Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить TriStar Technology Group за предоставление биологических образцов для репрезентативных результатов, а также всей молекулярной, аналитической, продуктовой и коммерческой групп в Cofactor Genomics за их техническую экспертизу и Поддержки.

<ol>
	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Все авторы работают в Cofactor Genomics, Inc., компания, которая разработала и производит набор реагентов ImmunoPrism и информационные инструменты, используемые в этой статье. ImmunoPrism Assay предназначен только для использования в научных исследованиях и не предназначен для использования в диагностических процедурах.

Протокол требует 20 нг нетронутыми или 40 нг сильно деградированных (FFPE) РНК. Образец РНК должен быть не состоит из ДНК, солей (например, Mg2 "или солей гуанидиниума), дивантовых хелатных агентов катиона (например, EDTA, EGTA, цитрат), или органики (например, фенол и этанол). Не рекомендуется продолжать с рнк-образцам, которые имеют DV200 lt;20%. Настоятельно рекомендуется использовать РНК управления в комплекте, поскольку эти элементы управления обеспечивают средства для оценки производительности на протяжении всего протокола, от подготовки библиотеки до анализа.
Протокол предназначен для выполнения с использованием 0,2 мл ПЦР полосы труб. Если предпочтительнее, протокол также может быть выполнен с использованием скважин в 96-колодец ПЦР пластины. Просто используйте скважины 96-колодец ПЦР пластины вместо всех ссылок на ПЦР труб или полосы труб. Используйте ПЦР пластинтолько с четкими скважинами только, так как важно визуально подтвердить полное повторное повторное приостановление бисера во время очистки бисера и мыть шаги.
На протяжении всего протокола держите реагенты замороженными или на льду, если не указано иное. Не используйте реагенты до тех пор, пока они полностью не оттаяют. Обязательно тщательно перемешайте все реагенты перед использованием.
Держите ферменты при -20 градусов до готовности к использованию и быстро присугивая прим. Используйте только молекулярно-классовую безкакую воду; не рекомендуется использовать очищенную от DEPC воду. При смешивании трубач, аккуратно аспирировать и распределять не менее 50% от общего объема до тех пор, пока растворы не будут хорошо смешаны. Пипетка смешивают все мастер-миксы, содержащие ферменты. Использование вихря для смешивания ферментов может привести к денатурации и поставить под угрозу их производительность. Во время очистки биса, используйте свежеприготовленные 80% этилового раствора из этанола молекулярного сорта. Использование этих растворов, которые не являются свежими может привести к снижению урожайности. Избегайте более сушки бисера, так как это может уменьшить эффективность elution (бусы выглядят трещинами, если более сушеные).
Как описано в шаге 10, к каждой реакции добавляются уникальные индексные грунтовки. На основе последовательностей этих индексов, для мультиплексирования низкого уровня, определенные комбинации индексов являются оптимальными. Последовательности этих индексов необходимы для демультипантиксирования данных после секвенирования. Последовательности и рекомендуемые комбинации мультиплексирования приведены в дополнительной таблице 3. На этом же этапе важно отметить, что количество рекомендуемых циклов ПЦР варьируется в зависимости от качества используемой РНК, и для предотвращения чрезмерного усиления ПЦР может потребоваться определенная оптимизация. Для ImmunoPrism Intact Control РНК и других высококачественных РНК, начать оптимизацию с 10 циклов ПЦР. Для ImmunoPrism FFPE Управления РНК и других сильно деградированных / FFPE РНК, начать оптимизацию с 15 циклов ПЦР. Рекомендуется создание тестовой библиотеки с использованием РНК-представителя материала для анализа в целях оптимизации циклов ПЦР. Минимальное количество циклов ПЦР, которые последовательно дают достаточные выходы библиотеки предварительного захвата (Nogt;200 ng) должны быть использованы. Вторичный пик около 1000 bp на следе Bioanalyzer свидетельствует о чрезмерном усилении(рисунок 4). Чрезмерное усиление должно быть сведено к минимуму, но наличие небольшого вторичного пика не помешает результатам асссе.
Чтобы свести к минимуму потерю образца и избежать переключения труб, Шаг 13 может быть выполнен в ПЦР труб, полосы труб, или 96-хорошо ПЦР пластины вместо 1,5 мл микротруб, если ваш вакуумный концентратор позволяет. Ротор может быть удален на многих концентраторов. Это позволяет полоски труб или пластин, чтобы поместиться в вакууме. Концентрация вакуума может быть запущена с использованием aqueous desiccation настройки без центрифугации. Проконсультируйтесь с руководством для вашего вакуумного концентратора для получения инструкций. Если образцы высохли в полост-трубках или 96-колодцевой пластине, этап гибридизации может быть выполнен в одном сосуде.
Во время шага 17, не забудьте вихрь каждые 10-12 минут, чтобы увеличить эффективность захвата биса. Тщательно держите колпачки теплых полосок труб при смешивании, чтобы предотвратить трубы от открытия.
Ямы, описанные в шаге 18, имеют решающее значение для предотвращения высокого неспецифического загрязнения и должны внимательно следить за ним. Не забудьте полностью приложить бисер на каждой стирке, полностью удалить буферы для мытья, а во время мытья буфера 2 мыть, перенесите образцы на свежую полоску трубки (Шаг 18.6.5). Убедитесь, что стрептавидин бисер полностью перепбитива и остаются в подвеске в течение всего инкубации. Брызги на трубчатые колпачки не окажут негативного влияния на захват. Во время комнатной температуры моет, микроплита вихрь смеситель может быть использован для вихря образцов для всего двухминутного инкубационного периода для облегчения повторного подвески. Не дайте стрептавидинбид бисер высохнуть. При необходимости расширьте инкубации в буферах, чтобы избежать высыхания бисера. При использовании более чем одной полосы трубки, работать с одной полосой трубки в то время, для каждой стирки в то время как другие полосы трубки сидят в термоцикле. Это может помочь избежать более сушки бисера или торопится, в результате чего бедные повторного действия или других суб-оптимальных методов. Впервые пользователям не рекомендуется обрабатывать более 8 реакций библиотеки одновременно.
Современные методы иммунного профилирования обеспечивают континуум информации - от тысяч точек данных, которые требуют значительной интерпретации (секвенирование РНК) до отдельной точки данных (одноместный IHC). Описанный здесь протокол представляет собой подход, который находится где-то посередине, с сфокусированным объемом, позволяющим высокой чувствительности, но захватив только подмножество клинически значимых транскриптомических данных. Из-за характера объемной экстракции РНК, этот протокол не предоставляет информацию о пространственных отношениях между иммунными клетками и микроокружением опухоли, однако, результаты могут быть дополнены технологиями визуализации, чтобы добавить эту информацию. Есть множество приложений для данных, генерируемых этим протоколом, как есть много можно узнать о биологии рака как болезни, и терапии разрабатываются для его лечения. Как показано в репрезентативных результатах, индивидуальный иммунный отчет полезен для понимания того, как иммунный профиль пациента может меняться в ответ на такие события, как прогрессирование болезни или лечение. В то время как результаты, представленные здесь, дают некоторые примеры случаев использования, другие приложения, включая изучение механизма действия терапии и выявление исходов для лечения, таких как прогрессирование и общее выживание, также Практические. При использовании этого протокола для применения биомаркеров для обнаружения биомаркеров важно практиковать надых для анализа однородных популяций, включены достаточные образцы для статистической силы и рассматриваются источники предвзятости. Из-за целенаправленного, обтекаемого характера исследования, можно представить себе путь к клинической проверки и вниз по течению применения этих биомаркеров после открытия.

Количественная оценка опухолевых лимфоцитов (TILs) и других молекул, связанных с иммунитетом, в формалино-фиксированных и парафинвстроенных (FFPE) твердых образцов опухоли человеческой ткани продемонстрировала ценность в клинических исследованиях1,2,3. Общие методы, такие как поток цитометрии и одноклеточных рибонуклеиновой кислоты (РНК) секвенирования полезны для свежей ткани и крови4, но не подходят для анализа материалов FFPE из-за невозможности создать жизнеспособные суспензии клеток. Современные методы, которые были использованы для количественной оценки этих клеток в ткани FFPE страдают от серьезных проблем. Иммуногистохимия (IHC) и другие подобные рабочие процессы изображений требуют специфических антител для обнаружения белков поверхности клеток, которые могут быть трудно стандартизировать в лабораториях, чтобы воспроизводимая количественная количественная оценка5. Такие платформы, как система nCounter, полагаются на экспрессию отдельных генов для определения ключевых иммунных клеток6,ограничивая чувствительность и специфичность обнаружения. Более общие методы секвенирования РНК, в сочетании с автономными программными средствами, доступны, но требуют значительной оптимизации и проверки до использования7,8,9,10,11,12. Последние достижения в сочетании микродиссекции лазерного захвата (LCM) с РНК секвенирования для ткани FFPE показал обещание; однако, более высокой пропускной, под ключ решение требуется для трансляционных исследований, направленных на выявление надежных биомаркеров13,14. Методы генерации многомерных биомаркеров, таких как прогностическое иммуномоделирование, которые определяют когорты пациентов, включая терапевтические ответчики, подтипы рака или результаты выживания с высокой прогностической точностью и статистической значимостью, становятся все более важными в эпоху точной медицины и иммунотерапии15,16.
Для удовлетворения этой потребности, иммунный профилирования анализ был разработан для обеспечения чувствительной и конкретной количественной оценки иммунных клеток в твердой ткани опухоли FFPE с использованием стандартизированных РНК-секвенирующих реагентов и облачной информатики. В дополнение к размещению деградированной РНК из ткани FFPE, протокол способен разместить РНК, полученных из ограничивающих образцов тканей, таких как биопсия основных игл, аспиратии иглы, и микро- или макро-расчлененные ткани. Данные РНК из каждого образца сравнивают с базой данных моделей экспрессии генов иммунных клеток, называемых иммунными моделями экспрессии здоровья, для количественной оценки иммунных клеток в процентах от общего числа клеток, присутствующих в выборке. Кратко, эти модели были построены с использованием машинного обучения методы для выявления уникальных многогенных моделей выражения из всего транскриптома данных, полученных из очищенных популяций иммунных клеток (изолированы с помощью канонических маркеров клеток поверхности)17,18. Многомерные модели выражения здоровья, лежащие в основе технологии, позволяют количественно йенеиммунным клеткам в процентах от общего числа клеток, присутствующих в неоднородной смеси. Это позволяет исследователю генерировать меж- и внутри-образец сравнений иммунных клеток, которые, как было показано, имеют клиническое значение19,20. Другие приложения включают количественную оценку иммунного ответа до и после лечения, как описано в репрезентативных результатах. Анализ сообщает о множественных особенностях иммунной контельтекстуры опухоли и микроокружения опухоли, включая абсолютный процент восьми типов иммунных клеток (производных от моделей экспрессии генов): CD4и Т-клетки, CD8и Т-клетки, CD56, CD19и B-клетки, CD14- моноциты, Tregs, макрофаги M1 и M2 макрофаги. Кроме того, в ассе сообщается о выражении (в транскриптах на миллион, или TPM) десяти генов иммунного побега: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 и ARG1.
Набор реагентов используется для обеспечения готовности библиотек высокого качества к секвенированию на платформе Illumina в соответствии с гибридным методом подготовки библиотеки на основе захвата, как показано на рисунке 1. Если исследователь не имеет платформы секвенирования Illumina в своей лаборатории, они могут представить свои образцы в основную лабораторию для секвенирования. После сгенерирования данные секвенирования загружаются на портал Prism для автоматизированного анализа, а всеобъемлющий количественный профиль для каждого отдельного образца в виде Иммунного отчета(рисунок 2А)возвращается пользователю. Пользователи могут также определить группы выборки в prism Portal для создания Biomarker Report(рисунок 2B),подчеркивая статистически значимые биомаркеры, которые различают две когорты пациентов. Важно отметить, что данные, генерируемые набором реагентов, предназначены только для использования в исследованиях и не могут использоваться в диагностических целях.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Рисунок 1: Обзор рабочего процесса. В этом протоколе РНК сначала преобразуется в кДНК. Секвенирование адаптеров ligated, и адаптер-ligated cDNA усиливается и штрих-кодпируется ПЦР для создания библиотеки предварительного захвата. Биотинилатированные зонды затем гибридизируются с конкретными целями кДНК, которые затем захватываются с помощью стрептавидина. Несвязанная, нецелевая кДНК удаляется путем стирки. Окончательное обогащение PCR дает библиотеку после захвата, готовую к секвенированию. «Общая РНК должна быть из образцов человека; может быть нетронутой или деградиромой (FFPE) РНК. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Рисунок 2: Представитель иммунных отчетов. Рабочий процесс генерирует два отчета, индивидуальный иммунный отчет(A) для каждого обработанного образца, и отчет о биомаркерах(B) для определенных когорты пациентов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Протокол требует примерно 16 ч времени подготовки (от общей РНК до библиотек, готовых к секвенированию); однако, как отмечено в протоколе, существует ряд дополнительных остановочных пунктов. Анализ использует богатый, динамичный характер транскриптомики, чтобы выйти за рамки устаревших одноанализных биомаркеров к многомерным моделям экспрессии генов, тем самым позволяя всеобъемлющую биологическую характеристику образцов тканей со стандартизированными реагенты и простые в использовании программные средства. Это дает исследователям возможность использовать современные технологии в своей собственной лаборатории, используя машинное обучение и базу данных моделей экспрессии здоровья, чтобы получить более точные, количественные иммунные профили драгоценных клинических образцов, и обнаружить многомерные биомаркеры РНК с полным статистическим анализом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Иммунотерапия показывает перспективность в лечении онкологических больных, но сложная неоднородность микроокружения опухоли делает прогнозирование ответна на лечение сложной задачей. Способность решать относительные популяции иммунных клеток, присутствующих в опухолевой ткани и вокруг нее, как было показано, клинически-отречена к пониманию реакции, но ограничена традиционными методами, такими как цитометрия потока и иммуногистохимия ( IHC), из-за большого количества ткани требуется, отсутствие точных маркеров типа клеток, и многие технические и материально-технические препятствия. Один анализ (например, иммуноприризм иммунопрофилирования Анализ) преодолевает эти проблемы путем размещения как небольшое количество РНК и сильно деградировали РНК, общие черты РНК, извлеченные из клинически архивированных твердой ткани опухоли. Анализ доступен через набор реагентов и облачную информатику, которая обеспечивает сквозное количественное, высокое разрешение иммуно-профилирования для платформ секвенирования Illumina. Исследователи начинают с всего лишь двух разделов формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) ткани или 20-40 нг общего РНК (в зависимости от качества образца), и протокол генерирует иммунный профиль доклад количественно восемь типов иммунных клеток и десять иммунных побега генов, захватывая полное представление о микроокружении опухоли. Для использования полученных данных не требуется никакого дополнительного биоинформатического анализа. При наличии соответствующих выборочных когорт протокол может также использоваться для определения статистически значимых биомаркеров в группе пациентов, представляющих интерес.

Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Использование РНК-подхода для определения количественных иммунных профилей твердых опухолевых тканей и использования клинических когорт для открытия биомаркеров иммунной онкологии описывается с помощью молекулярных и информационных протоколов.

Прогностическое иммунное моделирование твердых опухолей

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Всеобъемлющая характеристика микроокноронности опухоли имеет важное значение в иммуноонкологии исследований. Этот анализ является первым использовать РНК на основе моделей выражения здоровья для измерения иммунных клеток в твердой опухолевой ткани. Этот анализ позволяет исследователям получить очень чувствительные и специфические измерения иммунного контекста в твердых опухолевых тканях FFB и объединить эти результаты в многомерный биомаркер.Все методы лечения рака, а не только иммунотерапии, вызывают иммунный ответ в месте твердой опухоли. Измерение этого иммунного ответа имеет важное значение для понимания прогрессирования заболевания и реакции терапии. Этот протокол сочетает в себе традиционные методы подготовки библиотеки РНК с целевым захватом.В то время как много времени, после мытья шаги и мониторинг контроля качества контрольно-пропускных пунктов, как это предлагается, очень важно для успеха. Для сильно деградированной РНК из формалин-фиксированных парафин встроенных образцов, собрать первую реакцию синтеза нити на льду в соответствии с таблицей. Тщательно смешать реакции, трубя вверх и вниз несколько раз, прежде чем кратко спиннинг вниз образцов в микроцентрифуге.В конце центрифуги немедленно поместите образцы в разогретый тепловой циклер по программе номер три со стола. Для высококачественной нетронутой РНК, собрать первую реакцию синтеза нити на льду в нуклеазной ПЦР трубки, как указано в таблицах. Чтобы начать эту процедуру, смешайте 200 нанограммов библиотеки штрих-кодов, представляющих интерес, с двумя микрограммами ДНК COT-1 и двумя микролитровами блокирующих олиго в нуклеазной трубке ПЦР.Затем используйте вакуумный концентратор, установленный на 30-45 градусов по Цельсию, чтобы высушить содержимое трубки. После гибридизации удалите образцы из теплового цикла и установите тепловой циклер для инкубации при 65 градусах Цельсия с нагретой крышкой, установленной до 70 градусов по Цельсию. Используйте многоканальный пипетку для передачи 17 микролитров полностью однородных бусин в образцы и пипетку вверх и вниз в 10 раз.Чтобы связать ДНК с бисером, поместите трубки в тепловой циклер после программы 10 кратко удаления раздели трубки каждые 10 до 12 минут в течение трех секунд нежный вихрь держать бисер повторно. Сразу же после переплета инкубации снимите одну полоску трубок с теплотрассы и добавьте 100 микролитров разогретого буфера для мытья в трубы. Pipette тщательно вверх и вниз 10 раз и поместите трубки на магнитной стойке, чтобы бисер полностью отделиться от раствора мытья, прежде чем аспирировать несъегодные ДНК, содержащие супернатант.Удалите трубки из стойки и добавить 150 микролитров разогретого строгого буфера мытья с тщательной смешивания, чтобы полностью повторно бусинки заботиться, чтобы избежать пузырьков. Поместите трубки обратно в тепловой циклер при 65 градусах по Цельсию в течение пяти минут, прежде чем поместить трубки обратно на магнитную стойку, чтобы бусы полностью отделились от супернатантов. Отбросьте несъединую ДНК, содержащую супернатанты, мыть бисер еще раз с разогретым строгим буфером мытья, как только что продемонстрировано в общей сложности два строгих моет.После последней стирки снимите супернатант и добавьте в трубки 150 микролитров буфера комнатной температуры. Pipette мыть от 10 до 20 раз, чтобы полностью повторно использовать бисер и инкубировать образцы с крышкой запечатаны в течение двух минут чередующихся между вихрем в течение 30 секунд и отдыха в течение 30 секунд. В конце инкубации, центрифуга кратко и поместите трубки на магнитной стойке и удалить супернатант, как только бисер полностью прилип к магниту.Центрифуга труб кратко с крышками закрыты и вернуть образцы в магнитной стойке. Используйте 10 микролитровый пипетку, чтобы удалить любой остаточный буфер мытья и добавить 150 микролитров буфера мытья комнатной температуры два. Pipette мыть от 10 до 20 раз, чтобы полностью повторно beads и инкубировать образцы с крышками запечатаны в течение двух минут чередующихся между вихрем в течение 30 секунд и отдыха в течение 30 секунд.После краткой центрифугации перенесите весь объем бисера из каждой трубки в чистые трубы ПЦР без ядра и поместите трубки на магнитную стойку. После отбрасывания несъегодной ДНК, содержащей супернатанты, кратко центрифуга образцов снова и использовать 10 микролитер пипетки для удаления любого остаточного буфера мытья из бисера, пока они находятся в магнитной стойке. Добавьте 150 микролитров буфера мытья три к трубам и пипетке вверх и вниз от 10 до 20 раз, чтобы полностью повторно использовать бисер.Инкубировать трубку в течение двух минут чередующихся между 30 секунд нежной вихревой и 30 секунд отдыха, прежде чем кратко центрифугирования. Поместите трубки на магнитную стойку, чтобы аспирировать супернатанты и кратко центрифугировать образцы бисера снова. Используйте 10 микролитровую пипетку, чтобы удалить любой остаточный буфер мытья из бисера, пока они находятся в магнитной стойке, прежде чем удалить трубки из стойки и повторного использования бисера в 20 микролитров нуклеазной воды на трубку.Затем пипетки бусы 10 раз, чтобы убедиться, что любые бусы застряли в сторону труб были повторно. Наличие адаптера димеры должны быть оценены, чтобы определить, если дополнительная очистка необходима. Например, эта электроферограмма показывает приемлемый уровень адаптера димер, который появляется как резкий пик около 128 базовых пар в то время как эта электроферограмма показывает неприемлемый уровень адаптера димер.Иммунные профили до и после лечения могут быть использованы для понимания влияния конкретной терапии на микросреду опухоли, как в этом репрезентативном анализе, для которого изменения в процентном соотношении для каждой иммунной клетки, представляющие интерес и общее содержание иммунной показаны до и после химиотерапии для одного пациента. В этом анализе образцы между группами пациентов сравнивались в зависимости от их времени до прогрессирования заболевания после лечения. Подмножество пациентов показали рецидив заболевания после 18 месяцев, в то время как другой подмножество прогрессировал быстрее в 18 или менее месяцев.Затем среднее значение дельты можно сравнить по каждому образцу для выявления если идентифицировать биохимические знаки прогрессирования заболевания. Например, здесь два гена иммунного побега были определены как статистически значимые юбилиаторы групп образцов. Поскольку отдельные биомаркеры генов были надежными с четкой статистической значимостью, многомерный биомаркер не добавлял значительного прогностический значение.Будьте уверены, чтобы выполнить подогревом моет одну полоску в то время, чтобы предотвратить охлаждение образца и не забудьте передать бисер в свежие трубки, чтобы избежать внецелевых загрязнения. Этот протокол демонстрирует использование моделей экспрессии генов для количественной оценки иммунных клеток и опухолевых тканей. Разрабатываются новые модели для измерения состояния клеток, такие как истощение или активация.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Измерение кальпаин деятельности в фиксированных и живых клеток методом проточной цитометрии

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Выделение функциональных сердечно иммунных клеток

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Прижизненное Визуализация Мышь Thymus использованием 2-Фотон микроскопии

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Изоляция жировой ткани иммунных клеток

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Пройдя врожденной иммунной Сигнализация в Вирусный Уклонение продукция цитокинов

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...