128bp前後のシャープピークとして現れる。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> 図5:プリキャプチャライブラリバイオアナライザのトレース。アダプタダイマーは128bpの周りのシャープなピークとして現れる。(B) 受容可能なアダプター・ダイマー・レベルは、このトレースに示されています。両方の痕跡は軽度の過剰増幅の証拠を示すが、これは免疫Prismアッセイを妨げるべきではない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
プロトコルの完了時に、シーケンシングの前に、最終的なライブラリは再びデジタル電気泳動を使用して評価されます。FFPE RNA から作られたライブラリは、無傷の RNA から作られたライブラリよりも平均サイズ分布が小さい傾向があります。インタクト RNA サンプルの場合、結果のトレースは図 6 (RIN = 9.5) のようになります。分解またはFFPE RNAの場合、得られるトレースは図7(DV 200 = 36)のようになります。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> 図 6: インタクト RNA サンプルの典型的な最終ライブラリ バイオアナライザー トレース最終的なライブラリは、サイズが250-400ベースペア(bp)の周りに広いピークとして表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> 図 7: FFPE RNA サンプルの典型的な最終ライブラリ バイオアナライザー トレースFFPE RNA から作られたライブラリは、無傷の RNA から作られたライブラリよりも平均サイズ分布が小さい傾向があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
説明したように、このプロトコルで生成された結果は、図 8に示すように、2 つの主要な方法で適用できます。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> 図 8: プロトコルの 2 つのユース ケースこの免疫プロファイリングアッセイによって生成された結果は、2つの主要な翻訳アプリケーションで適用されます。(A)最初の使用例は、ヒト固形腫瘍組織(FFPEアーカイブを含む)から始まり、サンプルに対して個々の免疫プロファイルを生成する。(B) ヒトサンプルのコホートに対して生成されたデータは、プリズムポータルを使用して多次元バイオマーカーとそれに対応するバイオマーカーレポートを生成する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
これらの各使用例を示すために、小さな翻訳研究の代表データが21.この研究で使用されるサンプルは、非小細胞肺癌(NSCLC)について診断され治療された7人の患者からの検体のセットである。サンプルは、前処置および後治療生検からの患者一致した固形腫瘍組織である。まず、個々のサンプルを分析して、図9に示す例のような免疫プロファイルを生成する。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> 図 9: NSCLC サンプルに対する個々の免疫レポートの例Prism Portal パイプラインは、処理された各サンプルのグラフィカル レポートを生成し、ここに示す NSCLC 固形腫瘍サンプルに対して生成された代表的なレポートを示します。(A) FFPE組織から抽出したRNAサンプル中に存在する免疫細胞の内訳を図表して表したレポートの正面。(B) 本報告の裏側には、免疫細胞の表(絶対パーセント)およびエスケープ遺伝子発現(100万分の100の転写産物における、またはTPM)、ならびにアッセイの性能の記述が含まれる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
治療前および治療後の免疫プロファイルは、治療(化学療法または放射線、この研究では)が腫瘍微小環境をどのように改変したかを理解するために使用することができる。図10に例を示し、各免疫細胞および総免疫内容のパーセンテージの変化が、単一の患者に対して化学療法前後に示される。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> 図10:前処置および後処理結果の例単一のNSCLC患者から治療前および後のサンプルから生成された個々の免疫細胞および総免疫内容データが示される。この例では、患者は治療として化学療法レジメンを受けた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
患者は、比較のために臨床転帰または表現型などの基準によってグループ化され得る。例えば、図11において、NSCLC試験におけるサンプルは、治療後の疾患進行までの時間に従って比較した。患者のサブセットは、18ヶ月で疾患再発を示し、別のサブセットは≤18ヶ月で、より速く進行した。中央値のデルタ値(前処置値と後処置値の差)を各サンプルについて比較し、疾患進行の推定バイオマーカーを同定する。
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> 図 11: 臨床結果比較の例一致した前処置および治療後のNSCLCサンプルにおける免疫細胞の割合の間の定量的変化を「デルタ」値として計算および報告した。黄色で強調表示されているものは、生存状態間の明確な信号の変化を示しています。青いバーは、病気が進行するまでの18ヶ月間の>18ヶ月のデルタ値の中央値を表し、オレンジ色の棒は病気が進行するまでの18ヶ月間のデルタ値の中央値を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
最後に、同様のサンプルグループを使用して、プリトリートメントサンプルを特異的に調し、プリズムポータルを使用してバイオマーカーレポートを生成することによって予測バイオマーカーを同定することができます。図12に示す、上述の臨床表現型(疾患進行)と同じものが、サンプルグループを定義する。この例では、2つの免疫脱出遺伝子が、サンプルグループの統計的に有意な分化因子として同定された(CD47およびOX40、図12Aの下パネルに示す)。この例では、個々の遺伝子バイオマーカーが明確な統計的有意性を有する堅牢であるため、多次元バイオマーカーは有意な予測値を加えない(ImmunoPrism、図12Bの右上の棒グラフに標識されている)。アッセイの18個の分析結果すべてを含むデータの完全なテーブルは、統計分析と簡単な方法の要約を含むレポートの裏側に要約されています。
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> 図 12: NSCLC サンプルのバイオマーカー レポートの例バイオマーカーディスカバリーパイプラインは、個々のバイオマーカーの視覚的なレポートと機械学習多次元バイオマーカーを詳細な統計で提供します。(A)この研究では、パイプラインは、18ヶ月の閾値を有する疾患進行を定義するための統計的に有意な2つの個別バイオマーカー(CD47およびOX40)を同定した。(B) レポートの裏側に、メソッドと完全な結果の詳細が含まれています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:試薬キット材料ImmunoPrismキットに用意されている材料のリストと、メーカーのプロトコルで参照されている部品番号が記載されています。その他必要な機器および材料はすべて、材料表に記載されています。安全データシート(SDS)<a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">のhttps://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a>を参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
補足表 2: サーマルサイクラー プログラムプロトコル全体で参照される推奨サイクラー プログラムは、プログラミングを容易にするためにまとめられています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
補足表 3: 索引の順序付けガイド試薬キットに用意されているインデックスプライマーがリストされています。シーケンス後の非多重化の各反応に、固有のプライマーが追加されます。推奨される低レベル多重化の組み合わせも提供されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

RNAベースのアプローチを使用して、固形腫瘍組織の定量的免疫プロファイルを決定し、免疫腫瘍学バイオマーカー探索のための臨床コホートを活用することは、分子および情報学的プロトコルを介して記述されています。

固形腫瘍の予知免疫モデリング

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

腫瘍微小環境を総合的に特徴付けるのが免疫腫瘍学研究に不可欠です。このアッセイは、固形腫瘍組織の免疫細胞を測定するためにRNAベースの健康発現モデルを使用する最初のものである。このアッセイにより、FFB固形腫瘍組織における免疫コンテクスチャの高感度かつ特異的な測定を行い、これらの結果を多次元バイオマーカーに組み合わせることができます。免疫療法だけでなく、すべてのがん治療は、固形腫瘍の部位で免疫応答を引き出します。この免疫応答を測定することは、疾患の進行と治療応答を理解するために重要です。このプロトコルは、従来のRNAライブラリ調製技術と標的捕捉を組み合わせたものです。時間はかかりますが、洗浄手順に従い、提案された品質管理チェックポイントを監視することは、成功のために非常に重要です。ホルマリン固定パラフィン埋め込みサンプルから高度に分解されたRNAの場合、表に従って氷上で最初のストランド合成反応を組み立てます。マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間回転させる前に、数回上下にピペット処理して反応を徹底的に混合します。遠心分離の終わりに、すぐにテーブルからプログラム番号3に続いて予熱サーマルサイクラーにサンプルを入れます。高品質の無傷のRNAを得る場合は、表に示すように、ヌクレアーゼを含まないPCRチューブで氷上で初めてストランド合成反応を組み立てます。この手順を開始するには、目的のバーコードライブラリの200ナノグラムを、COT-1 DNAの2マイクログラムとヌクレアーゼフリーPCRチューブ内の2マイクロリットルのブロッキングオリゴと混合します。その後、真空濃縮器を30~45°Cに設定して、チューブの内容物を乾燥させます。ハイブリダイゼーションの後、サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、加熱された蓋を摂氏70度に設定して摂氏65度でインキュベートするようにサーマルサイクラーを設定します。マルチチャンネルピペットを使用して、17マイクロリットルの完全に均質化されたビーズをサンプルに転送し、ピペットを10回徹底的に上下に移動させます。DNAをビーズに結合するには、プログラム10に続いてチューブをサーマルサイクラーに入れ、10〜12分ごとに剥がされたチューブを3秒間穏やかな渦を取り除き、ビーズを再懸濁させたままにします。結合インキュベーションの直後に、サーマルサイクラーからチューブのストリップを1つ取り除き、100マイクロリットルの予熱洗浄バッファーをチューブに加えます。ピペットは10回徹底的に上下し、上清を含む非結合DNAを吸引する前にビーズが洗浄液から完全に分離できるように、磁気ラックにチューブを置きます。ラックからチューブを取り外し、十分に混合して150マイクロリットルの予熱されたストリージェント洗浄バッファーを加え、気泡を避けるために注意してビーズを完全に再中断します。チューブを摂氏65度で5分間サーマルサイクラーに戻してから、チューブを磁気ラックに戻して、ビーズを上清から完全に分離できるようにします。上清を含む非結合DNAを捨て、合計2回のストリンウォッシュで実証したように、ビーズを予熱されたストリンジェント洗浄バッファーでもう一度洗います。最後の洗浄後、上清を取り除き、150マイクロリットルの室温洗浄バッファーをチューブに加えます。洗浄を10〜20回ピペットし、ビーズを完全に再懸濁し、蓋を密閉して2分間、渦を30秒間交互に、30秒間休ませる状態でサンプルをインキュベートする。インキュベーションの終わりには、遠心分離機を短くし、マグネットラックにチューブを置き、ビーズが完全に磁石に付着したら上清を取り外します。キャップを閉じた状態でチューブを遠心分離し、サンプルを磁気ラックに戻します。10マイクロリットルのピペットを使用して、残留洗浄バッファーを取り除き、150マイクロリットルの室温洗浄バッファーを2個追加します。ピペット洗浄を10〜20回洗浄し、ビーズを完全に再懸濁し、蓋を2分間密閉して30秒間ボルテックスを交互に、30秒間休む状態でサンプルをインキュベートする。短い遠心分離の後、各チューブからビードの全容をクリーンヌクレアーゼフリーPCRチューブに移し、チューブを磁気ラックに置きます。上清を含むバインドされていないDNAを捨て、サンプルを再び一時的に遠心分離し、10マイクロリットルのピペットを使用して、磁気ラックにいる間にビーズから残留洗浄バッファーを取り除きます。150マイクロリットルの洗浄バッファーをチューブに3マイクロリットル加え、ピペットを10~20回上下に加え、ビーズを完全に再懸濁します。穏やかな渦の30秒と30秒の休息の間で交互に2分間チューブをインキュベートしてから、一時的に遠心分離します。チューブを磁気ラックに置いて上清を吸引し、ビーズサンプルを再び短く遠心分離します。10マイクロリットルのピペットを使用して、磁気ラックに入っている間に残りの洗浄バッファーを取り除き、ラックからチューブを取り外し、チューブあたり20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でビーズを再懸濁します。その後、ビーズを10回ピペットし、チューブの側面に貼り付けたビーズが再懸濁されていることを確認します。アダプターダイマーの存在を評価して、追加のクリーンアップが必要かどうかを判断する必要があります。例えば、このエレクトロフェログラムは、アダプタダイマーの許容レベルを示し、128塩基対の周りに鋭いピークとして現れ、このエレクトロフェログラムはアダプタダイマーの許容できないレベルを示しています。免疫プロファイルの前および後の処置は、関心のある各免疫細胞の割合の変化および全免疫含有量が単一の患者に対する化学療法前および後に示されるこの代表的な分析と同様に、腫瘍微小環境に対する特定の治療の影響を理解するために使用され得る。この分析では、患者群間のサンプルを、治療後の疾患進行までの時間に従って比較した。患者のサブセットは18ヶ月後に疾患再発を示し、別のサブセットは18ヶ月以下でより速く進行した。その後、中央値のデルタ値を各サンプルについて比較して、疾患進行の推定バイオマーカーを同定することができます。例えば、ここで2つの免疫エスケープ遺伝子が、サンプル群の統計的に有意な区別因子として同定された。個々の遺伝子バイオマーカーは明確な統計的有意性を有する堅牢であったため、多次元バイオマーカーは有意な予測値を追加しなかった。サンプル冷却を防ぐために一度に1つのストリップに加熱された流しを実行し、オフターゲット汚染を避けるために新鮮なチューブにビーズを転送することを忘れないでください。このプロトコルは、免疫細胞および腫瘍組織を定量化するための遺伝子発現モデルの使用を実証する。疲労や活性化などの細胞状態を測定する新しいモデルが開発されています。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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