Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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저자는 대표적인 결과에 대한 생물학적 표본뿐만 아니라 자신의 기술 전문 지식에 대한 Cofactor 유전체학에서 전체 분자, 분석, 제품 및 상업 팀을 제공하는 TriStar 기술 그룹을 인정하고자 지원.

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	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. 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Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

모든 저자는 Cofactor 유전체학, Inc., 이 문서에 사용된 ImmunoPrism 시약 키트 및 정보학 공구를 개발하고 생성하는 회사에 의해 고용됩니다. 면역 프리즘 분석 은 연구 용 전용이며 진단 절차에 사용하지 않습니다.

프로토콜은 20 ng 손상되지 않았거나 40 ng고 저하된(FFPE) RNA를 필요로 한다. RNA 샘플에는 DNA, 염(예를 들어, Mg2+또는 구니디늄 염), 분량 양이온 킬레이트화제(예를 들어, EDTA, EGTA, 구연산염), 또는 유기물(예를 들어, 페놀 및 에탄올)이 없어야 한다. DV200 <20%가 있는 RNA 샘플을 진행하는 것은 권장되지 않습니다. 이러한 제어는 라이브러리 준비에서 분석에 이르기까지 전체 프로토콜 전반에 걸쳐 성능을 평가하는 수단을 제공하기 때문에 키트 내 제어 RNA를 사용하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 0.2 mL PCR 스트립 튜브를 사용하여 수행되도록 설계되었습니다. 바람직한 경우, 프로토콜은 또한 96 웰 PCR 플레이트에서 웰을 사용하여 수행될 수 있다. PCR 튜브 또는 스트립 튜브에 대한 모든 참조 대신 96웰 PCR 플레이트의 웰을 사용하기만 하면 됩니다. 구슬 정화 및 세척 단계에서 구슬의 완전한 재서스펜션을 시각적으로 확인하는 것이 중요하므로 명확한 우물만 있는 PCR 플레이트를 사용하십시오.
프로토콜 전체에 달리 명시되지 않는 한 시약을 냉동 또는 얼음 위에 보관하십시오. 완전히 해동될 때까지 시약을 사용하지 마십시오. 사용하기 전에 모든 시약을 철저히 혼합하십시오.
사용 준비가 될 때까지 효소를 -20°C에서 유지하고 사용 후 즉시 -20°C로 되돌리십시오. 분자 등급의 뉴클레아제없는 물만 사용하십시오. DEPC 처리된 물을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 파이펫팅을 할 때는 용액이 잘 섞일 때까지 총 부피의 50% 이상을 부드럽게 흡입하고 분배합니다. 파이펫은 효소를 함유한 모든 마스터 믹스를 혼합합니다. 소용돌이를 사용하여 효소를 혼합하면 변성으로 이어질 수 있으며 성능을 손상시킬 수 있습니다. 비드 정제 중에 분자 등급 에탄올에서 갓 만든 80% 에탄올 용액을 사용하십시오. 신선하지 않은 에탄올 용액을 사용하면 수율이 낮아질 수 있습니다. 용출 효율을 감소시킬 수 있기 때문에 구슬을 과도하게 건조시키지 마십시오 (비드는 과도하게 건조되면 금이 간 것처럼 보입니다).
단계 10에 기재된 바와 같이, 고유 인덱스 프라이머는 각 반응에 첨가된다. 이러한 인덱스의 순서에 따라, 낮은 수준의 멀티플렉싱을 위해, 특정 인덱스 조합은 최적입니다. 이러한 인덱스의 시퀀스는 시퀀싱 후 데이터를 다중화하는 데 필요합니다. 서열 및 권장 멀티플렉싱 조합은 보충 표 3에제공된다. 이 와 같은 단계에서, 권장된 PCR 사이클의 수는 사용되는 RNA의 품질에 따라 달라지며, PCR 과다 증폭을 방지하기 위해 일부 최적화가 필요할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 면역프리즘 손상되지 않은 제어 RNA 및 기타 고품질 RNA의 경우 10개의 PCR 주기로 최적화를 시작합니다. 면역프리즘 FFPE 대조군 RNA 및 기타 고분해/FFPE RNA의 경우, 15번의 PCR 주기로 최적화를 시작합니다. PCR 주기를 최적화하기 위해 분석할 물질의 RNA 대표를 사용하여 테스트 라이브러리를 제작하는 것이 좋습니다. 충분한 사전 캡처 라이브러리 수율(>200 ng)을 일관되게 생성하는 최소 PCR 사이클수를 사용해야 합니다. 바이오분석기 트레이스에서 약 1000 bp의 이차 피크는 과다 증폭을나타낸다(그림 4). 과다 증폭을 최소화해야 하지만, 작은 이차 피크의 존재는 분석 결과를 방해하지 않을 것이다.
시료 손실을 최소화하고 튜브 전환을 피하기 위해 진공 농축기가 허용하는 경우 13단계는 1.5mL 마이크로튜브 대신 PCR 튜브, 스트립 튜브 또는 96웰 PCR 플레이트에서 수행될 수 있습니다. 로터는 많은 농축기에서 제거 할 수 있습니다. 이를 통해 스트립 튜브 또는 플레이트가 진공 상태에 들어갈 수 있습니다. 그런 다음 원심분리 없이 수성 건조 설정을 사용하여 진공 농도를 실행할 수 있습니다. 진공 농축기의 지침은 설명서를 참조하십시오. 시료가 스트립 튜브 또는 96웰 플레이트에서 건조되는 경우, 혼성화 단계는 동일한 용기에서 수행될 수 있다.
17단계에서는 10-12분마다 소용돌이를 피하여 비드 포획 효율을 높여야 합니다. 튜브가 열리지 않도록 혼합 할 때 따뜻한 스트립 튜브의 뚜껑을 조심스럽게 잡으십시오.
Step 18에 설명된 세안은 높은 비특이적 오염을 피하기 위해 매우 중요하며 밀접하게 따라야 합니다. 각 세척시 구슬을 완전히 다시 중단하고 세척 버퍼 2 세척 중에 샘플을 신선한 스트립 튜브로 옮기십시오 (18.6.5 단계). 스트렙타비딘 비드가 완전히 다시 중단되고 전체 인큐베이션 동안 현탁액에 남아 있는지 확인하십시오. 튜브 캡에 튀는 것은 캡처에 부정적인 영향을 미치지 않습니다. 실온 세척 동안, 마이크로플레이트 와류 믹서가 쉽게 재서스펜션을 위해 2분 배양 기간 전체에 대한 샘플을 소용돌이에 사용할 수 있다. 스트렙타비딘 구슬이 마르지 않도록 하십시오. 필요한 경우, 구슬을 건조하지 않도록 버퍼에서 인큐베이션을 확장합니다. 하나 이상의 스트립 튜브를 사용하는 경우, 다른 스트립 튜브가 열사이클러에 앉아있는 동안 각 세척에 대해 한 번에 하나의 스트립 튜브로 작동합니다. 이렇게 하면 구슬을 과도하게 건조하거나 돌진하지 않아 재서스펜션이 불량하거나 다른 최적이 아닌 기술이 생성되지 않도록 할 수 있습니다. 처음 사용자의 경우 한 번에 8개 이상의 라이브러리 반응을 처리하지 않는 것이 좋습니다.
현재 의 면역 프로파일링 기술은 중요한 해석(RNA 시퀀싱)이 필요한 수천 개의 데이터 포인트에서 개별 데이터 포인트(단일 플렉스 IHC)에 이르기까지 정보의 연속체를 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 중도에 있는 접근 방식을 나타내며, 집중된 범위는 높은 감도를 가능하게 하지만 임상적으로 관련된 전사데이터의 하위 집합만 캡처합니다. 대량 RNA 추출의 특성으로 인해,이 프로토콜은 면역 세포와 종양 미세 환경 사이의 공간 적 관계에 대한 정보를 제공하지 않지만, 결과는이 정보를 추가하는 이미징 기술로 보완 될 수있다. 이 프로토콜에 의해 생성 된 데이터에 대 한 응용 프로그램의 무수 한있다, 질병으로 암의 생물학에 대해 배울 수 많은, 그리고 그것을 치료 하기 위해 개발 되 고 치료. 대표적인 결과에 나타난 바와 같이, 개별 면역 보고는 환자의 면역 프로필이 질병 진행 또는 치료와 같은 사건에 반응하여 어떻게 변화할 수 있는지 이해하는 데 유용하다. 여기에 제시된 결과는 몇몇 예의 사용 사례를 제공하는 동안, 치료의 작용의 기계장치를 조사하고 진행 자유로운 전반적인 생존과 같은 임상 결과의 putative biomarkers를 확인하는 것을 포함하여 그밖 응용은 또한 입니다 실용적인. 바이오마커 발견 응용을 위해 이 프로토콜을 사용하는 경우, 동종 인구를 분석하고, 통계적 힘을 위해 충분한 샘플을 포함하고, 바이어스의 근원을 고려하기 위해 좋은 연구 설계를 연습하는 것이 중요합니다. 분석법의 집중적이고 능률적인 특성으로 인해, 일단 발견된 이러한 바이오마커의 임상 검증 및 다운스트림 적용을 향한 경로를 상상하는 것이 가능합니다.

종양-침윤 림프구(TILs) 및 포르말린-고정 및 파라핀 임베디드(FFPE) 고형 종양 인간 조직 샘플에서 다른 면역 관련 분자의 정량화는 임상 연구1,2,3에서가치를 입증하였다. 유세포 분석 및 단세포 리보핵산(RNA) 시퀀싱과 같은 일반적인 기술은 신선한 조직 및 혈액4에유용하지만, 생존 가능한 세포 현탁액을 생성할 수 없기 때문에 FFPE 물질의 분석에 적합하지 않습니다. FFPE 조직에서 이러한 세포를 정량화하는 데 사용 된 현재의 방법은 주요 도전으로 고통. 면역항암화학(IHC) 및 기타 유사한 이미징 워크플로우에는 세포 표면 단백질을 검출하기 위한 특정 항체가 필요하며, 이는 재현 가능한 정량화를 가능하게 하기 위해 실험실 전체에서 표준화하기 어려울 수 있습니다5. nCounter 시스템과 같은 플랫폼은 단일 유전자의 발현에 의존하여 주요 면역 세포6을정의하여 검출의 민감성과 특이성을 제한합니다. 독립 형 소프트웨어 도구와 결합 된 보다 일반적인 RNA 시퀀싱 방법은 사용할 수있지만7,8,9,10,11,12를사용하기 전에 상당한 최적화 및 유효성 검사가 필요합니다. FFPE 조직을 위한 RNA 시퀀싱과 레이저 포획 미세 해부 (LCM)를 결합하는 최근 발전은 약속을 보여주었습니다; 그러나, 더 높은 처리량, 턴키 솔루션은 강력한 바이오 마커를 식별하기위한 번역 연구에 필요합니다13,14. 예측 면역 모델링과 같은 다차원 바이오마커를 생성하는 방법은, 치료 응답자, 암 아류형, 또는 높은 예측 정확도 및 통계적 유의성을 갖는 생존 결과를 포함하는 환자 집단을 정의하는 정밀 의학 및 면역 요법의 시대에 점점 더 중요해지고 있다15,16.
이러한 필요성을 해결하기 위해 표준화된 RNA 시퀀싱 시약 및 클라우드 기반 정보학을 사용하여 고형 종양 FFPE 조직에서 면역 세포의 민감하고 구체적인 정량화를 가능하게 하는 면역 프로파일링 분석이 개발되었습니다. FFPE 조직에서 분해 된 RNA를 수용하는 것 외에도, 프로토콜은 코어 바늘 생검, 바늘 흡인, 및 마이크로 또는 매크로 해부 조직과 같은 조직 샘플을 제한에서 파생 된 RNA를 수용 할 수 있습니다. 각 견본에서 RNA 데이터는 면역 성이 있는 건강 발현 모형에게 불린 면역 세포의 유전자 발현 모형의 데이타베이스와 비교되고, 견본에 존재하는 총 세포의 백분율로 면역 세포를 정량화하기 위하여. 간략하게, 이들 모델은 정제된 면역 세포 집단(정식 세포 표면 마커를 사용하여 격리)으로부터 생성된 전체 전사체 데이터로부터 고유한 다원성 발현 패턴을 식별하기 위해 기계 학습 방법을 사용하여 구축되었다17,18. 이 기술의 근간이 되는 다차원 건강 발현 모델은 이종 혼합물에 존재하는 총 세포의 백분율로 각 면역 세포를 정량화하는 분석을 가능하게 합니다. 이것은 연구원이 임상 가치19,20가있기 위하여 보인 상호 샘플 면역 세포 비교를 생성하는 가능하게 합니다. 다른 응용은 대표적인 결과에 기재된 바와 같이 면역 반응 전과 후의 정량화를 포함한다. 분석 보고서는 8개의 면역 세포 유형(유전자 발현 모델에서 파생됨)의 절대 백분율을 포함하여 종양 및 종양 미세 환경의 면역 적 구성의 다중 특징에 대해 보고합니다: CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD56+ 자연 킬러 세포, CD19+ B 세포, CD14+ 단핵구, Tregs, M1 대식세포 및 M2 대식세포. 또한, 분석은 PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 및 ARG1: 10개의 면역 탈출 유전자의 발현(백만 체당 또는 TPM)을 보고한다.
시약 키트는 그림 1과같이 하이브리드 캡처 기반 라이브러리 준비 방법에 따라 Illumina 플랫폼에서 시퀀싱할 수 있는 고품질 라이브러리를 만드는 데 사용됩니다. 연구원이 실험실에 Illumina 시퀀싱 플랫폼이 없는 경우 시퀀싱을 위해 샘플을 핵심 실험실에 제출할 수 있습니다. 일단 생성되면, 시퀀싱 데이터는 자동화된 분석을 위해 프리즘 포털에 업로드되고, 각 개별 샘플에 대한 포괄적인 정량적 프로파일은 면역보고서(그림 2A)의형태로 사용자에게 반환된다. 사용자는 또한 프리즘 포털에서 샘플 그룹화를 정의하여 바이오마커보고서(그림 2B)를생성하여 두 환자 집단을 구별하는 통계적으로 유의한 바이오마커를 강조할 수 있다. 중요한 것은, 시약 키트에 의해 생성된 데이터는 연구용으로만 사용되며 진단 목적으로 사용될 수 없다는 것이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> 그림 1: 워크플로개요. 이 프로토콜에서 RNA는 먼저 cDNA로 변환됩니다. 시퀀싱 어댑터는 결찰되고, 어댑터-리그형 cDNA는 PCR에 의해 증폭되고 바코드화되어 사전 캡처 라이브러리를 생성합니다. 생물체화된 프로브는 그 때 스트렙타비딘 구슬을 사용하여 포획되는 특정 cDNA 표적에 혼성화됩니다. 언바운드, 비표적 cDNA는 세척에 의해 제거됩니다. 최종 PCR 보강은 시퀀싱을 위한 포스트 캡처 라이브러리를 생성합니다. *총 RNA는 인간 샘플에서 나온 것이어야 합니다. 손상되지 않거나 저하될 수 있습니다(FFPE) RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> 그림 2: 대표적인 면역 보고서. 워크플로우에서는 처리된 각 샘플에 대해 2개의 보고, 개별 면역보고서(A)및 정의된 환자 집단에 대한 바이오마커보고서(B)를생성합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 프로토콜은 약 16시간의 준비 시간이 필요합니다(총 RNA에서 시퀀싱준비가 된 라이브러리까지); 그러나 프로토콜에 설명된 대로 선택적 중지 지점이 많이 있습니다. 이 분석실험은 전사체의 풍부하고 역동적인 특성을 활용하여 기존의 단일 분석물 바이오마커를 넘어 다차원 유전자 발현 모델로 이동하여 표준화된 조직 샘플의 포괄적인 생물학적 특성화를 가능하게 합니다. 시약 및 사용하기 쉬운 소프트웨어 도구. 이를 통해 연구원들은 기계 학습과 건강 표현 모델 데이터베이스를 활용하여 귀중한 임상 샘플의 보다 정확하고 정량적인 면역 프로필을 도출하고 발견함으로써 자신의 실험실에서 현대 기술을 활용할 수 있습니다. 전체 통계 분석을 갖춘 다차원 RNA 바이오마커.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

면역 요법은 종양학 환자의 치료에 대한 약속을 보여주지만 종양 미세 환경의 복잡한 이질성은 치료 반응을 예측하는 데 어려움을 줍니다. 종양 조직 안팎에 존재하는 면역 세포의 상대적 집단을 해결하는 능력은 반응을 이해하는 데 임상적으로 관련이 있는 것으로 나타났지만 유세포분석 및 면역조직화학과 같은 전통적인 기술에 의해 제한된다. IHC), 필요한 많은 양의 조직, 정확한 세포 유형 마커의 부족, 및 많은 기술적 및 물류 적 장애물로 인해. 한 분석실험(예를 들어, 면역프리즘 면역 프로파일링 분석)은 임상적으로 보관된 고형 종양 조직에서 추출된 RNA의 소량RNA 및 고분해된 RNA를 모두 수용함으로써 이러한 과제를 극복한다. 이 분석법은 일루미나 시퀀싱 플랫폼을 위한 종단 간 정량적, 고처리량 면역 프로파일링 솔루션을 제공하는 시약 키트 및 클라우드 기반 정보학을 통해 액세스됩니다. 연구원은 포르말린 고정 파라핀 내장 (FFPE) 조직 또는 총 RNA의 20-40 ng (샘플 품질에 따라 다름)의 2개의 단면도로 시작하고, 프로토콜은 8개의 면역 세포 모형 및 10개의 면역 성이 있는 탈출을 정량화하는 면역 성 단 면도 보고서를 생성합니다 종양 미세 환경의 완전한 전망을 캡처합니다. 결과 데이터를 사용하기 위해 추가적인 생물정보학적 분석이 필요하지 않습니다. 적절한 샘플 코호트와 함께, 프로토콜은 또한 관심있는 환자 집단 내에서 통계적으로 유의한 바이오마커를 식별하는데 사용될 수 있다.

사용자가 생성된 재료의 품질과 양을 평가할 수 있도록 프로토콜 전체에 걸쳐 여러 체크포인트가 있습니다. 프로토콜에 기재된 12단계에 따라, 일렉트로로그램은 도 3에도시된 바와 같이 생성되며, 손상되지 않은 RNA 샘플에 대한 전형적인 사전 포획 라이브러리를 대표한다(RIN=7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> 그림 3: 손상되지 않은 RNA 샘플에 대한 일반적인 사전 포획 라이브러리 바이오분석기 추적. 사전 캡처 라이브러리는 크기가 250-400개의 기본 쌍(bp) 정도의 넓은 피크로 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
도 4에나타낸 바와 같이, FFPE RNA 샘플로부터 생성된 사전 포획 라이브러리의 대표적인 전기전보람(DV200 = 46)에 도시된 바와 같이 과다 증폭을 피하기 위해 주의를 기울여야 한다. 이 피크가 주 피크(약 250-400 염기 쌍(bp)에 비해 작으면 다운스트림 단계 또는 분석을 방해하지 않습니다. 두 번째 피크가 250-400 bp 피크에 비해 큰 경우, 사전 캡처 라이브러리는 과다 증폭을 줄이기 위해 적은 PCR 사이클로 다시 만들 수 있습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> 그림 4: FFPE RNA 샘플에 대한 일반적인 사전 포획 라이브러리 바이오분석기 추적. 약 1,000 bp의 두 번째 피크는 과대 증폭을 나타냅니다. 이 피크가 250-400 bp(그림 참조)의 주 피크에 비해 작으면 다운스트림 단계 또는 분석을 방해하지 않습니다. 두 번째 피크가 250-400 bp 피크에 비해 큰 경우, 사전 캡처 라이브러리는 과잉 증폭을 줄이기 위해 적은 PCR 사이클로 다시 만들 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
12.1.3 단계에서 설명한 대로 어댑터 디머의 존재를 평가하여 추가 정리가 필요한지 확인해야 합니다. 도 5에 나타낸 일렉트로페로그램은 받아들일 수 없는(그림5A,DV200 = 33) 및 허용 가능한(그림5B,DV200 = 46) 수준의 어댑터 이량체를 나타내며, 약 128bp의 날카로운 피크로 나타난다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> 그림 5: 사전 캡처 라이브러리 바이오분석기 추적. 어댑터 디머는 128 bp.(A)이 일렉트로로그램에 존재하는 과도한 어댑터 디이머의 주위에 날카로운 피크로 나타난다. (B)허용 어댑터 디머 레벨이 이 추적에 묘사되어 있습니다. 두 흔적은 온화한 과다 증폭의 증거를 보여줍니다, 그러나 이것은 면역 프리즘 분석과 방해해서는 안됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
프로토콜이 완료되면 시퀀싱 전에 최종 라이브러리가 디지털 전기 동극을 사용하여 다시 평가됩니다. FFPE RNA로 만들어진 라이브러리는 손상되지 않은 RNA로 만든 라이브러리보다 더 작은 평균 크기 분포를 가지는 경향이 있습니다. 손상되지 않은 RNA 샘플의 경우 결과 추적은 그림 6(RIN = 9.5)과 유사하게 보일 것입니다. 저하되거나 FFPE RNA의 경우 결과 추적은 그림 7(DV 200 = 36)과 유사하게 보일 것입니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> 그림 6: 손상되지 않은 RNA 샘플에 대한 일반적인 최종 라이브러리 바이오분석기 추적. 최종 라이브러리는 크기가 250-400개의 기본 쌍(bp) 정도의 넓은 피크로 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> 그림 7: FFPE RNA 샘플에 대한 일반적인 최종 라이브러리 바이오분석기 추적. FFPE RNA로 만들어진 라이브러리는 손상되지 않은 RNA로 만든 라이브러리보다 더 작은 평균 크기 분포를 가지는 경향이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
설명된 바와 같이, 이 프로토콜로 생성된 결과는 도 8에나타낸 바와 같이 두 가지 주요 방법으로 적용될 수 있다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> 그림 8: 프로토콜의 두 가지 사용 사례입니다. 이 면역 프로파일링 분석에 의해 생성된 결과는 두 가지 주요 번역 응용 프로그램에서 적용됩니다. (A)첫번째 사용 사례는 인간 고형 종양 조직(FFPE 아카이브 포함)에서 시작하여 샘플에 대한 개별 면역 프로필을 생성합니다. (B)일단 인간 샘플의 코호트에 대해 생성된 데이터는 프리즘 포털을 사용하여 다차원 바이오마커 및 해당 바이오마커 보고서를 생성한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이러한 각 사용 사례를 입증하기 위해 작은 번역 연구의 대표 데이터가21로포함되어 있습니다. 본 연구에서 사용된 견본은 비소세포 폐암 (NSCLC)을 위해 진단되고 취급된 7명의 환자에게서 견본의 세트입니다. 견본은 전후 처리 생검에서 환자 일치한 고형 종양 조직입니다. 먼저, 개별 샘플을 분석하여 도 9에도시된 실시예 보고서와 같은 면역 프로파일을 생성하였다.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> 도 9: NSCLC 샘플에 대한 개별 면역 보고서를 예로 들 수 있다. 프리즘 포털 파이프라인은 처리된 각 샘플에 대한 그래픽 보고서를 생성하며 여기에 표시된 NSCLC 고형 종양 샘플에 대해 생성된 대표 보고서가 있습니다. (A)보고서의 전면은 FFPE 조직에서 추출된 RNA 샘플에 존재하는 면역 세포의 분해를 그래픽으로 나타낸다. (B)보고서의 반대쪽은 면역 세포 (절대 백분율) 및 탈출 유전자 발현 (백만 당 성적 증명서, 또는 TPM)의 테이블뿐만 아니라 분석에 대한 성능 의 문을 포함한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
면역 프로파일 전-및 사후 치료는 어떻게 치료(화학요법 또는 방사선,이 연구에서)가 종양 미세 환경을 변형시켰는지 이해하는 데 사용될 수 있다. 예는 도 10에도시되어 있는데, 여기서 각 면역 세포에 대한 백분율의 변화와 총 면역 함량은 단일 환자에 대해 화학요법 전후로 나타난다.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> 그림 10: 예시 전과 후 치료 결과. 단일 NSCLC 환자로부터 치료 전 및 사후 샘플에서 생성된 개별 면역 세포 및 총 면역 함량 데이터가 도시됩니다. 이 예에서, 환자는 치료로서 화학요법 요법을 받았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
환자는 비교를 위한 임상 결과 표현형과 같은 기준에 의해 분류될 수 있습니다. 예를 들어, 도 11에서,NSCLC 연구에서 샘플은 치료 후 질병 진행에 대한 시간에 따라 비교되었다. 환자의 부분 집합은 >18 개월에서 질병 재발을 보여주었고, 또 다른 하위 집합은 ≤18 개월에서 더 빨리 진행되었습니다. 중앙값 델타 값(치료 전과 후 값 간의 차이)은 각 샘플에 대해 비교하여 질병 진행의 가처분 바이오마커를 식별합니다.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> 도 11: 예시 임상 결과 비교. 일치하는 전처리 전과 후 NSCLC 샘플에서 면역 세포 백분율 사이의 정량적 변화는 "델타" 값으로 계산및 보고되었다. 노란색으로 강조 표시된 사람들은 생존 상태 사이의 명확한 신호 변화를 보여줍니다. 파란색 막대는 질병이 진행될 때까지 >18개월의 중앙값 델타 값을 나타내고, 주황색 막대는 질병 진행까지 ≤18개월동안의 중앙델타 값을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마지막으로, 유사한 샘플 그룹은 프리즘 포털을 사용하여 바이오마커 보고서를 생성함으로써 예측 바이오마커를 식별하기 위해 전처리 샘플을 구체적으로 살펴보는 데 사용될 수 있다. 도 12에도시된 바와 같이, 상술한 바와 같은 임상 표현형(disease progression)은 샘플 군칭을 정의한다. 이 예에서, 2개의 면역 이스케이프 유전자는 샘플 그룹(CD47 및 OX40, 도 12A의하부 패널에 도시된)의 통계적으로 유의한 분별체로서 확인되었다. 이 예에서, 개별 유전자 바이오마커는 명확한 통계적 유의성을 갖는 견고하기 때문에, 다차원 바이오마커는 유의한 예측 값을 추가하지 않는다(ImmunoPrism, 도 12B의오른쪽 상단 막대 차트에 표기된 대로). 분석 분석에 대한 모든 18개의 분석물 결과를 포함한 전체 데이터 테이블은 통계 분석 및 간략한 방법 요약을 포함하여 보고서의 뒷면에 요약되어 있습니다.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> 그림 12: NSCLC 샘플에 대한 바이오마커 보고서 예. 바이오마커 디스커버리 파이프라인은 개별 바이오마커의 시각적 보고서와 기계 학습 다차원 바이오마커를 상세한 통계와 함께 제공합니다. (A)본 연구에서 파이프라인은 2개의 개별 바이오마커(CD47 및 OX40)를 18개월의 임계값으로 질병 진행을 정의하는 데 통계적으로 유의한 것으로 확인하였다. (B)방법 및 전체 결과에 대한 세부 정보가 보고서의 뒷면에 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 시약 키트 재료. ImmunoPrism 키트에 제공된 재료 목록과 제조업체의 프로토콜에서 참조한 부품 번호가 나열됩니다. 필요한 기타 모든 장비 및 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 안전 데이터 시트(SDS)의 <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> 방문하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).</a>
보충 표 2: 열 사이클러 프로그램. 프로토콜 전체에서 참조되는 권장 되는 사이클러 프로그램은 프로그래밍의 용이성을 위해 요약됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).</a>
보충 표 3: 시퀀싱 인덱스 가이드. 시약 키트에 제공된 인덱스 프라이머가 열거되어; 연속 적중을 위한 각 반응에 독특한 프라이머가 첨가된다. 권장되는 저레벨 멀티플렉싱 조합도 제공됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

고형 종양 조직의 정량적 면역 프로파일을 결정하고 면역 종양학 바이오마커 발견을 위한 임상 코호트를 활용하는 RNA 기반 접근법의 사용은 분자 및 정보학 프로토콜을 통해 설명된다.

고형 종양의 예측 면역 모델링

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

종양 미세 환경을 포괄적으로 특성화하는 것은 면역 종양학 연구에서 필수적입니다. 이 분석체는 고형 종양 조직에서 면역 세포를 측정하기 위해 RNA 기반 건강 발현 모델을 사용하는 최초의 분석이다. 이 분석은 연구원이 FFB 고형 종양 조직에서 면역 결합의 매우 민감하고 특정 측정을 얻고 다차원 바이오 마커로 이러한 결과를 결합 할 수 있습니다.면역 요법뿐만 아니라 모든 암 치료는 고형 종양 부위에 면역 반응을 유도합니다. 이 면역 반응을 측정하는 것은 질병 진행 및 치료 반응을 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 기존의 RNA 라이브러리 준비 기술과 표적 캡처를 결합합니다.시간이 많이 걸리는 동안, 세척 단계에 따라 제안 된 품질 관리 체크 포인트를 모니터링하는 것은 성공을 위해 매우 중요합니다. 포르말린 고정 파라핀 임베디드 샘플에서 고도로 저하된 RNA의 경우, 테이블에 따라 얼음에 대한 첫 번째 가닥 합성 반응을 조립한다. 미세 원심 분리기에서 시료를 잠시 회전하기 전에 여러 번 위아래로 피펫팅하여 반응을 철저히 혼합합니다.원심분리가 끝나면 테이블에서 프로그램 번호 3에 따라 샘플을 예열된 열 순환기에 즉시 배치합니다. 고품질 의 그대로 RNA를 위해, 테이블에 설명된 대로 핵자유 PCR 관에 얼음에 대한 첫 번째 가닥 합성 반응을 조립한다. 이 절차를 시작하려면, COT-1 DNA의 두 마이크로 그램과 뉴클레아제없는 PCR 튜브에서 올리고를 차단하는 두 마이크로 리터와 관심의 바코드 라이브러리의 200 나노 그램을 혼합.그런 다음 30 ~45도로 설정된 진공 농축기를 사용하여 튜브의 내용기를 건조시다. 혼성화 후 열 사이클러에서 샘플을 제거하고 열 사이클러를 섭씨 65도에서 배양하도록 설정하고 가열 된 뚜껑은 섭씨 70도로 설정됩니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 완전히 균질화된 구슬 17마이크로리터를 샘플및 파이펫으로 10회 위아래로 완전히 전송합니다.비드에 DNA를 결합하려면 튜브를 열 순환기(10)에 따라 열 순환기에 넣고 10분마다 10분에서 12분마다 벗겨진 튜브를 3초동안 부드럽게 제거하여 구슬을 다시 매달아 두십시오. 결합 된 인큐베이션 직후 열 사이클러에서 튜브 한 스트립을 제거하고 예열 된 세척 버퍼 100 마이크로 리터를 튜브에 추가합니다. 파이펫을 10번 위아래로 철저히 위아래로 배치하여 튜브를 마그네틱 랙에 배치하여 구슬이 세척 용액과 완전히 분리된 후 상체가 포함된 무한DNA를 흡입할 수 있도록 합니다.랙에서 튜브를 제거하고 거품을 피하기 위해 주의하는 구슬을 완전히 재연하기 위해 철저한 혼합과 함께 예열 된 엄격한 세척 버퍼 150 마이크로 리터를 추가하십시오. 튜브를 65도의 열 사이클러에 다시 넣고 튜브를 자기 랙에 다시 배치하여 구슬이 초월제와 완전히 분리되도록 합니다. 슈퍼나티가 함유된 언바운드 DNA를 버리고, 총 2개의 엄격한 세척을 위해 입증된 것처럼 예열된 엄격한 세척 버퍼로 구슬을 다시 한 번 씻으십시오.마지막 세척 후, 상체를 제거하고 실내 온도 세척 버퍼 150 마이크로 리터를 튜브에 추가합니다. 파이펫은 구슬을 완전히 재닫고 30초 동안 소용돌이를 번갈아 가며 30초 동안 쉬며 2분 동안 밀봉된 뚜껑으로 샘플을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서 원심분리기는 간단히 원심분리기를 짧게 놓고 튜브를 자기 랙에 놓고 구슬이 자석에 완전히 부착되면 상퍼를 제거합니다.캡을 닫고 샘플을 자기 랙으로 되돌리면 튜브를 간략하게 원심분리합니다. 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 잔류 세척 버퍼를 제거하고 실온 세척 버퍼 2의 150 마이크로리터를 추가하십시오. 파이펫은 구슬을 완전히 재닫고 30초 동안 소용돌이를 번갈아 가며 30초 동안 쉬며 2분 동안 밀봉된 뚜껑으로 샘플을 배양합니다.간단한 원심 분리 후 각 튜브의 구슬 전체 부피를 깨끗한 핵자유 PCR 튜브로 옮기고 튜브를 자기 랙에 놓습니다. 슈퍼나티가 포함된 언바운드 DNA를 폐기한 후, 샘플을 다시 원심분리하고 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 자기 랙에 있는 동안 구슬에서 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 150 마이크로리터의 워시 버퍼 3을 튜브에 넣고 파이펫을 10~20회 위아래로 추가하여 구슬을 완전히 재보페합니다.튜브를 2분간 배양하여 30초 간 부드러운 소용돌이와 30초 간 휴식을 취한 후 잠시 원심분리합니다. 튜브를 자기 랙에 놓고 슈퍼네이넌트를 흡인시키고 비드 샘플을 다시 원심분리합니다. 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 랙에서 튜브를 제거하고 튜브 당 뉴클레아스없는 물 20 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단하기 전에 자기 랙에있는 동안 구슬에서 잔류 세척 버퍼를 제거하십시오.그런 다음 구슬을 10번 피펫하여 튜브 측면에 붙어있는 구슬이 다시 중단되었는지 확인합니다. 어댑터 디머의 존재를 평가하여 추가 정리가 필요한지 확인해야 합니다. 예를 들어, 이 전기페로그램은 128개의 기본 쌍 주위의 날카로운 피크로 나타나는 허용 가능한 어댑터 디머 수준을 나타내며, 이 전기페로그램은 받아들일 수 없는 수준의 어댑터 디머를 나타낸다.상기 면역 프로파일전 및 사후치료는 관심있는 각 면역세포에 대한 백분율의 변화와 총 면역 함량이 단일 환자에 대한 화학요법 전 및 후화학요법을 나타내는 대표적인 분석에서와 같이 종양 미세 환경에 대한 특정 치료법의 효과를 이해하는 데 사용될 수 있다. 이 분석에서 환자 그룹 간의 샘플은 치료 후 질병 진행 시간에 따라 비교되었습니다. 환자의 하위 집합은 18 달 후에 질병 재발을 보여주었고 다른 하위 세트는 18 달 이하에서 더 빨리 진행되었습니다.중앙델타 값은 각 시료에 대해 비교하여 질병 진행의 바이오마커를 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 여기서 2개의 면역 탈출 유전자는 견본 군진의 통계적으로 유의한 분화기로 확인되었습니다. 개별 유전자 바이오마커는 명확한 통계적 유의성을 가지고 견고했기 때문에 다차원 바이오마커는 상당한 예측 가치를 추가하지 않았다.시료 냉각을 방지하기 위해 한 번에 하나의 스트립을 가열한 세체를 수행하고 비드를 신선한 튜브로 옮겨 표적 오염을 피해야 합니다. 이 프로토콜은 면역 세포와 종양 조직을 정량화하기 위해 유전자 발현 모델의 사용을 보여줍니다. 새로운 모델은 피로 또는 활성화와 같은 세포 상태를 측정하기 위해 개발되고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...