Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne TriStar Technology Group for å gi de biologiske prøvene for de representative resultatene, samt hele molekylære, analyse-, produkt- og kommersielle team hos Cofactor Genomics for deres tekniske ekspertise og Støtte.

<ol>
	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Alle forfattere er ansatt av Cofactor Genomics, Inc., selskapet som utviklet og produserer ImmunoPrism reagenssett og informatikkverktøy som brukes i denne artikkelen. ImmunoPrism-analysen er kun til forskningsbruk, og er ikke til bruk i diagnostiske prosedyrer.

Protokollen krever 20 ng intakt eller 40 ng svært degradert (FFPE) RNA. RNA-prøven skal være fri for DNA, salter (f.eks. mg2+eller guanidiniumsalter), ulike kationerterte chelaterende midler (f.eks. EDTA, EGTA, citrate) eller organiske stoffer (f.eks. fenol og etanol). Det anbefales ikke å fortsette med RNA-prøver som har en DV200 <20%. Bruk av in-kit kontroll RNA anbefales sterkt som disse kontrollene gir et middel til å evaluere ytelsen gjennom hele protokollen, fra bibliotek forberedelse til analyse.
Protokollen er utformet for å utføres ved hjelp av 0,2 ml PCR-striperør. Hvis den foretrekkes, kan protokollen også utføres ved hjelp av brønnene i en 96-brønns PCR-plate. Bare bruk brønnene til en 96-brønnpcrplate i stedet for alle referanser til PCR-rør eller striperør. Bruk PCR-plater kun med klare brønner, da det er avgjørende å visuelt bekrefte fullstendig resuspensjon av perler under perlerensing og vasketrinn.
Gjennom hele protokollen, hold reagenser frosset eller på is med mindre annet er spesifisert. Ikke bruk reagenser før de er helt tint. Pass på å blande alle reagenser grundig før bruk.
Oppbevar enzymer ved -20 °C til de er klare til bruk og gå tilbake til -20 °C umiddelbart etter bruk. Bruk bare kjernevann av molekylær karakter; det anbefales ikke å bruke DEPC-behandlet vann. Ved pipettering for å blande, forsiktig aspirer og dispenser minst 50% av det totale volumet til løsningene er godt blandet. Pipette blander alle masterblandinger som inneholder enzymer. Bruk av vortex for å blande enzymene kan føre til denaturering og kompromittere ytelsen. Under perlerensing, bruk nylagde 80% etanolløsninger fra molekylær karakter etanol. Bruk av etanolløsninger som ikke er friske, kan føre til lavere utbytter. Unngå over tørking av perlene, da dette kan redusere elutioneffektivitet (perler ser sprukket ut hvis de tørkes).
Som beskrevet i trinn 10, legges unike indeksprimere til hver reaksjon. Basert på sekvensene av disse indeksene, for lavnivå multipleksing, er visse indekskombinasjoner optimale. Sekvensene av disse indeksene er nødvendige for å demultiplexing dataene etter sekvensering. Sekvensene og anbefalte multipleksingkombinasjoner er gitt i tilleggstabell 3. I dette samme trinnet er det viktig å merke seg at antall anbefalte PCR-sykluser varierer avhengig av kvaliteten på RNA som brukes, og noen optimalisering kan være nødvendig for å forhindre PCR overforsterkning. For ImmunoPrism Intakt Control RNA og andre høykvalitets RNA, start optimalisering med 10 PCR sykluser. For ImmunoPrism FFPE Control RNA og andre svært degraderte/FFPE RNA, start optimalisering med 15 PCR sykluser. Å produsere et testbibliotek ved hjelp av RNA-representant for materialet som skal analyseres for å optimalisere PCR-sykluser anbefales. Minimum antall PCR sykluser som konsekvent gir tilstrekkelig pre-capture bibliotek gir (> 200 ng) bør brukes. En sekundær topp rundt 1000 bp på Bioanalyzer-sporet indikerer overforsterkning (figur 4). Overforsterkning bør minimeres, men tilstedeværelsen av en liten sekundær topp vil ikke forstyrre analyseresultatene.
For å minimere prøvetap og unngå å bytte rør, kan trinn 13 utføres i PCR-rør, striperør eller en 96-brønns PCR-plate i stedet for 1,5 ml mikrorør, hvis vakuumkonsentratoren tillater det. Rotoren kan fjernes på mange konsentratorer. Dette gjør at striperørene eller platene får plass i vakuumet. Vakuumkonsentrasjonen kan deretter kjøres ved hjelp av den vandige uttørkingsinnstillingen uten sentrifugering. Se manualen for vakuumkonsentratoren for instruksjoner. Hvis prøvene tørkes ned i striperør eller en 96-brønnplate, kan hybridiseringstrinnet utføres i samme fartøy.
I trinn 17, sørg for å virvle hver 10-12 min for å øke perle fangst effektivitet. Hold forsiktig hettene på de varme striperørene når du blander for å hindre at rørene åpnes.
Vaskene som er beskrevet i trinn 18, er kritiske for å unngå høy uspesifikk kontaminering og må følges nøye. Pass på at du setter perlene helt på nytt ved hver vask, fjern vaskebufferne helt, og under Vask buffer 2-vasken overfører du prøvene til et friskt striperør (trinn 18.6.5). Sørg for at streptavidinperlene er helt suspendert og forblir i suspensjon under hele inkubasjonen. Sprutpå rørhettene vil ikke påvirke fangsten negativt. Under romtemperaturvaskene kan en mikroplatevortexmikser brukes til å virvle prøvene for hele den to minutter lange inkubasjonsperioden for lettere resuspensjon. Ikke la streptavidinperlene tørke ut. Om nødvendig, utvide inkubasjoner i bufferne for å unngå tørking av perlene. Hvis du bruker mer enn ett striperør, arbeid med ett striperør om gangen for hver vask mens de andre striperørene sitter i termocycleren. Dette kan bidra til å unngå tørking av perlene eller rushing, noe som resulterer i dårlig resuspensjon eller andre sub-optimale teknikker. For førstegangsbrukere anbefales det ikke å behandle mer enn 8 bibliotekreaksjoner om gangen.
Nåværende immunprofileringsteknikker leverer et kontinuum av informasjon - fra tusenvis av datapunkter som krever betydelig tolkning (RNA-sekvensering) til et individuelt, diskret datapunkt (single-plex IHC). Protokollen som er beskrevet her representerer en tilnærming som er et sted i midten, med et fokusert omfang som muliggjør høy følsomhet, men fanger bare et delsett av klinisk relevante transkripsjonsdata. På grunn av arten av bulk RNA utvinning, denne protokollen gir ikke informasjon om de romlige relasjoner mellom immunceller og tumor mikromiljøet, men resultatene kan suppleres med bildeteknologi for å legge til denne informasjonen. Det finnes en myriade av applikasjoner for data generert av denne protokollen, da det er mye å lære om kreftbiologi som sykdom, og terapiene som utvikles for å behandle den. Som vist i de representative resultatene, er den enkelte immunrapport nyttig for å forstå hvordan en pasients immunprofil kan endres som svar på hendelser som sykdomsprogresjon eller behandling. Mens resultatene som presenteres her gir noen eksempel brukstilfeller, er andre bruksområder, inkludert å undersøke virkningsmekanismen til en terapi og identifisere putative biomarkører av kliniske resultater som progresjonsfri og total overlevelse, også Praktisk. Når du bruker denne protokollen for biomarkør oppdagelsesapplikasjoner, er det viktig å praktisere god studiedesign for å sikre at homogene populasjoner analyseres, tilstrekkelige prøver er inkludert for statistisk kraft, og kilder til bias vurderes. På grunn av analysens fokuserte, strømlinjeformede natur, er det mulig å forestille seg en vei mot klinisk validering og nedstrøms anvendelse av disse biomarkørene en gang oppdaget.

Kvantifisering av tumorinfiltrerende lymfocytter (TILs) og andre immunrelaterte molekyler i formalin-fast og parafin innebygd (FFPE) solid tumor menneskelige vevsprøver har vist verdi i klinisk forskning1,2,3. Vanlige teknikker som flow cytometri og encellede ribonucleic acid (RNA) sekvensering er nyttige for ferskt vev og blod4,men er uegnet for analyse av FFPE-materialer på grunn av manglende evne til å skape levedyktige cellesuspensjoner. Nåværende metoder som har blitt brukt til å kvantifisere disse cellene i FFPE vev lider av store utfordringer. Immunhistokjemi (IHC) og andre lignende bildebehandlingsarbeidsflyter krever spesifikke antistoffer for å oppdage celleoverflateproteiner, noe som kan være vanskelig å standardisere på tvers av laboratorier for å muliggjøre reproduserbar kvantifisering5. Plattformer som nCounter-systemet er avhengige av uttrykk for enkeltgener for å definere viktige immunceller6,noe som begrenser følsomhetog spesifisitet ved deteksjon. Mer generiskE RNA sekvensering metoder, kombinert med frittstående programvareverktøy, er tilgjengelige, men krever betydelig optimalisering og validering før bruk7,8,9,10,11,12. Nylige fremskritt i å kombinere laserfangst mikrodisseksjon (LCM) med RNA sekvensering for FFPE vev har vist løfte; Men en mer høy gjennomstrømning, er nøkkelferdig løsning nødvendig for translasjonelle studier som tar sikte på å identifisere robuste biomarkører13,14. Metoder for å generere flerdimensjonale biomarkører, for eksempel Prediktiv immunmodellering, som definerer pasientkohorter, inkludert behandlingsrespondere, kreftsubtyper eller overlevelsesutfall med høy prediktiv nøyaktighet og statistisk signifikans blir stadig viktigere i en alder av presisjonsmedisin og immunterapi15,16.
For å løse dette behovet ble det utviklet en immunprofileringsanalyse for å muliggjøre sensitiv og spesifikk kvantifisering av immunceller i solid tumor FFPE-vev ved hjelp av standardiserte RNA-sekvenseringsreagenser og skybaserte informatikk. I tillegg til å imøtekomme degradert RNA fra FFPE-vev, er protokollen i stand til å imøtekomme RNA avledet fra å begrense vevsprøver som kjernenålbiopsier, nåleaspirater og mikro- eller makrodissekert vev. RNA-data fra hvert utvalg sammenlignes med en database med genuttrykksmodeller av immunceller, kalt immunhelseuttrykksmodeller, for å kvantifisere immunceller som en prosentandel av totale celler som finnes i prøven. Kort, disse modellene ble bygget ved hjelp av maskinlæringsmetoder for å identifisere unike multigene uttrykksmønstre fra hele transkripsjonsdata generert fra renset immuncellepopulasjoner (isolert ved hjelp av kanoniske celle-overflate markører)17,18. De flerdimensjonale helseuttrykksmodellene som ligger til grunn for teknologien gjør det mulig for analysen å kvantifisere hver immuncelle som en prosent av de totale cellene som finnes i den heterogene blandingen. Dette gjør det mulig for forskeren å generere inter- og intra-sample immuncelle sammenligninger, som har vist seg å ha klinisk verdi19,20. Andre bruksområder inkluderer kvantifisering av immunrespons før- og etterbehandling, som beskrevet i de representative resultatene. Analysen rapporterer om flere funksjoner i immunkontekstur av tumor og tumor mikromiljø inkludert de absolutte prosentandelene av åtte immuncelletyper (avledet fra genuttrykksmodeller): CD4+ T celler, CD8+ T celler, CD56+ Natural Killer celler, CD19+ B celler, CD14+ monocytter, Tregs, M1 makrofager, og M2 makrofager. I tillegg rapporterer analysen uttrykket (i transkripsjoner per million, eller TPM) av ti immunrømningsgener: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 og ARG1.
Reagenssettet brukes til å gjøre biblioteker av høy kvalitet klare for sekvensering på en Illumina-plattform etter en hybrid opptaksbasert bibliotekforberedelsesmetode, som vist i figur 1. Hvis en forsker ikke har en Illumina sekvenseringsplattform i laboratoriet, kan de sende sine prøver til et kjernelaboratorium for sekvensering. Når de genereres, lastes sekvenseringsdata opp til Prism Portal for automatisert analyse, og en omfattende, kvantitativ profil for hvert enkelt utvalg, i form av immunrapporten (figur 2A),returneres til brukeren. Brukere kan også definere utvalgsgrupperinger i Prism Portal for å generere en Biomarker-rapport (figur 2B), og fremhever statistisk signifikante biomarkører som skiller to pasientkohorter. Viktigere, dataene som genereres av reagenssettet er kun for forskning bruk og kan ikke brukes til diagnostiske formål.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Figur 1: Oversikt over arbeidsflyt. I denne protokollen konverteres RNA først til cDNA. Sekvenseringsadaptere er ligated, og adapter-ligated cDNA forsterkes og strekkodes av PCR for å skape et pre-capture bibliotek. Biotinylated sonder blir deretter hybridisert til spesifikke cDNA mål som deretter fanges ved hjelp av streptavidin perler. Ubundet, ikke-målrettet cDNA fjernes ved vasking. En endelig PCR-berikelse gir et bibliotek etter fangst klar for sekvensering. *Total RNA må være fra menneskelige prøver; intakt eller degradert (FFPE) RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figur 2: Representative immunrapporter. Arbeidsflyten genererer to rapporter, en individuell immunrapport (A) for hver prøve behandlet, og en biomarkørrapport (B) for definerte pasientkohorter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Protokollen krever ca. 16 timer forberedelsestid (fra total RNA til biblioteker klare for sekvensering); Det finnes imidlertid en rekke valgfrie stoppepunkter, som nevnt i protokollen. Analysen gjør bruk av den rike, dynamiske natur transkripsjonomics å bevege seg utover eldre single-analyte biomarkører til flerdimensjonale genuttrykk modeller, og dermed muliggjør omfattende biologisk karakterisering av vevprøver med standardisert reagenser og brukervennlige programvareverktøy. Det gir forskere mulighet til å bruke en moderne teknologi i sitt eget laboratorium, ved å utnytte maskinlæring og en database med Helseuttrykksmodeller for å utlede mer nøyaktige, kvantitative immunprofiler av dyrebare kliniske prøver, og oppdage flerdimensjonale RNA biomarkører med full statistisk analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Immunterapier viser løfte i behandlingen av onkologipasienter, men kompleks heterogenitet i tumormikromiljøet gjør det utfordrende å forutsi behandlingsrespons. Evnen til å løse de relative populasjonene av immunceller tilstede i og rundt tumorvevet har vist seg å være klinisk relevant for å forstå respons, men er begrenset av tradisjonelle teknikker som flow cytometri og immunohistochemistry ( IHC), på grunn av den store mengden vev som kreves, mangel på nøyaktige celletypemarkører og mange tekniske og logistiske hindringer. En analyse (f.eks. Immunprofileringsanalyse) overvinner disse utfordringene ved å imøtekomme både små mengder RNA og svært degradert RNA, vanlige trekk ved RNA hentet fra klinisk arkivert solid tumorvev. Analysen er tilgjengelig via et reagenssett og skybaserte informatikk som gir en ende-til-ende kvantitativ, høy gjennomstrømning immunprofileringsløsning for Illumina sekvenseringsplattformer. Forskere starter med så få som to deler av formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev eller 20-40 ng av total RNA (avhengig av prøvekvalitet), og protokollen genererer en immunprofilrapport som kvantifiserer åtte immuncelletyper og ti immunflukt gener, fange en fullstendig visning av svulsten mikromiljø. Ingen ytterligere bioinformatikkanalyse er nødvendig for å benytte de resulterende dataene. Med de riktige utvalgskohortene kan protokollen også brukes til å identifisere statistisk signifikante biomarkører i en pasientpopulasjon av interesse.

Det finnes en rekke kontrollpunkter i hele protokollen som gjør det mulig for en bruker å evaluere kvaliteten og kvantiteten av genererte materialer. Etter trinn 12 beskrevet i protokollen genereres et elektropherogram som vist i figur 3, representant for et typisk forhåndsopptaksbibliotek for en intakt RNA-prøve (RIN = 7,8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Figur 3: Typisk Pre-capture Library Bioanalyzer spor for en intakt RNA-prøve. Pre-capture biblioteker vises som en bred topp rundt 250-400 base par (bp) i størrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Forsiktighet bør utvises for å unngå overamplifisering, som angitt av den andre toppen rundt 1000 bp vist i figur 4,et representativt elektropherogram av et pre-capture bibliotek generert fra en FFPE RNA prøve (DV200 = 46). Hvis denne toppen er liten i forhold til hovedtoppen (rundt 250-400 basispar (bp), som vist), vil den ikke forstyrre nedstrøms trinn eller analyse. Hvis den andre toppen er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket gjenskapes med færre PCR sykluser for å redusere overamplifisering.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Figur 4: Typisk Pre-capture Library Bioanalyzer-sporing for et FFPE RNA-eksempel. Den andre toppen rundt 1000 bp er et tegn på overforsterkning. Hvis denne toppen er liten i forhold til hovedtoppen rundt 250-400 bp (som vist), vil den ikke forstyrre nedstrøms trinn eller analyse. Hvis den andre toppen er stor i forhold til 250-400 bp peak, kan pre-capture biblioteket gjenskapes med færre PCR sykluser for å redusere over-forsterkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Som beskrevet i trinn 12.1.3, bør tilstedeværelsen av adapterdimmer evalueres for å avgjøre om ytterligere opprydding er nødvendig. Elektropherogrammer vist i figur 5 er representative for uakseptabelt (Figur 5A,DV200 = 33) og akseptabelt(Figur 5B,DV200 = 46) nivåer av adapterdimmer, vises som den skarpe toppen rundt 128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Figur 5: Bioanalysatorspor for forhåndsopptaksbibliotek. Adapterdimmen vises som en skarp topp rundt 128 bp. (A) Overdreven adapterdimmer er til stede i dette elektropherogrammet. (B) Akseptabel adapter dimmenivåer er avbildet i denne sporingen. Begge sporene viser tegn på mild overforsterkning, men dette bør ikke forstyrre ImmunoPrism-analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Ved ferdigstillelse av protokollen, før sekvensering, blir de endelige bibliotekene igjen evaluert ved hjelp av digital elektroforese. Biblioteker laget av FFPE RNA har en tendens til å ha en mindre gjennomsnittlig størrelsesfordeling enn biblioteker laget av intakt RNA. For intakte RNA-prøver skal den resulterende sporingen se ut som figur 6 (RIN = 9,5). For degradert eller FFPE RNA, bør den resulterende sporingen se ut som figur 7 (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figur 6: Typisk bioanalysatorspor for sluttbibliotek for en intakt RNA-prøve. Endelige biblioteker vises som en bred topp rundt 250-400 basispar (bp) i størrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Figur 7: Typisk Bioanalysatorspor for sluttbibliotek for et FFPE RNA-eksempel. Biblioteker laget av FFPE RNA har en tendens til å ha en mindre gjennomsnittlig størrelsesfordeling enn biblioteker laget av intakt RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Som beskrevet kan resultatene som genereres med denne protokollen, brukes på to viktige måter, som vist i figur 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Figur 8: To brukstilfeller av protokollen. Resultatene som genereres av denne immunprofileringanalysen, brukes i to viktige translasjonelle applikasjoner. (A) Den første brukssaken starter fra humant solid tumorvev (inkludert FFPE-arkiver) og genererer en individuell immunprofil for prøven. (B) Når de genereres for en kohort av menneskelige prøver, kombineres dataene ved hjelp av Prism Portal for å generere en flerdimensjonal biomarkør og tilsvarende Biomarker-rapport. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
For å demonstrere hvert av disse brukstilfellene, inkluderes representative data fra en liten translasjonell studie21. Prøvene som brukes i denne studien er et sett med prøver fra 7 pasienter diagnostisert og behandlet for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Prøvene er pasienttilpasset fast tumorvev fra biopsier før og etter behandling. Først ble individuelle prøver analysert for å generere en immunprofil, for eksempel eksempelrapporten som vises i figur 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figur 9: Eksempel individuell immunrapport for et NSCLC-utvalg. Prism Portal-rørledningen genererer en grafisk rapport for hvert utvalg behandlet, med en representativ rapport generert for en NSCLC solid tumorprøve vist her. (A) Forsiden av rapporten viser grafisk nedbrytning av immunceller tilstede i RNA-prøven ekstrahert fra FFPE-vevet. (B) Baksiden av rapporten inkluderer en tabell over immunceller (i absolutte prosenter) og unnslippe genuttrykk (i transkripsjoner per million, eller TPM), samt en erklæring om ytelse for analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Immunprofilene før og etter behandlingen kan brukes til å forstå hvordan en terapi (kjemoterapi eller stråling, i denne studien) har endret tumormikromiljøet. Et eksempel er vist i figur 10, hvor endringene i prosentandel for hver immuncelle og totalt immuninnhold vises pre- og post kjemoterapi, for en enkelt pasient.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figur 10: Eksempel resultater for pre og etter behandling. Individuelle immuncelle- og totale immuninnholddata generert fra pre- og post-treatment prøver fra en enkelt NSCLC pasient er vist. I dette eksemplet fikk pasienten et kjemoterapiregime som behandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Pasienter kan grupperes etter kriterier som kliniske resultater eller fenotyper til sammenligning. For eksempel, i figur 11,ble prøvene i NSCLC-studien sammenlignet i henhold til tid til sykdomsprogresjon etter behandling. En undergruppe av pasientene viste sykdomstilbakefall i > 18 måneder, og en annen undergruppe utviklet seg raskere, i ≤18 måneder. Median deltaverdi (forskjell mellom verdier før og etter behandling) sammenlignes for hver prøve for å identifisere putative biomarkører for sykdomsprogresjon.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figur 11: Eksempel på sammenligning av klinisk utfall. Kvantitative endringer mellom immuncelleprosentene i samsvarende NSCLC-prøver før og etter behandling ble beregnet og rapportert som "delta"-verdien. De som er uthevet i gult viser klare signalendringer mellom overlevelsesstatusen. Blå barer representerer median deltaverdier i >18 måneder til sykdomsprogresjon, oransje barer representerer median deltaverdier i ≤18 måneder til sykdomsprogresjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Til slutt kan lignende prøvegrupperinger brukes til å se spesielt på pre-behandlingsprøver for å identifisere prediktive biomarkører ved hjelp av Prism Portal for å generere en Biomarker-rapport. Vist i figur 12definerer den samme kliniske fenotypen (sykdomsprogresjon) som beskrevet ovenfor prøvegrupperingene. I dette eksemplet ble to immunrømningsgener identifisert som statistisk signifikante differensiere av prøvegrupperingene (CD47 og OX40, vist i det nedre panelet i figur 12A). I dette eksemplet, fordi de enkelte genbiomarkører er robuste med klar statistisk signifikans, legger den flerdimensjonale biomarkøren ikke til betydelig prediktiv verdi (ImmunoPrism, som merket i øverste høyre stolpediagram av figur 12B). Den fullstendige tabellen med data, inkludert resultater for alle de 18 analytter for analysen, oppsummeres på baksiden av rapporten, inkludert statistisk analyse og et kort metodesammendrag.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Figur 12: Eksempel på Biomarkørrapport for NSCLC-eksempler. Biomarker Discovery-rørledningen leverer en visuell rapport om individuelle biomarkører, og en flerdimensjonal biomarkør for maskinlæring, med detaljert statistikk. (A) For denne studien identifiserte rørledningen to individuelle biomarkører (CD47 og OX40) som statistisk signifikant for å definere sykdomsprogresjon med en terskel på 18 måneder. (B) Detaljer om metoden og fullstendige resultater er inkludert på baksiden av rapporten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
Tilleggstabell 1: Reagenssettmaterialer. En liste over materialer som følger med i ImmunoPrism Kit er oppført, sammen med delenumrene som det refereres til i produsentens protokoll. Alt annet utstyr og materialer som kreves, er oppført i materialtabellen. Gå til <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> for sikkerhetsdatablad (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).</a>
Tilleggstabell 2: Termiske cycler programmer. De anbefalte sykkelprogrammer referert gjennom protokollen er oppsummert for enkel programmering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).</a>
Tilleggstabell 3: Sekvensering av indeksveiledning. Indeksprimere som følger med i reagenssettet, er oppført. en unik primer legges til hver reaksjon for ettersekvensering av multipleksing. Anbefalte kombinasjoner på lavt nivå er også tilgjengelig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Bruken av en RNA-basert tilnærming for å bestemme kvantitative immunprofiler av solid tumorvev og utnytte kliniske kohorter for immun-onkologi biomarkøroppdagelse er beskrevet gjennom en molekylær og informatikkprotokoller.

Prediktiv immunmodellering av solide svulster

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Omfattende karakterisering av tumormikromiljøet er avgjørende for immuno-onkologiforskning. Denne analysen er den første til å bruke RNA-baserte helseuttrykksmodeller for å måle immunceller i solid tumorvev. Denne analysen gjør det mulig for forskere å få svært følsomme og spesifikke målinger av immunkonteksturet i FFB solid tumorvev og å kombinere disse resultatene til en flerdimensjonal biomarkør.Alle kreftbehandlinger, ikke bare immunterapier, fremkaller en immunrespons på stedet av den faste svulsten. Måling av denne immunresponsen er viktig for å forstå sykdomsprogresjon og terapiresponser. Denne protokollen kombinerer tradisjonelle RNA-bibliotekforberedelsesteknikker med målrettet fangst.Mens tidkrevende, følge vaske trinnene og overvåke kvalitetskontroll sjekkpunkter som foreslått er svært viktig for å lykkes. For svært degradert RNA fra formalin-faste parafin innebygde prøver, montere den første tråden syntesereaksjonen på is i henhold til tabellen. Bland reaksjonene grundig ved å pipe opp og ned flere ganger før du kort snurrer ned prøvene i en mikrocentrifuge.På slutten av sentrifugeringen plasserer du umiddelbart prøvene i en forvarmet termisk cycler etter program nummer tre fra bordet. For intakt RNA av høy kvalitet monterer du den første trådsyntesereaksjonen på is i et kjernefritt PCR-rør som beskrevet i tabellene. For å starte denne prosedyren, bland 200 nanogrammer av det strekkodede biblioteket av interesse med to mikrogram COT-1 DNA og to mikroliter med å blokkere oligos i et kjernefritt PCR-rør.Bruk deretter en vakuumkonsentrator satt til 30 til 45 grader Celsius for å tørke innholdet i røret. Etter hybridisering, fjern prøvene fra den termiske cycler og sett termisk cycler å inkubere på 65 grader Celsius med oppvarmet lokket satt til 70 grader Celsius. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 17 mikroliter med fullstendig homogeniserte perler til prøvene og pipetten grundig opp og ned 10 ganger.For å binde DNA til perlene, plasser rørene i den termiske cycler følgende program 10 kort fjerne de strippet rør hvert 10 til 12 minutter i tre sekunder med mild vortexing for å holde perlene resuspended. Umiddelbart etter den innbindede inkubasjonen, fjern en stripe med rør fra den termiske cycleren og tilsett 100 mikroliter med forvarmet vaskebuffer en til rørene. Pipetten grundig opp og ned 10 ganger og plasser rørene på et magnetisk stativ slik at perlene kan skilles helt fra vaskeløsningen før de aspirerer det ubundne DNA-et som inneholder supernatant.Fjern rørene fra stativet og tilsett 150 mikroliter med forvarmet streng vaskebuffer med grundig blanding for å fullstendig gjenbruke perlene som tar vare på å unngå bobler. Plasser rørene tilbake i den termiske cycler på 65 grader Celsius i fem minutter før du plasserer rørene tilbake på magnetstativet for å tillate perlene å helt skille fra supernativa. Kast det ubundne DNA-et som inneholder supernativa, vask perlene igjen med forvarmet streng vaskebuffer som nettopp demonstrert for totalt to strenge vasker.Etter siste vask, fjern supernatant og tilsett 150 mikroliter romtemperaturvaskbuffer en til rørene. Pipette vasken 10 til 20 ganger for å fullstendig gjenbruke perlene og inkubere prøvene med lokket forseglet i to minutter vekslende mellom vortexing i 30 sekunder og hvile i 30 sekunder. På slutten av inkubasjonen, sentrifuge kort og plasser rørene på magnetstativet og fjern supernatant når perlene har fullt festet seg til magneten.Sentrifuger rørene kort med hettene lukket og returner prøvene til magnetstativet. Bruk en 10 mikroliter pipette til å fjerne eventuelle rester vaskebuffer og legge til 150 mikroliter romtemperatur vaskebuffer to. Pipette vasken 10 til 20 ganger for å fullstendig gjenbruke perlene og inkubere prøvene med lokkene forseglet i to minutter vekslende mellom vortexing i 30 sekunder og hvile i 30 sekunder.Etter en kort sentrifugering overfører du hele volumet av perler fra hvert rør til rene kjernefrie PCR-rør og plasserer rørene på magnetstativet. Etter å ha kastet det ubundne DNA-et som inneholder supernatanter, sentrifuger prøvene igjen og bruk en 10 mikroliter pipette for å fjerne eventuelle rester vaskebuffer fra perlene mens de er i magnetstativet. Tilsett 150 mikroliter vaskebuffer tre til rørene og pipetten opp og ned 10 til 20 ganger for å fullstendig gjenbruke perlene.Inkuber røret i to minutter vekslende mellom 30 sekunder med mild vortexing og 30 sekunder hvile før kort sentrifuging. Plasser rørene på magnetstativet for å aspirere supernativa og kort sentrifugere perleprøvene igjen. Bruk en 10 mikroliter pipette til å fjerne eventuelle rester vaskebuffer fra perlene mens de er i magnetstativet før du fjerner rørene fra stativet og gjenbruker perlene i 20 mikroliter kjerner med kjernefritt vann per rør.Deretter pipette perlene 10 ganger for å sikre at eventuelle perler fast til siden av rørene har blitt resuspended. Tilstedeværelsen av adapterdydere bør evalueres for å avgjøre om ytterligere opprydding er nødvendig. Dette elektroferogrammet viser for eksempel et akseptabelt nivå av adapterdedder som vises som en skarp topp rundt 128 basispar, mens dette elektroferogrammet viser et uakseptabelt nivå av adapterdned.Immunprofilene før og etter behandling kan brukes til å forstå effekten av en bestemt behandling på tumormikromiljøet som i denne representative analysen hvor endringene i prosent for hver immuncelle av interesse og det totale immuninnholdet vises før og etter kjemoterapi for en enkelt pasient. I denne analysen ble prøver mellom pasientgrupper sammenlignet i henhold til deres tid til sykdomsprogresjon etter behandling. En undergruppe av pasientene viste tilbakefall av sykdommen etter 18 måneder, mens en annen undergruppe utviklet seg raskere i 18 eller færre måneder.Median deltaverdi kan deretter sammenlignes for hver prøve for å identifisere antatte biomarkører for sykdomsprogresjon. For eksempel, her ble to immunfluktgener identifisert som statistisk signifikante differensiere av prøvegrupperingene. Fordi de enkelte genbiomarkørene var robuste med klar statistisk signifikans, tilføyde ikke den flerdimensjonale biomarkøren betydelig prediktiv verdi.Pass på å utføre de oppvarmede vasker en stripe om gangen for å hindre prøvekjøling og husk å overføre perlene til friske rør for å unngå off-target forurensning. Denne protokollen demonstrerer bruk av genuttrykksmodeller for å kvantifisere immunceller og tumorvev. Nye modeller utvikles for å måle cellestater som utmattelse eller aktivering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funksjonelle Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av fettvev immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissekere medfødte immunsignalisering i Viral Evasion av cytokinproduksion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...