Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
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Los autores desean reconocer a TriStar Technology Group por proporcionar los especímenes biológicos para los resultados representativos, así como a todos los equipos moleculares, de análisis, productos y comerciales de Cofactor Genomics por su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia técnica y su experiencia Apoyo.

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	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Todos los autores son empleados por Cofactor Genomics, Inc., la empresa que desarrolló y produce el kit de reactivos ImmunoPrism y las herramientas informáticas utilizadas en este artículo. El ensayo ImmunoPrism es solo para uso de investigación y no se utiliza en procedimientos de diagnóstico.

El protocolo requiere 20 ng intacto o 40 ng de ARN altamente degradado (FFPE). La muestra de ARN debe estar libre de ADN, sales (por ejemplo, Mg2+o sales de guanidinio), agentes quelantes de cationes divalentes (por ejemplo, EDTA, EGTA, citrato) o orgánicos (por ejemplo, fenol y etanol). No se recomienda proceder con muestras de ARN que tengan un DV200 <20%. Se recomienda encarecidamente el uso del ARN de control en el kit, ya que estos controles proporcionan un medio para evaluar el rendimiento a lo largo de todo el protocolo, desde la preparación de la biblioteca hasta el análisis.
El protocolo está diseñado para realizarse utilizando tubos de tira PCR de 0,2 ml. Si se prefiere, el protocolo también se puede realizar utilizando los pozos en una placa PCR de 96 pocillos. Simplemente utilice los pozos de una placa PCR de 96 pocillos en lugar de todas las referencias a tubos PCR o tubos de tiras. Utilice placas PCR con pozos claros solamente, ya que es fundamental confirmar visualmente la resuspensión completa de perlas durante las purificaciones de perlas y los pasos de lavado.
A lo largo del protocolo, mantenga los reactivos congelados o en hielo a menos que se especifique lo contrario. No utilice reactivos hasta que estén completamente desconlos. Asegúrese de mezclar a fondo todos los reactivos antes de su uso.
Mantener las enzimas a -20 oC hasta que estén listas para su uso y vuelva a -20 oC inmediatamente después de su uso. Utilice únicamente agua libre de nucleasas de grado molecular; no se recomienda el uso de agua tratada con DEPC. Cuando pipetee para mezclar, aspire suavemente y dispensar al menos el 50% del volumen total hasta que las soluciones estén bien mezcladas. Mezcla de pipetas todas las mezclas maestras que contienen enzimas. El uso de vórtice para mezclar las enzimas podría conducir a la desnaturalización y comprometer su rendimiento. Durante las purificaciones de cuentas, utilice soluciones de etanol al 80% recién hechas a partir de etanol de grado molecular. El uso de soluciones de etanol que no son frescas puede resultar en rendimientos más bajos. Evite secar en exceso las perlas, ya que esto puede reducir la eficiencia de la elución (las perlas se ven agrietadas si se secan en exceso).
Como se describe en el paso 10, se agregan imprimaciones de índice únicas a cada reacción. Según las secuencias de estos índices, para la multiplexación de bajo nivel, ciertas combinaciones de índices son óptimas. Las secuencias de estos índices son necesarias para desmultiplexar los datos posteriores a la secuenciación. Las secuencias y las combinaciones de multiplexación recomendadas se proporcionan en la Tabla Suplementaria 3. En este mismo paso, es importante tener en cuenta que el número de ciclos de PCR recomendados varía dependiendo de la calidad del ARN utilizado, y, alguna optimización puede ser necesaria para prevenir la sobreamplificación de PCR. Para el ARN de control intacto de InmunoPrism y otro ARN de alta calidad, inicie la optimización con 10 ciclos de PCR. Para el ARN de control de InmunoPrism FFPE y otro ARN altamente degradado/FFPE, inicie la optimización con 15 ciclos de PCR. Se recomienda producir una biblioteca de pruebas utilizando ARN representativo del material a analizar para optimizar los ciclos de PCR. Se debe utilizar el número mínimo de ciclos de PCR que producen consistentemente suficientes rendimientos de la biblioteca de captura previa (>200 ng). Un pico secundario alrededor de 1000 bp en la traza del bioanalizador es indicativo de sobreamplificación(Figura 4). Se debe minimizar la sobreamplificación, pero la presencia de un pequeño pico secundario no interferirá con los resultados del ensayo.
Para minimizar la pérdida de muestray evitar la conmutación de tubos, el paso 13 se puede realizar en tubos pcR, tubos de tiras o una placa PCR de 96 pocillos en lugar de microtubos de 1,5 ml, si el concentrador de vacío lo permite. El rotor se puede quitar en muchos concentradores. Esto permite que los tubos o placas de tiras quepan en el vacío. La concentración de vacío se puede ejecutar utilizando el ajuste de desecación acuosa sin centrifugación. Consulte el manual de su concentrador de vacío para obtener instrucciones. Si las muestras se secan en tubos de tiras o en una placa de 96 pocillos, el paso de hibridación se puede realizar en el mismo recipiente.
Durante el paso 17, asegúrese de vórtice cada 10-12 minutos para aumentar la eficiencia de captura de cuentas. Sujete cuidadosamente las tapas de los tubos de tiras calientes cuando mezcle para evitar que los tubos se abran.
Los lavados descritos en el paso 18 son críticos para evitar una alta contaminación inespecífica y deben seguirse de cerca. Asegúrese de resuspender completamente las perlas en cada lavado, retire completamente los tampón de lavado y, durante el lavado Wash Buffer 2, transfiera las muestras a un tubo de tira nuevo (Paso 18.6.5). Asegúrese de que las perlas de estreptavidina estén completamente resuspendidas y permanezcan en suspensión durante toda la incubación. Salpicaduras en las tapas del tubo no afectará negativamente a la captura. Durante los lavados a temperatura ambiente, se puede utilizar un mezclador de vórtice de microplaca para vórtice las muestras durante la totalidad del período de incubación de dos minutos para facilitar la resuspensión. No deje que las cuentas de estreptavidina se sequen. Si es necesario, extienda las incubaciones en los tampones para evitar el secado de las cuentas. Si utiliza más de un tubo de tira, trabaje con un tubo de tira a la vez para cada lavado mientras los otros tubos de tiras se sentan en el termociclador. Esto puede ayudar a evitar el secado excesivo de las perlas o la prisa, lo que resulta en una resuspensión deficiente u otras técnicas subóptimas. Para los usuarios por primera vez, no se recomienda procesar más de 8 reacciones de biblioteca a la vez.
Las técnicas actuales de perfiles inmunes proporcionan un continuo de información, desde miles de puntos de datos que requieren una interpretación significativa (secuenciación de ARN) hasta un punto de datos discreto individual (IHC de un solo plex). El protocolo descrito aquí representa un enfoque que está en algún lugar en el medio, con un alcance enfocado que permite una alta sensibilidad, pero capturando sólo un subconjunto de datos transcriptomicos clínicamente relevantes. Debido a la naturaleza de la extracción masiva de ARN, este protocolo no proporciona información sobre las relaciones espaciales entre las células inmunitarias y el microambiente tumoral, sin embargo, los resultados pueden complementarse con tecnologías de imágenes para agregar esta información. Hay un sinfín de aplicaciones para los datos generados por este protocolo, ya que hay mucho que aprender sobre la biología del cáncer como enfermedad, y las terapias que se están desarrollando para tratarlo. Como se muestra en los resultados representativos, el informe inmune individual es útil para entender cómo el perfil inmune de un paciente puede cambiar en respuesta a eventos como la progresión de la enfermedad o el tratamiento. Si bien los resultados presentados aquí proporcionan algunos casos de uso de ejemplo, otras aplicaciones como investigar el mecanismo de acción de una terapia y la identificación de biomarcadores putativos de resultados clínicos como la progresión libre y la supervivencia global también son Práctico. Cuando se utiliza este protocolo para aplicaciones de descubrimiento de biomarcadores, es importante practicar un buen diseño de estudio para garantizar que se analicen las poblaciones homogéneas, se incluyan muestras suficientes para la potencia estadística y se consideren fuentes de sesgo. Debido a la naturaleza centrada y aerodinámica del ensayo, es factible imaginar un camino hacia la validación clínica y la aplicación posterior de estos biomarcadores una vez descubiertos.

La cuantificación de linfocitos tumorales infiltrantes (TIL) y otras moléculas relacionadas con el sistema inmunitario en muestras de tejido humano sólido con incrustación de formalina y parafina (FFPE) ha demostrado valor en la investigación clínica1,2,3. Las técnicas comunes como la citometría de flujo y la secuenciación de ácido ribonucleico de una sola célula (ARN) son útiles para el tejido fresco y la sangre4,pero no son adecuadas para el análisis de materiales FFPE debido a la incapacidad para crear suspensiones celulares viables. Los métodos actuales que se han utilizado para cuantificar estas células en el tejido FFPE sufren de grandes desafíos. La inmunohistoquímica (IHC) y otros flujos de trabajo de imágenes similares requieren anticuerpos específicos para detectar proteínas de superficie celular, que pueden ser difíciles de estandarizar entre laboratorios para permitir la cuantificación reproducible5. Plataformas como el sistema nCounter se basan en la expresión de genes únicos para definir células inmunitarias clave6,limitando la sensibilidad y la especificidad de la detección. Los métodos de secuenciación de ARN más genéricos, junto con las herramientas de software independientes, están disponibles, pero requieren una optimización y validación significativas antes de utilizar7,8,9,10,11,12. Los avances recientes en la combinación de microdisección de captura láser (LCM) con secuenciación de ARN para el tejido FFPE han demostrado ser prometedores; sin embargo, se requiere una solución llave en mano más de alto rendimiento para los estudios traslacionales destinados a identificar biomarcadores robustos13,14. Los métodos para generar biomarcadores multidimensionales, como el modelado inmune predictivo, que definen las cohortes de pacientes, incluidos los respondedores de terapia, los subtipos de cáncer o los resultados de supervivencia con alta precisión predictiva y significación estadística, son cada vez más importantes en la era de la medicina de precisión y la inmunoterapia15,16.
Para hacer frente a esta necesidad, se desarrolló un ensayo de perfiles inmunes para permitir la cuantificación sensible y específica de las células inmunitarias en el tejido FFPE tumoral sólido utilizando reactivos estandarizados de secuenciación de ARN e informática basada en la nube. Además de acomodar el ARN degradado del tejido FFPE, el protocolo es capaz de acomodar el ARN derivado de muestras de tejido limitantes, como biopsias de agujas de núcleo, aspiradores de agujas y tejido micro diseccionado o macrodiseccionado. Los datos de ARN de cada muestra se comparan con una base de datos de modelos de expresión génica de células inmunitarias, llamados modelos de expresión de salud inmune, para cuantificar las células inmunitarias como un porcentaje del total de células presentes en la muestra. En resumen, estos modelos se construyeron utilizando métodos de aprendizaje automático para identificar patrones de expresión multigénicos únicos a partir de datos de transcriptoma completo generados a partir de poblaciones de células inmunitarias purificadas (aisladas mediante marcadores canónicos de superficie celular)17,18. Los modelos multidimensionales de expresión de la salud subyacentes a la tecnología permiten al ensayo cuantificar cada célula inmune como un porcentaje del total de células presentes en la mezcla heterogénea. Esto permite al investigador generar comparaciones entre células intravenales e intramuestras, que han demostrado tener un valor clínico19,20. Otras aplicaciones incluyen la cuantificación de la respuesta inmune antes y después del tratamiento, como se describe en los resultados representativos. El ensayo informa sobre múltiples características de la contextura inmune del tumor y el microambiente tumoral, incluidos los porcentajes absolutos de ocho tipos de células inmunitarias (derivados de modelos de expresión génica): células CD4+ T, células CD8+ T, CÉLULAs CD56+ Natural Killer, células CD19+ B, CD14+ monocitos, Tregs, macrófagos M1 y macrófagos M2. Además, el ensayo informa de la expresión (en transcripciones por millón, o TPM) de diez genes de escape inmune: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 y ARG1.
El kit de reactivos se utiliza para preparar las bibliotecas de alta calidad para la secuenciación en una plataforma Illumina siguiendo un método híbrido de preparación de bibliotecas basada en captura, como se muestra en la Figura 1. Si un investigador no tiene una plataforma de secuenciación de Illumina en su laboratorio, puede enviar sus muestras a un laboratorio central para la secuenciación. Una vez generados, los datos de secuenciación se cargan en Prism Portal para el análisis automatizado, y se devuelve al usuario un perfil completo y cuantitativo para cada muestra individual, en forma de Informe Inmune(Figura 2A). Los usuarios también pueden definir agrupaciones de muestras en el Portal Prism para generar un Informe de Biomarcador(Figura 2B),destacando biomarcadores estadísticamente significativos que distinguen a dos cohortes de pacientes. Es importante destacar que los datos generados por el kit de reactivos son solo para uso de investigación y no se pueden utilizar con fines de diagnóstico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Figura 1: Información general sobre el flujo de trabajo. En este protocolo, el ARN se convierte primero en ADNr. Los adaptadores de secuenciación están ligados, y el ADNc con ligadura de adaptadores es amplificado y con código de barras por PCR para crear una biblioteca de captura previa. Las sondas biotinylated se hibridan a objetivos específicos de ADNc que luego se capturan usando cuentas de estreptavidina. El lavado no está enlazado y no objetivo. Un enriquecimiento final de PCR produce una biblioteca posterior a la captura lista para la secuenciación. *El ARN total debe ser de muestras humanas; puede estar intacto o degradado (FFPE) ARN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figura 2: Informes inmunes representativos. El flujo de trabajo genera dos informes, un informe inmune individual (A) para cada muestra procesada y un informe de biomarcador (B) para cohortes de pacientes definidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El protocolo requiere aproximadamente 16 horas de tiempo de preparación (desde el ARN total hasta las bibliotecas listas para la secuenciación); sin embargo, hay una serie de puntos de parada opcionales, como se indica en el protocolo. El ensayo hace uso de la naturaleza rica y dinámica de la transcriptomica para ir más allá de biomarcadores de analito único heredados a modelos de expresión génica multidimensional, permitiendo así una caracterización biológica integral de muestras de tejidos con estandarizado reactivos y herramientas de software fáciles de usar. Permite a los investigadores utilizar una tecnología contemporánea en su propio laboratorio, aprovechando el aprendizaje automático y una base de datos de modelos de expresión sanitaria para obtener perfiles inmunes más precisos y cuantitativos de muestras clínicas preciosas, y descubrir biomarcadores de ARN multidimensionales con análisis estadístico completo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Las inmunoterapias son prometedoras en el tratamiento de pacientes oncológicos, pero la heterogeneidad compleja del microambiente tumoral hace que la predicción de la respuesta al tratamiento sea un reto. Se ha demostrado que la capacidad de resolver las poblaciones relativas de células inmunitarias presentes en el tejido tumoral y sus alrededores es clínicamente relevante para entender la respuesta, pero está limitada por técnicas tradicionales como la citometría de flujo y la inmunohistoquímica ( IHC), debido a la gran cantidad de tejido requerido, la falta de marcadores de tipo celular precisos, y muchos obstáculos técnicos y logísticos. Un ensayo (por ejemplo, el ensayo de perfiles inmunes de ImmunoPrism) supera estos desafíos al acomodar tanto pequeñas cantidades de ARN como ARN altamente degradado, características comunes del ARN extraído del tejido tumoral sólido clínicamente archivado. Se accede al ensayo a través de un kit de reactivos y una informática basada en la nube que proporciona una solución de inmunoperfiles cuantitativa de extremo a extremo y de alto rendimiento para plataformas de secuenciación de Illumina. Los investigadores comienzan con tan sólo dos secciones de tejido de parafina incrustada en parafina fija (FFPE) o 20-40 ng de ARN total (dependiendo de la calidad de la muestra), y el protocolo genera un informe de perfil inmune que cuantifica ocho tipos de células inmunitarias y diez de escape inmune genes, capturando una visión completa del microambiente tumoral. No se requiere ningún análisis bioinformático adicional para hacer uso de los datos resultantes. Con las cohortes de muestra apropiadas, el protocolo también puede utilizarse para identificar biomarcadores estadísticamente significativos dentro de una población de pacientes de interés.

Hay una serie de puntos de control a lo largo del protocolo que permiten al usuario evaluar la calidad y la cantidad de materiales generados. Siguiendo el paso 12 descrito en el protocolo, se genera un electroferograma como se muestra en la Figura 3,representativa de una biblioteca de precaptura típica para una muestra de ARN intacta (RIN n.o 7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Figura 3: Seguimiento típico del bioanalizador de la biblioteca de precaptura para una muestra de ARN intacta. Las bibliotecas de captura previa aparecen como un pico amplio alrededor de 250-400 pares de bases (bp) de tamaño. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se debe tener cuidado de evitar la sobreamplificación, como se indica en el segundo pico alrededor de 1.000 bp que se muestra en la Figura 4, un electroferograma representativo de una biblioteca de precaptura generada a partir de una muestra de ARN FFPE (DV200 a 46). Si este pico es pequeño en relación con el pico principal (alrededor de 250-400 pares base (bp), como se muestra), no interferirá con los pasos o análisis descendentes. Si el segundo pico es grande en relación con el pico de 250-400 bp, la biblioteca de pre-captura se puede rehacer con menos ciclos de PCR para reducir la sobreamplificación.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Figura 4: Seguimiento típico del bioanalizador de la biblioteca de captura previa para una muestra de ARN FFPE. El segundo pico alrededor de 1.000 bp es indicativo de sobreamplificación. Si este pico es pequeño en relación con el pico principal alrededor de 250-400 bp (como se muestra), no interferirá con los pasos o análisis aguas abajo. Si el segundo pico es grande en relación con el pico de 250-400 bp, la biblioteca de pre-captura se puede rehacer con menos ciclos de PCR para reducir la sobreamplificación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Como se describe en el paso 12.1.3, se debe evaluar la presencia de atenuadores de adaptador para determinar si es necesaria una limpieza adicional. Los electroferogramas que se muestran en la Figura 5 son representativos de los niveles inaceptables(Figura 5A, DV200 a 33) y aceptables(Figura 5B, DV200 x 46) de dimer adaptador, que aparecen como el pico agudo alrededor de 128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Figura 5: Seguimientos de bioanalyzer de la biblioteca de captura previa. El dimer del adaptador aparece como un pico agudo alrededor de 128 bp. (A) Los atenuadores de adaptador excesivo están presentes en este electroferograma. (B) Los niveles aceptables del dimer del adaptador se representan en este seguimiento. Ambas trazas muestran evidencia de sobreamplificación leve, pero esto no debe interferir con el ensayo ImmunoPrism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Al finalizar el protocolo, antes de la secuenciación, las bibliotecas finales se evalúan de nuevo utilizando electroforesis digital. Las bibliotecas hechas de ARN FFPE tienden a tener una distribución de tamaño promedio más pequeña que las bibliotecas hechas de ARN intacto. Para las muestras de ARN intactas, el seguimiento resultante debe ser similar a la Figura 6 (RIN 9.5). Para el ARN degradado o FFPE, el seguimiento resultante debe ser similar a la Figura 7 (DV200 a 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figura 6: Seguimiento típico del bioanalizador de la biblioteca final para una muestra de ARN intacta. Las bibliotecas finales aparecen como un pico amplio alrededor de 250-400 pares base (bp) de tamaño. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Figura 7: Seguimiento típico del bioanalizador de la biblioteca final para una muestra de ARN FFPE. Las bibliotecas hechas de ARN FFPE tienden a tener una distribución de tamaño promedio más pequeña que las bibliotecas hechas de ARN intacto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Como se describe, los resultados generados con este protocolo se pueden aplicar de dos maneras clave, como se muestra en la Figura 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Figura 8: Dos casos de uso del protocolo. Los resultados generados por este ensayo de perfiles inmunes se aplican en dos aplicaciones traslacionales clave. (A) El primer caso de uso comienza a partir del tejido tumoral sólido humano (incluidos los archivos FFPE) y genera un perfil inmune individual para la muestra. (B) Una vez generados para una cohorte de muestras humanas, los datos se combinan utilizando el Portal Prism para generar un biomarcador multidimensional y el correspondiente Informe de Biomarcador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para demostrar cada uno de estos casos de uso, se incluyen datos representativos de un pequeño estudio traslacional21. Las muestras utilizadas en este estudio son un conjunto de muestras de 7 pacientes diagnosticados y tratados para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Las muestras son tejido tumoral sólido emparejado con el paciente de biopsias previas y posteriores al tratamiento. En primer lugar, se analizaron muestras individuales para generar un perfil inmune, como el informe de ejemplo que se muestra en la Figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figura 9: Ejemplo de informe inmune individual para una muestra de NSCLC. La canalización de Prism Portal genera un informe gráfico para cada muestra procesada, con un informe representativo generado para una muestra de tumor sólido NSCLC que se muestra aquí. (A) La parte frontal del informe representa gráficamente la descomposición de las células inmunitarias presentes en la muestra de ARN extraída del tejido FFPE. (B) El reverso del informe incluye una tabla de células inmunitarias (en porcentajes absolutos) y una expresión génica de escape (en transcripciones por millón, o TPM), así como una declaración de rendimiento para el ensayo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los perfiles inmunológicos pre y post-tratamiento se pueden utilizar para entender cómo una terapia (quimioterapia o radiación, en este estudio) ha modificado el microambiente tumoral. Un ejemplo se muestra en la Figura 10,donde los cambios en el porcentaje para cada célula inmune y el contenido inmune total se muestran antes y después de la quimioterapia, para un solo paciente.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figura 10: Ejemplo de resultados previos y posteriores al tratamiento. Se muestran datos individuales de células inmunitarias y contenido inmune total generados a partir de muestras previas y posteriores al tratamiento de un solo paciente de CPN. En este ejemplo, el paciente recibió un régimen de quimioterapia como tratamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los pacientes pueden agruparse por criterios como resultados clínicos o fenotipos para la comparación. Por ejemplo, en la Figura 11,las muestras del estudio NSCLC se compararon según el tiempo con la progresión de la enfermedad después del tratamiento. Un subconjunto de los pacientes mostró recurrencia de la enfermedad en >18 meses, y otro subconjunto progresó más rápido, en 18 meses. El valor delta medio (diferencia entre los valores previos y posteriores al tratamiento) se compara para cada muestra para identificar biomarcadores putativos de progresión de la enfermedad.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figura 11: Ejemplo de comparación de resultados clínicos. Los cambios cuantitativos entre los porcentajes de células inmunitarias en las muestras de NSCLC coincidentes antes y después del tratamiento se calcularon y notificaron como el valor "delta". Los resaltados en amarillo muestran cambios claros en la señal entre el estado de supervivencia. Las barras azules representan valores delta medios durante >18 meses hasta la progresión de la enfermedad, las barras naranjas representan valores delta medios durante 18 meses hasta la progresión de la enfermedad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Por último, se pueden utilizar agrupaciones de muestras similares para examinar específicamente las muestras de pretratamiento para identificar biomarcadores predictivos mediante el uso del Portal Prism para generar un informe de biomarcadores. Se muestra en la Figura 12, el mismo fenotipo clínico (progresión de la enfermedad) descrito anteriormente define las agrupaciones de muestras. En este ejemplo, dos genes de escape inmune fueron identificados como diferenciadores estadísticamente significativos de las agrupaciones de muestras (CD47 y OX40, que se muestran en el panel inferior de la Figura 12A). En este ejemplo, dado que los biomarcadores de genes individuales son robustos con una importancia estadística clara, el biomarcador multidimensional no agrega un valor predictivo significativo (ImmunoPrism, tal como se etiqueta en el gráfico de barras superior derecho de la Figura 12B). La tabla completa de datos, incluidos los resultados de los 18 analitos para el ensayo, se resume en el reverso del informe, incluido el análisis estadístico y un breve resumen de los métodos.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Figura 12: Ejemplo de informe de biomarcadorpara muestras NSCLC. La canalización Biomarker Discovery ofrece un informe visual de biomarcadores individuales y un biomarcador multidimensional de aprendizaje automático, con estadísticas detalladas. (A) Para este estudio, la canalización identificó dos biomarcadores individuales (CD47 y OX40) como estadísticamente significativos para definir la progresión de la enfermedad con un umbral de 18 meses. (B) Los detalles sobre el método y los resultados completos se incluyen en el reverso del informe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla suplementaria 1: Materiales del kit de reactivos. Se enumeran una lista de los materiales proporcionados en el kit ImmunoPrism, junto con los números de pieza a los que se hace referencia en el protocolo del fabricante. Todos los demás equipos y materiales requeridos se enumeran en la Tabla de Materiales. Visite <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> para obtener hojas de datos de seguridad (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Tabla Suplementaria 2: Programas de Ciclor Térmico. Los programas de ciclones recomendados a los que se hace referencia en todo el protocolo se resumen para facilitar la programación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Tabla complementaria 3: Guía del índice de secuenciación. Se enumeran las imprimaciones de índice proporcionadas en el kit de reactivos; se añade una imprimación única a cada reacción para la desmultiplexación posterior a la secuenciación. También se proporcionan combinaciones recomendadas de multiplexación de bajo nivel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>

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Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

El uso de un enfoque basado en ARN para determinar los perfiles inmunitarios cuantitativos de los tejidos tumorales sólidos y aprovechar las cohortes clínicas para el descubrimiento de biomarcadores de oncitología se describe a través de protocolos moleculares e informáticos.

Modelado inmune predictivo de tumores sólidos

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Caracterizar de forma exhaustiva el microambiente tumoral es esencial en la investigación inmunooncológica. Este ensayo es el primero en utilizar modelos de expresión de salud basados en ARN para medir las células inmunitarias en el tejido tumoral sólido. Este ensayo permite a los investigadores obtener mediciones muy sensibles y específicas del contexto inmune en los tejidos tumorales sólidos FFB y combinar estos resultados en un biomarcador multidimensional.Todos los tratamientos oncológicos, no sólo las inmunoterapias, provocan una respuesta inmune en el sitio del tumor sólido. La medición de esta respuesta inmunitaria es importante para comprender la progresión de la enfermedad y las respuestas terapéuticas. Este protocolo combina las técnicas tradicionales de preparación de la biblioteca de ARN con la captura dirigida.Mientras que mucho tiempo, seguir los pasos de lavado y monitorear los puntos de control de calidad como se sugiere es muy importante para el éxito. Para el ARN altamente degradado de muestras incrustadas de parafina fijada en formalina, ensamble la primera reacción de síntesis de hebra sobre hielo de acuerdo con la tabla. Mezcle a fondo las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de girar brevemente hacia abajo las muestras en una microcentrífuga.Al final de la centrifugación, coloque inmediatamente las muestras en un ciclor térmico precalentado siguiendo el programa número tres de la tabla. Para el ARN intacto de alta calidad, ensamble la primera reacción de síntesis de hebra sobre hielo en un tubo pcR libre de nucleasas como se describe en las tablas. Para comenzar este procedimiento, mezcle 200 nanogramos de la biblioteca de códigos de barras de interés con dos microgramos de ADN COT-1 y dos microlitros de oligos de bloqueo en un tubo PCR libre de nucleasas.A continuación, utilice un concentrador de vacío establecido en 30 a 45 grados Celsius para secar el contenido del tubo. Después de la hibridación, retire las muestras del ciclor térmico y ajuste el ciclor térmico para incubar a 65 grados Celsius con la tapa calentada ajustada a 70 grados celsius. Utilice una pipeta multicanal para transferir 17 microlitros de perlas totalmente homogeneizadas a las muestras y pipetas completamente arriba y abajo 10 veces.Para unir el ADN a las perlas, coloque los tubos en el ciclor térmico siguiendo el programa 10 retirando brevemente los tubos despojados cada 10 a 12 minutos durante tres segundos de vórtice suave para mantener las perlas resuspendidas. Inmediatamente después de la incubación de unión, retire una tira de tubos del ciclor térmico y agregue 100 microlitros de tampón de lavado precalentado uno a los tubos. Pipetear completamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces y coloque los tubos en un bastidor magnético para permitir que las perlas se separen completamente de la solución de lavado antes de aspirar el ADN sin ataduras que contiene sobrenadante.Retire los tubos del bastidor y agregue 150 microlitros de tampón de lavado estricto precalentado con una mezcla a fondo para resuspender completamente las perlas teniendo cuidado de evitar burbujas. Vuelva a colocar los tubos en el ciclor térmico a 65 grados Centígrados durante cinco minutos antes de volver a colocar los tubos en el bastidor magnético para permitir que las perlas se separen completamente de los sobrenadantes. Deseche el ADN sin ataduras que contiene sobrenadantes, lave las cuentas una vez más con tampón de lavado estricto precalentado como acaba de demostrar para un total de dos lavados estrictos.Después del último lavado, retire el sobrenadante y agregue 150 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente uno a los tubos. Pipetear el lavado de 10 a 20 veces para resuspender completamente las perlas e incubar las muestras con la tapa sellada durante dos minutos alternando entre el vórtice durante 30 segundos y descansando durante 30 segundos. Al final de la incubación, centrifugar brevemente y coloque los tubos en el bastidor magnético y retire el sobrenadante una vez que las perlas se hayan adherido completamente al imán.Centrifugar brevemente los tubos con las tapas cerradas y devolver las muestras al bastidor magnético. Utilice una pipeta de 10 microlitros para eliminar cualquier tampón de lavado residual y añadir 150 microlitros de la tampón de lavado a temperatura ambiente dos. Pipetear el lavado de 10 a 20 veces para resuspender completamente las perlas e incubar las muestras con las tapas selladas durante dos minutos alternando entre vórtice durante 30 segundos y descansando durante 30 segundos.Después de una breve centrifugación, transfiera todo el volumen de perlas de cada tubo a tubos PCR limpios sin nucleasas y coloque los tubos en el bastidor magnético. Después de desechar el ADN sin ataduras que contiene sobrenadantes, centrifuga brevemente las muestras de nuevo y use una pipeta de 10 microlitros para eliminar cualquier tampón de lavado residual de las perlas mientras están en el bastidor magnético. Agregue 150 microlitros de tampón de lavado tres a los tubos y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces para resuspender completamente las perlas.Incubar el tubo durante dos minutos alternando entre 30 segundos de vórtice suave y 30 segundos de descanso antes de centrifugar brevemente. Coloque los tubos en el bastidor magnético para aspirar los sobrenadantes y centrifugar brevemente las muestras de cordón de nuevo. Utilice una pipeta de 10 microlitros para eliminar cualquier tampón de lavado residual de las perlas mientras están en el bastidor magnético antes de retirar los tubos del bastidor y resuspender las perlas en 20 microlitros de agua libre de nucleasas por tubo.A continuación, pipetear las cuentas 10 veces para asegurarse de que las perlas pegadas a un lado de los tubos se han resuspendido. La presencia de dimers de adaptador debe evaluarse para determinar si es necesaria una limpieza adicional. Por ejemplo, este electroferograma muestra un nivel aceptable de dimer adaptador que aparece como un pico agudo alrededor de 128 pares base, mientras que este electroferograma muestra un nivel inaceptable de dimer adaptador.Los perfiles inmunológicos previos y posteriores al tratamiento se pueden utilizar para comprender los efectos de una terapia específica en el microambiente tumoral, como en este análisis representativo para el que los cambios en el porcentaje para cada célula inmune de interés y el contenido inmune total se muestran antes y después de la quimioterapia para un solo paciente. En este análisis, las muestras entre grupos de pacientes se compararon de acuerdo con su tiempo hasta la progresión de la enfermedad después del tratamiento. Un subconjunto de los pacientes mostró recurrencia de la enfermedad después de 18 meses, mientras que otro subconjunto progresó más rápido en 18 o menos meses.El valor medio del delta podría compararse para cada muestra para identificar biomarcadores putativos de progresión de la enfermedad. Por ejemplo, aquí dos genes de escape inmune se identificaron como diferenciadores estadísticamente significativos de las agrupaciones de muestras. Debido a que los biomarcadores genéticos individuales eran robustos con una clara significación estadística, el biomarcador multidimensional no añadía un valor predictivo significativo.Asegúrese de realizar los lavados calentados una tira a la vez para evitar el enfriamiento de la muestra y recuerde transferir las perlas a tubos frescos para evitar la contaminación fuera del objetivo. Este protocolo demuestra el uso de modelos de expresión génica para cuantificar las células inmunitarias y el tejido tumoral. Se están desarrollando nuevos modelos para medir estados celulares como el agotamiento o la activación.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Aislamiento de células inmunes funcionales cardíacos

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...