Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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Os autores desejam reconhecer o TriStar Technology Group por fornecer os espécimes biológicos para os resultados representativos, bem como toda a equipe molecular, análise, produto e comercial da Cofactor Genomics para sua experiência técnica e Apoio.

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	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Todos os autores são empregados pela Cofactor Genomics, Inc., empresa que desenvolveu e produz o kit de reagente ImunoPrism e ferramentas de informática utilizadas neste artigo. O Ensaio ImunoPrism é apenas para uso de pesquisa, e não é para uso em procedimentos diagnósticos.

O protocolo requer RNA intacto ou 40 ng altamente degradado (FFPE). A amostra de RNA deve ser livre de DNA, sais (por exemplo, Mg2+, ou sais de guanidinium), agentes de cisão divalente (por exemplo, EDTA, EGTA, citrato) ou orgânicos (por exemplo, fenol e etanol). Não é recomendável prosseguir com amostras de RNA que tenham um DV200 <20%. O uso do RNA de controle em kit é fortemente recomendado, pois esses controles fornecem um meio de avaliar o desempenho em todo o protocolo, desde a preparação da biblioteca até a análise.
O protocolo foi projetado para ser executado usando tubos de tira PCR de 0,2 mL. Se preferir, o protocolo também pode ser realizado usando os poços em uma placa PCR de 96 poços. Basta usar os poços de uma placa PCR de 96 poços no lugar de todas as referências a tubos PCR ou tubos de tira. Use placas PCR apenas com poços claros, pois é fundamental confirmar visualmente a resuspensão completa das contas durante purificações de contas e etapas de lavagem.
Ao longo do protocolo, mantenha os reagentes congelados ou no gelo, a menos que seja especificado de outra forma. Não use reagentes até que fiquem completamente descongelados. Certifique-se de misturar completamente todos os reagentes antes do uso.
Mantenha enzimas em -20 °C até que estejam prontas para uso e retornem a -20 °C prontamente após o uso. Use apenas água livre de nuclease de grau molecular; não é recomendável usar água tratada com DEPC. Ao se misturar, gentilmente aspira e dispense pelo menos 50% do volume total até que as soluções sejam bem misturadas. Pipette mistura todas as misturas mestres contendo enzimas. Usar vórtice para misturar as enzimas pode levar à desnaturação e comprometer seu desempenho. Durante a purificação de bico, o uso fez soluções de etanol de 80% de etanol de grau molecular. O uso de soluções de etanol que não são frescas pode resultar em rendimentos mais baixos. Evite secar as contas, pois isso pode reduzir a eficiência de elusão (as contas parecem rachadas se mais secas).
Como descrito na Etapa 10, primers de índice exclusivos são adicionados a cada reação. Com base nas sequências desses índices, para multiplexação de baixo nível, certas combinações de índice são ótimas. As sequências desses índices são necessárias para desmultiplear os dados após o sequenciamento. As sequências e combinações multiplexantes recomendadas são fornecidas na Tabela Suplementar 3. Nesta mesma etapa, é importante notar que o número de ciclos PCR recomendados varia dependendo da qualidade do RNA utilizado e, alguma otimização pode ser necessária para evitar a superamplificação do PCR. Para o RNA do Controle Intacto imunoprism e outros RNA de alta qualidade, inicie a otimização com 10 ciclos pcr. Para o RNA de Controle ImmunoPrism FFPE e outros RNA altamente degradados/FFPE, inicie a otimização com 15 ciclos pcr. Recomenda-se produzir uma biblioteca de testes utilizando rna representante do material a ser analisado, a fim de otimizar os ciclos de PCR. O número mínimo de ciclos PCR que consistentemente produzem rendimentos suficientes da biblioteca pré-captura (>200 ng) deve ser usado. Um pico secundário em torno de 1000 bp no traço bioanalisador é indicativo de superamplificação(Figura 4). A superamplificação deve ser minimizada, mas a presença de um pequeno pico secundário não interferirá nos resultados do ensaio.
Para minimizar a perda de amostras e evitar a troca de tubos, o Passo 13 pode ser realizado em tubos PCR, tubos de tira ou uma placa PCR de 96 poços em vez de microtubos de 1,5 mL, se o seu concentrador de vácuo permitir. O rotor pode ser removido em muitos concentradores. Isso permite que os tubos de tira ou placas se encaixem no vácuo. A concentração de vácuo pode então ser executada usando o ajuste de dessecação aquoso sem centrífuga. Consulte o manual para obter instruções sobre o seu concentrador de vácuo. Se as amostras forem secas em tubos de tira ou uma placa de 96 poços, a etapa de hibridização pode ser realizada no mesmo vaso.
Durante a Etapa 17, certifique-se de vórtice a cada 10-12 min para aumentar a eficiência de captura de esferas. Segure cuidadosamente as tampas dos tubos de tira quente ao misturar para evitar que os tubos abram.
As lavadeiras descritas na Etapa 18 são fundamentais para evitar alta contaminação não específica e devem ser seguidas de perto. Certifique-se de suspender completamente as contas a cada lavagem, remover completamente os buffers de lavagem e durante a lavagem do Tampão de Lavagem 2, transfira as amostras para um tubo de tira fresco (Passo 18.6.5). Certifique-se de que as contas de streptavidin estão completamente suspensas e permaneçam suspensas durante toda a incubação. Espirrar nas tampas do tubo não afetará negativamente a captura. Durante as lavas de temperatura ambiente, uma misturador de vórtice microplacapode ser usada para vórtice simindo as amostras durante todo o período de incubação de dois minutos para uma resuspensão mais fácil. Não deixe as contas streptavidin secarem. Se necessário, estender incubações nos buffers para evitar a secagem das contas. Se usar mais de um tubo de tira, trabalhe com um tubo de tira de cada vez para cada lavagem enquanto os outros tubos de tira se sentam no termociclo. Isso pode ajudar a evitar a secagem das contas ou a pressa, resultando em má resuspensão ou outras técnicas sub-ideais. Pela primeira vez, os usuários não são recomendados processar mais de 8 reações da biblioteca por vez.
As técnicas atuais de perfil imunológico fornecem um contínuo de informações - de milhares de pontos de dados que requerem interpretação significativa (sequenciamento de RNA) a um ponto de dados individual e discreto (IHC monoplex). O protocolo descrito aqui representa uma abordagem que está em algum lugar no meio, com um escopo focado permitindo alta sensibilidade, mas capturando apenas um subconjunto de dados transcritômicos clinicamente relevantes. Devido à natureza da extração de RNA a granel, este protocolo não fornece informações sobre as relações espaciais entre células imunes e o microambiente tumoral, no entanto, os resultados podem ser complementados com tecnologias de imagem para adicionar essas informações. Há uma miríade de aplicações para os dados gerados por este protocolo, pois há muito a ser aprendido sobre a biologia do câncer como uma doença, e as terapias que estão sendo desenvolvidas para tratá-lo. Como mostrado nos resultados representativos, o relatório imunológico individual é útil para entender como o perfil imunológico do paciente pode mudar em resposta a eventos como progressão da doença ou tratamento. Embora os resultados aqui apresentados forneçam alguns casos de uso de exemplo, outras aplicações, incluindo a investigação do mecanismo de ação de uma terapia e a identificação de biomarcadores putativos de desfechos clínicos, como a progressão livre e a sobrevivência geral também são Prático. Ao utilizar este protocolo para aplicações de descoberta de biomarcadores, é importante praticar um bom projeto de estudo para garantir que as populações homogêneas sejam analisadas, amostras suficientes sejam incluídas para poder estatístico e fontes de viés sejam consideradas. Devido à natureza focada e simplificada do ensaio, é viável imaginar um caminho para a validação clínica e a aplicação a jusante desses biomarcadores uma vez descobertos.

Quantificação de linfócitos infiltrados em tumores (TILs) e outras moléculas relacionadas à imunológica em amostras de tecido humano de tumor fixo e parafina (FFPE) demonstrou valor na pesquisa clínica1,2,3. Técnicas comuns como citometria de fluxo e sequenciamento de ácido ribonucleico de célula única (RNA) são úteis para tecido fresco e sangue4,mas são inadequadas para análise de materiais ffpe devido à incapacidade de criar suspensões celulares viáveis. Os métodos atuais que têm sido usados para quantificar essas células no tecido FFPE sofrem de grandes desafios. Imunohistoquímica (IHC) e outros fluxos de trabalho semelhantes de imagem requerem anticorpos específicos para detectar proteínas de superfície celular, o que pode ser difícil de padronizar entre laboratórios para permitir quantificação reprodutível5. Plataformas como o sistema nCounter dependem da expressão de genes únicos para definir as principais células imunes6,limitando a sensibilidade e especificidade da detecção. Métodos mais genéricos de sequenciamento de RNA, aliados a ferramentas de software autônomos, estão disponíveis, mas requerem otimização e validação significativas antes do uso7,8,9,10,11,12. Os recentes avanços na combinação de microdissecção de captura a laser (LCM) com sequenciamento de RNA para tecido FFPE mostraram-se promissores; no entanto, uma solução de ponta e turnkey é necessária para estudos translacionais destinados a identificar biomarcadores robustos13,14. Métodos para gerar biomarcadores multidimensionais, como modelagem imunológica preditiva, que definem coortes de pacientes, incluindo atendentes de terapia, subtipos de câncer ou desfechos de sobrevivência com alta precisão preditiva e significância estatística estão se tornando cada vez mais importantes na era da medicina de precisão e imunoterapia15,16.
Para atender a essa necessidade, um ensaio imunológico de perfil foi desenvolvido para permitir quantificação sensível e específica de células imunes em tecido ffpe tumorsólido usando reagentes padronizados de sequenciamento de RNA e informática baseada em nuvem. Além de acomodar RNA degradado do tecido FFPE, o protocolo é capaz de acomodar RNA derivado de amostras de tecido limitante, como biópsias de agulhas principais, aspiradores de agulhas e tecido micro ou macrodissecado. Os dados de RNA de cada amostra são comparados a um banco de dados de modelos de expressão genética de células imunes, chamados modelos imunológicos de expressão da saúde, para quantificar células imunes como uma porcentagem do total de células presentes na amostra. Resumidamente, esses modelos foram construídos usando métodos de aprendizagem de máquina para identificar padrões exclusivos de expressão multigênica de dados de transcrição total gerados a partir de populações de células imunes purificadas (isoladas usando marcadores canônicos de superfície celular)17,18. Os Modelos multidimensionais de expressão em saúde subjacentes à tecnologia permitem que o ensaio quantifique cada célula imune como um por cento do total de células presentes na mistura heterogêneo. Isso permite ao pesquisador gerar comparações de células imunes inter e intraamostrais, que têm mostrado ter valor clínico19,20. Outras aplicações incluem quantificação da resposta imune pré e pós-tratamento, como descrito nos resultados representativos. O ensaio relata múltiplas características de contextura imunológica do microambiente tumoral e tumoral, incluindo os percentuais absolutos de oito tipos de células imunes (derivados de modelos de expressão genética): células CD4+ T, células CD8+ T, células CD56+ Natural Killer, células CD19+ B, CD14+ monocytes, Tregs, macrófagos M1phag e macrófagos M2. Além disso, o ensaio relata a expressão (em transcrições por milhão, ou TPM) de dez genes de fuga imunológica: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 e ARG1.
O kit de reagente é usado para fazer bibliotecas de alta qualidade prontas para sequenciamento em uma plataforma illumina seguindo um método híbrido de preparação de biblioteca susceptífica de captura, como mostrado na Figura 1. Se um pesquisador não tiver uma plataforma de sequenciamento illumina em seu laboratório, eles podem submeter suas amostras a um laboratório central para sequenciamento. Uma vez gerados, os dados de sequenciamento são enviados ao Portal Prisma para análise automatizada, e um perfil abrangente e quantitativo para cada amostra individual, a forma do Relatório Imunológico (Figura 2A),é devolvido ao usuário. Os usuários também podem definir agrupamentos amostrais no Portal Prisma para gerar um Relatório Biomarcador (Figura 2B),destacando biomarcadores estatisticamente significativos que distinguem duas coortes de pacientes. É importante ressaltar que os dados gerados pelo kit de reagente são apenas para uso de pesquisa e não podem ser utilizados para fins diagnósticos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho. Neste protocolo, o RNA é convertido pela primeira vez em cDNA. Os adaptadores de sequenciamento são ligados, e o CDNA adaptador é amplificado e codificado pelo PCR para criar uma biblioteca de pré-captura. As sondas biotinyuladas são então hibrificadas para alvos específicos de CDNA que são então capturados usando contas de streptavidina. CDNA não-direcionado sem limites é removido lavando. Um enriquecimento final do PCR rende uma biblioteca pós-captura pronta para sequenciamento. *O RNA total deve ser de amostras humanas; pode estar intacto ou degradado RNA (FFPE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figura 2: Relatórios imunológicos representativos. O fluxo de trabalho gera dois relatórios, um relatório imunológico individual (A) para cada amostra processada, e um relatório biomarcador(B)para coortes de pacientes definidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
O protocolo requer aproximadamente 16 h de tempo de preparação (do RNA total às bibliotecas prontas para sequenciamento); no entanto, há uma série de pontos de parada opcionais, como observado no protocolo. O ensaio faz uso da rica natureza dinâmica da transcriptômica para ir além de biomarcadores legados de analito para modelos multidimensionais de expressão genética, permitindo assim caracterização biológica abrangente de amostras de tecido com padronização reagentes e ferramentas de software fáceis de usar. Ele capacita os pesquisadores a utilizar uma tecnologia contemporânea em seu próprio laboratório, aproveitando o aprendizado de máquina e um banco de dados de Modelos de Expressão em Saúde para derivar perfis imunológicos mais precisos e quantitativos de amostras clínicas preciosas e descobrir Biomarcadores rna multidimensionais com análise estatística completa.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Imunoterápicos mostram promessa no tratamento de pacientes oncológicos, mas a heterogeneidade complexa do microambiente tumoral torna a previsão de resposta ao tratamento desafiadora. A capacidade de resolver as populações relativas de células imunes presentes dentro e ao redor do tecido tumoral tem se mostrado clinicamente relevante para entender a resposta, mas é limitada por técnicas tradicionais como citometria de fluxo e imunohistoquímica ( O IHC), devido à grande quantidade de tecido necessário, à falta de marcadores precisos do tipo celular e muitos obstáculos técnicos e logísticos. Um ensaio (por exemplo, o ImmunoPrism Immune Perfil Assay) supera esses desafios acomodando pequenas quantidades de RNA e RNA altamente degradada, características comuns de RNA extraídos de tecido tumorado sólido clinicamente arquivado. O ensaio é acessado através de um kit de reagente e informática baseada em nuvem que fornece uma solução de perfil imunológico quantitativo de ponta a ponta para plataformas de sequenciamento illumina. Os pesquisadores começam com apenas duas seções de tecido formalinado parafina -embedded (FFPE) ou 20-40 ng de RNA total (dependendo da qualidade da amostra), e o protocolo gera um relatório de perfil imunológico quantificando oito tipos de células imunes e dez de escape imunológica genes, capturando uma visão completa do microambiente tumoral. Nenhuma análise bioinformática adicional é necessária para fazer uso dos dados resultantes. Com as coortes amostrais apropriadas, o protocolo também pode ser usado para identificar biomarcadores estatisticamente significativos dentro de uma população de interesse do paciente.

Há uma série de pontos de verificação em todo o protocolo que permitem ao usuário avaliar a qualidade e quantidade de materiais gerados. Após o Passo 12 descrito no protocolo, um eletropherograma é gerado como mostrado na Figura 3, representante de uma típica biblioteca de pré-captura para uma amostra de RNA intacta (RIN = 7,8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Figura 3: Típico rastreamento bioanalisador da biblioteca de pré-captura para uma amostra de RNA intacta. Bibliotecas de pré-captura aparecem como um pico amplo em torno de 250-400 pares de base (bp) em tamanho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Deve-se tomar cuidado para evitar a superamplificação, como indicado pelo segundo pico em torno de 1.000 bp mostrado na Figura 4, um eletropedorgrama representativo de uma biblioteca de pré-captura gerada a partir de uma amostra de RNA FFPE (DV200 = 46). Se esse pico for pequeno em relação ao pico principal (cerca de 250-400 pares de base (bp), como mostrado), ele não interferirá com etapas ou análises a jusante. Se o segundo pico for grande em relação ao pico de 250-400 bp, a biblioteca de pré-captura pode ser refeita com menos ciclos pcr, a fim de reduzir a superamplificação.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Figura 4: Típico rastreamento bioanalisador da biblioteca de pré-captura para uma amostra de RNA FFPE. O segundo pico em torno de 1.000 bp é indicativo de excesso de amplificação. Se esse pico for pequeno em relação ao pico principal em torno de 250-400 bp (como mostrado), ele não interferirá com etapas ou análises a jusante. Se o segundo pico for grande em relação ao pico de 250-400 bp, a biblioteca de pré-captura pode ser refeita com menos ciclos pcr, a fim de reduzir a amplificação excessiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Conforme descrito na Etapa 12.1.3, a presença de dimers adaptadores deve ser avaliada para determinar se é necessária uma limpeza adicional. Os eletropherogramas mostrados na Figura 5 são representativos de níveis inaceitáveis (Figura 5A,DV200 = 33) e aceitáveis (Figura 5B,DV200 = 46) de dimer adaptador, aparecendo como o pico acentuado em torno de 128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Figura 5: Traços bioanalisadores da biblioteca de pré-captura. O dimer adaptador aparece como um pico acentuado em torno de 128 bp.(A) Os dimers adaptadores excessivos estão presentes neste eletropherograma. (B)Níveis aceitáveis de dimer adaptador são retratados neste traço. Ambos os traços mostram evidências de leve superamplificação, mas isso não deve interferir com o Ensaio ImunoPrism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Na conclusão do protocolo, antes do sequenciamento, as bibliotecas finais são novamente avaliadas por meio de eletroforese digital. Bibliotecas feitas de RNA FFPE tendem a ter uma distribuição de tamanho médio menor do que bibliotecas feitas de RNA intacta. Para amostras intactas de RNA, o traço resultante deve ser semelhante à Figura 6 (RIN = 9,5). Para RNA degradado ou FFPE, o traço resultante deve ser semelhante ao Figura 7 (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figura 6: Típico rastreamento bioanalisador da Biblioteca Final para uma amostra de RNA intacta. Bibliotecas finais aparecem como um pico amplo em torno de 250-400 pares de base (bp) em tamanho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Figura 7: Típico rastreamento bioanalisador da Biblioteca Final para uma amostra de RNA FFPE. Bibliotecas feitas de RNA FFPE tendem a ter uma distribuição de tamanho médio menor do que bibliotecas feitas de RNA intacta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Como descrito, os resultados gerados com este protocolo podem ser aplicados de duas formas-chave, como mostra a Figura 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Figura 8: Dois casos de uso do protocolo. Os resultados gerados por este ensaio de perfil imunológico são aplicados em duas aplicações translacionais importantes. (A) O primeiro caso de uso começa a partir de tecido tumoral sólido humano (incluindo arquivos FFPE) e gera um perfil imunológico individual para a amostra. (B) Uma vez gerados para uma coorte de amostras humanas, os dados são combinados usando o Portal Prisma para gerar um Biomarcador multidimensional e um Relatório Biomarcador correspondente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Para demonstrar cada um desses casos de uso, os dados representativos de um pequeno estudo translacional estão incluídos21. As amostras utilizadas neste estudo são um conjunto de espécimes de 7 pacientes diagnosticados e tratados para câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). As amostras são tecido tumorais sólidos compatível com pacientes de biópsias pré e pós-tratamento. Primeiro, amostras individuais foram analisadas para gerar um perfil imunológico, como o relatório de exemplo mostrado na Figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figura 9: Exemplo relatório imunológico individual para uma amostra NSCLC. O oleoduto Do Portal Prisma gera um relatório gráfico para cada amostra processada, com um relatório representativo gerado para uma amostra de tumor sólido NSCLC mostrada aqui. (A) A parte frontal do relatório retrata graficamente a quebra das células imunes presentes na amostra de RNA extraída do tecido FFPE. (B) O lado inverso do relatório inclui uma tabela de células imunes (em percentuais absolutos) e a expressão genética de fuga (em transcrições por milhão, ou TPM), bem como uma declaração de desempenho para o ensaio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Os perfis imunológicos pré e pós-tratamento podem ser usados para entender como uma terapia (quimioterapia ou radiação, neste estudo) modificou o microambiente tumoral. Um exemplo é mostrado na Figura 10,onde as mudanças na porcentagem para cada célula imune e conteúdo imunológico total são mostradas pré e pós-quimioterapia, para um único paciente.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figura 10: Exemplo resultados pré e pós-tratamento. São mostrados dados individuais de células imunes e conteúdo imunológico total gerados a partir de amostras pré e pós-tratamento de um único paciente nsclc. Neste exemplo, o paciente recebeu um regime de quimioterapia como tratamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Os pacientes podem ser agrupados por critérios como desfechos clínicos ou fenótipos para comparação. Por exemplo, na Figura 11,as amostras do estudo do NSCLC foram comparadas de acordo com o tempo à progressão da doença após o tratamento. Um subconjunto dos pacientes apresentou recidiva da doença em >18 meses, e outro subconjunto progrediu mais rápido, em ≤18 meses. O valor delta mediano (diferença entre valores pré e pós-tratamento) é comparado para cada amostra para identificar biomarcadores putativos da progressão da doença.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figura 11: Exemplo comparação de desfechoclínico. Foram calculadas alterações quantitativas entre os percentuais das células imunes em amostras de NSCLC pré e pós-tratamento combinadas e relatadas como o valor "delta". Os destacados em amarelo mostram claras mudanças de sinal entre o status de sobrevivência. As barras azuis representam valores delta medianos por >18 meses até a progressão da doença, as barras laranjas representam valores delta medianos por ≤18 meses até a progressão da doença. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Finalmente, agrupamentos de amostras semelhantes podem ser usados para olhar especificamente para amostras de pré-tratamento para identificar biomarcadores preditivos usando o Portal Prisma para gerar um Relatório Biomarcador. Mostrado na Figura 12, o mesmo fenótipo clínico (progressão da doença) descrito acima define os agrupamentos amostrais. Neste exemplo, dois genes de fuga imunológica foram identificados como diferenciais estatisticamente significativos dos agrupamentos amostrais (CD47 e OX40, mostrados no painel inferior da Figura 12A). Neste exemplo, como os biomarcadores genéticos individuais são robustos com significância estatística clara, o biomarcador multidimensional não agrega valor preditivo significativo (ImmunoPrism, como rotulado no gráfico de barras superior direito da Figura 12B). A tabela completa de dados, incluindo resultados para todos os 18 analytes para o ensaio, é resumida no lado inverso do relatório, incluindo análise estatística e um breve resumo de métodos.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Figura 12: Relatório biomarcador de exemplo para amostras nsclc. O gasoduto Biomarker Discovery fornece um relatório visual de biomarcadores individuais e um biomarcador multidimensional de aprendizagem de máquina, com estatísticas detalhadas. (A) Para este estudo, o gasoduto identificou dois biomarcadores individuais (CD47 e OX40) como estatisticamente significativos para a definição da progressão da doença com um limite de 18 meses. (B)Detalhes sobre o método e resultados completos estão incluídos no lado inverso do relatório. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
Mesa Suplementar 1: Materiais de Kit de Reagente. Uma lista de materiais fornecidos no Kit ImunoPrism está listada, juntamente com os números de peça que se referiram no protocolo do fabricante. Todos os outros equipamentos e materiais necessários estão listados na Tabela de Materiais. Visite <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> para folhas de dados de segurança (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).</a>
Mesa Suplementar 2: Programas de Ciclor Térmico. Os programas de ciclovia recomendados referenciados ao longo do protocolo são resumidos para facilitar a programação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).</a>
Tabela Suplementar 3: Guia do Índice de Sequenciamento. Os primers de índice fornecidos no kit de reagente estão listados; uma cartilha única é adicionada a cada reação para desmultipleagem pós-seqüencial. Combinações recomendadas de multipleexamento de baixo nível também são fornecidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para ver este arquivo (Clique certo para baixar).</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

O uso de uma abordagem baseada em RNA para determinar perfis imunológicos quantitativos de tecidos tumorais sólidos e aproveitar coortes clínicas para a descoberta de biomarcadores imuno-oncologia é descrito através de protocolos moleculares e informativos.

Modelagem imunológica preditiva de tumores sólidos

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Caracterizar integralmente o microambiente tumoral é essencial na pesquisa de imuno-oncologia. Este ensaio é o primeiro a usar modelos de expressão de saúde baseados em RNA para medir células imunes em tecido tumoral sólido. Este ensaio permite que os pesquisadores obtenham medidas altamente sensíveis e específicas do contexto imunológico nos tecidos tumorais sólidos da FFB e combinem esses resultados em um biomarcador multidimensional.Todos os tratamentos contra o câncer, não apenas imunoterápicos, provocam uma resposta imune no local do tumor sólido. Medir essa resposta imune é importante para entender a progressão da doença e as respostas terapêuticas. Este protocolo combina técnicas tradicionais de preparação da biblioteca RNA com captura direcionada.Embora demorado, seguir as etapas de lavagem e monitorar os pontos de verificação de controle de qualidade, como sugerido, é muito importante para o sucesso. Para RNA altamente degradado de amostras incorporadas de parafina fixas formalina, monte a primeira reação de síntese de fios no gelo de acordo com a tabela. Misture minuciosamente as reações ao subir e descer várias vezes antes de girar brevemente as amostras em um microcentrifuuge.No final da centrifugação, coloque imediatamente as amostras em um cicloviário térmico pré-aquecido seguindo o programa número três da tabela. Para RNA intacto de alta qualidade, monte a primeira reação de síntese de fios no gelo em um tubo PCR sem nuclease, conforme descrito nas tabelas. Para iniciar este procedimento, misture 200 nanogramas da biblioteca de interesse com dois microgramas de DNA COT-1 e dois microliters de oligos de bloqueio em um tubo PCR sem nuclease.Em seguida, use um concentrador de vácuo definido de 30 a 45 graus Celsius para secar o conteúdo do tubo. Após a hibridização, remova as amostras do ciclor térmico e ajuste o cicloviário térmico para incubar a 65 graus Celsius com a tampa aquecida definida para 70 graus Celsius. Use uma pipeta multicanal para transferir 17 microliters de contas totalmente homogeneizadas para as amostras e pipeta completamente para cima e para baixo 10 vezes.Para vincular o DNA às contas, coloque os tubos no cicloviário térmico seguindo o programa 10 removendo brevemente os tubos despojados a cada 10 a 12 minutos por três segundos de vórtice suave para manter as contas resuspended. Imediatamente após a incubação de ligação, remova uma tira de tubos do ciclor térmico e adicione 100 microliters de tampão de lavagem pré-aquecido um aos tubos. Pipeta completamente para cima e para baixo 10 vezes e colocar os tubos em um rack magnético para permitir que as contas se separem totalmente da solução de lavagem antes de aspirar o DNA desvinculado contendo supernante.Remova os tubos do rack e adicione 150 microliters de tampão de lavagem rigoroso pré-aquecido com uma mistura completa para resuspencar completamente as contas tomando cuidado para evitar bolhas. Coloque os tubos de volta no cicloviário térmico a 65 graus Celsius por cinco minutos antes de colocar os tubos de volta no rack magnético para permitir que as contas se separem totalmente dos supernantes. Descarte o DNA desvinculado contendo supernacantes, lave as contas mais uma vez com tampão de lavagem rigoroso pré-aquecido, como apenas demonstrado para um total de duas lavagens rigorosas.Após a última lavagem, remova o supernascer e adicione 150 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente um aos tubos. Pipeta a lavagem 10 a 20 vezes para resususpensar completamente as contas e incubar as amostras com a tampa selada por dois minutos alternando entre o vórtice por 30 segundos e descansando por 30 segundos. No final da incubação, centrífuga brevemente e coloque os tubos no rack magnético e remova o sobrenante uma vez que as contas tenham aderido totalmente ao ímã.Centrifugar os tubos brevemente com as tampas fechadas e devolver as amostras ao rack magnético. Use uma pipeta de 10 microliteres para remover qualquer tampão de lavagem residual e adicione 150 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente dois. Pipeta a lavagem 10 a 20 vezes para resususpensar completamente as contas e incubar as amostras com as tampas seladas por dois minutos alternando entre o vórtice por 30 segundos e descansando por 30 segundos.Após uma breve centrifugação, transfira todo o volume de contas de cada tubo para tubos PCR limpos sem nuclease e coloque os tubos no rack magnético. Depois de descartar o DNA desvinculado contendo supernantes, centrifugar brevemente as amostras novamente e usar uma pipeta de 10 microliteres para remover qualquer tampão de lavagem residual das contas enquanto elas estão no rack magnético. Adicione 150 microliters de tampão de lavagem três aos tubos e pipeta para cima e para baixo 10 a 20 vezes para resuspensar completamente as contas.Incubar o tubo por dois minutos alternando entre 30 segundos de vórtice suave e 30 segundos de descanso antes de centrifugar brevemente. Coloque os tubos sobre o rack magnético para aspirar os supernantes e centrifugar brevemente as amostras de contas novamente. Use uma pipeta de 10 microliteres para remover qualquer tampão de lavagem residual das contas enquanto elas estiverem no rack magnético antes de remover os tubos do rack e reutilizar as contas em 20 microlitrais de água sem nuclease por tubo.Em seguida, pipeta as contas 10 vezes para garantir que quaisquer contas presas ao lado dos tubos foram resuspended. A presença de dimers adaptadores deve ser avaliada para determinar se a limpeza adicional é necessária. Por exemplo, este eletroferograma mostra um nível aceitável de adaptador dimer que aparece como um pico acentuado em torno de 128 pares de base, enquanto este eletroferograma mostra um nível inaceitável de adaptador dimer.Os perfis imunológicos pré e pós-tratamento podem ser usados para entender os efeitos de uma terapia específica no microambiente tumoral como nesta análise representativa para a qual as mudanças em percentual para cada célula imune de interesse e o conteúdo imunológico total são mostradas pré e pós-quimioterapia para um único paciente. Nesta análise, as amostras entre grupos de pacientes foram comparadas de acordo com o tempo de progressão da doença após o tratamento. Um subconjunto dos pacientes apresentou recidiva da doença após 18 meses, enquanto outro subconjunto progrediu mais rápido em 18 ou menos meses.O valor delta mediano poderia então ser comparado para cada amostra para identificar biomarcadores putativos da progressão da doença. Por exemplo, aqui dois genes de fuga imune foram identificados como diferenciais estatisticamente significativos dos agrupamentos amostrais. Como os biomarcadores genéticos individuais eram robustos com clara significância estatística, o biomarcador multidimensional não asse um valor preditivo significativo.Certifique-se de realizar as lavagens aquecidas uma tira de cada vez para evitar o resfriamento da amostra e lembre-se de transferir as contas para tubos frescos para evitar contaminação fora do alvo. Este protocolo demonstra o uso de modelos de expressão genética para quantificar células imunes e tecido tumoral. Novos modelos estão sendo desenvolvidos para medir estados celulares, como exaustão ou ativação.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Imunologia e Infecção

Seven Steps to Stellate Cells

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissecando imunitário inatas Sinalização em Evasion Viral da produção de citocinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...