Name: predictive immune modeling of solid tumors
Uploaded: 2020-02-25T12:00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Författarna vill erkänna TriStar Technology Group för att tillhandahålla biologiska exemplar för representativa resultat, liksom hela molekylära, analys, produkt och kommersiella team på Cofactor Genomics för sin tekniska expertis och Stöd.

<ol>
	<li>Brambilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Effect+of+Tumor+Lymphocytic+Infiltration+in+Resectable+Non-Small-Cell+Lung+Cancer.">Prognostic Effect of Tumor Lymphocytic Infiltration in Resectable Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (11), 1223-1230 (2016).</li><li>Iacono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-infiltrating+lymphocytes,+programmed+death+ligand+1+and+cyclooxygenase-2+expression+in+skin+melanoma+of+elderly+patients:+clinicopathological+correlations.">Tumour-infiltrating lymphocytes, programmed death ligand 1 and cyclooxygenase-2 expression in skin melanoma of elderly patients: clinicopathological correlations.</a> Melanoma Research. 28 (6), 547-554 (2018).</li><li>Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+cancer+prognosis+and+treatment.">The immune contexture in cancer prognosis and treatment.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).</li><li>Sierant, M. C., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Sequencing+in+Cancer:+Recent+Applications+to+Immunogenomics+and+Multi-omics+Tools.">Single-Cell Sequencing in Cancer: Recent Applications to Immunogenomics and Multi-omics Tools.</a> Genomics Inform. 16, (2018).</li><li>Klauschen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+of+tumor-infiltrating+lymphocytes:+From+visual+estimation+to+machine+learning.">Scoring of tumor-infiltrating lymphocytes: From visual estimation to machine learning.</a> Seminars in Cancer Biology. 52 (Pt 2), 151-157 (2018).</li><li>Danaher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+markers+of+Tumor+Infiltrating+Leukocytes.">Gene expression markers of Tumor Infiltrating Leukocytes.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5, 18 (2017).</li><li>Aran, D., Hu, Z., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xCell:+digitally+portraying+the+tissue+cellular+heterogeneity+landscape.">xCell: digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape.</a> Genome Biology. 18 (1), 220 (2017).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+enumeration+of+cell+subsets+from+tissue+expression+profiles.">Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles.</a> Nature Methods. 12 (5), 453-457 (2015).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+population+abundance+of+tissue-infiltrating+immune+and+stromal+cell+populations+using+gene+expression.">Estimating the population abundance of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations using gene expression.</a> Genome Biology. 17 (1), 218 (2016).</li><li>Newman, A. M., Gentles, A. J., Liu, C. L., Diehn, M., Alizadeh, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+normalization+considerations+for+digital+tumor+dissection.">Data normalization considerations for digital tumor dissection.</a> Genome Biology. 18 (1), 128 (2017).</li><li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+profiling+deconvolution+approach+to+estimating+immune+cell+composition+from+complex+tissues.">A gene profiling deconvolution approach to estimating immune cell composition from complex tissues.</a> BMC Bioinformatics. 19 (Suppl 4), 154 (2018).</li><li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumour+purity+and+stromal+and+immune+cell+admixture+from+expression+data.">Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data.</a> Nature Communications. 4, 2612 (2013).</li><li>Foley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiling+of+single+cells+from+archival+tissue+with+laser-capture+microdissection+and+Smart-3SEQ.">Gene-expression profiling of single cells from archival tissue with laser-capture microdissection and Smart-3SEQ.</a> Genome Research. , (2019).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Capture+Microdissection+and+RNA-Seq+Analysis:+High+Sensitivity+Approaches+to+Explain+Histopathological+Heterogeneity+in+Human+Glioblastoma+FFPE+Archived+Tissues.">Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues.</a> Front Oncol. 9, 482 (2019).</li><li>. PD-L1 in cancer: ESMO Biomarker Factsheet | OncologyPRO Available from: <a target="_blank" href="https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer">https://oncologypro.esmo.org/Education-Library/Factsheets-on-Biomarkers/PD-L1-in-Cancer</a> (2019)</li><li>Haslam, A., Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+Percentage+of+US+Patients+With+Cancer+Who+Are+Eligible+for+and+Respond+to+Checkpoint+Inhibitor+Immunotherapy+Drugs.">Estimation of the Percentage of US Patients With Cancer Who Are Eligible for and Respond to Checkpoint Inhibitor Immunotherapy Drugs.</a> JAMA Network Open. 2 (5), e192535 (2019).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Schillebeeckx, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Performance+of+an+Immunoprofiling+Assay+Based+on+RNA+Models.+Association+for+Molecular+Pathology+2019+Annual+Meeting.">Analytical Performance of an Immunoprofiling Assay Based on RNA Models. Association for Molecular Pathology 2019 Annual Meeting.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 21, (2019).</li><li>Uryvaev, A., Passhak, M., Hershkovits, D., Sabo, E., Bar-Sela, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+(TILs)+as+a+predictive+biomarker+of+response+to+anti-PD1+therapy+in+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+or+metastatic+melanoma.">The role of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) as a predictive biomarker of response to anti-PD1 therapy in patients with metastatic non-small cell lung cancer or metastatic melanoma.</a> Medical Oncology. 35 (3), 25 (2018).</li><li>Wang, K., Shen, T., Siegal, G. P., Wei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4/CD8+ratio+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+at+the+tumor-host+interface+has+prognostic+value+in+triple-negative+breast+cancer.">The CD4/CD8 ratio of tumor-infiltrating lymphocytes at the tumor-host interface has prognostic value in triple-negative breast cancer.</a> Human Pathology. 69, 110-117 (2017).</li><li>Carney, W. P., Bhagat, M., LaFranzo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+gene+expression+models+for+characterizing+response+and+metastasis+in+solid+tumor+samples+[abstract].+American+Association+for+Cancer+Research+Annual+Meeting.">Multidimensional gene expression models for characterizing response and metastasis in solid tumor samples [abstract]. American Association for Cancer Research Annual Meeting.</a> Cancer Research. 79 (13 Suppl), (2019).</li></ol>

Alla författare är anställda av Cofactor Genomics, Inc., företaget som utvecklat och producerar ImmunoPrism reagens kit och informatik verktyg som används i denna artikel. ImmunoPrism Assay är endast för forskningsanvändning och är inte avsett för användning i diagnostiska procedurer.

Protokollet kräver 20 ng intakt eller 40 ng mycket försämrad (FFPE) RNA. RNA-provet bör vara fritt från DNA, salter(t.ex. Det rekommenderas inte att fortsätta med RNA-prover som har ett DV200 <20%. Användning av in-kit kontroll RNA rekommenderas starkt eftersom dessa kontroller ger ett sätt att utvärdera prestanda i hela protokollet, från bibliotek förberedelse till analys.
Protokollet är utformat för att utföras med 0,2 ml PCR-bandrör. Om det är möjligt kan protokollet också utföras med hjälp av brunnarna i en 96-brunnPCR-platta. Använd helt enkelt brunnarna på en 96-brunnPCR-platta i stället för alla hänvisningar till PCR-rör eller bandrör. Använd PCR-plattor med tydliga brunnar bara, eftersom det är viktigt att visuellt bekräfta fullständig återsuspension av pärlor under pärpreningar och tvättsteg.
I hela protokollet, hålla reagenser frysta eller på is om inte annat anges. Använd inte reagenser förrän de är helt tinade. Var noga med att noggrant blanda alla reagenser före användning.
Håll enzym vid -20 °C tills de är färdiga att använda och återgå till -20 °C snabbt efter användning. Använd endast molekylärt nucleasefritt vatten; Det rekommenderas inte att använda DEPC-behandlat vatten. När pipettering för att blanda, försiktigt aspirera och avstå minst 50% av den totala volymen tills lösningarna är väl blandade. Pipett blanda alla master blandningar som innehåller enzymer. Använda virvel för att blanda enzymer kan leda till denaturering och äventyra deras prestanda. Under beadreningar, använd nygjorda 80% etanol lösningar från molekylär kvalitet etanol. Användning av etanollösningar som inte är färska kan resultera i lägre avkastning. Undvik över torkning av pärlorna, eftersom detta kan minska elution effektivitet (pärlor ser spruckna om över torkade).
Som beskrivs i steg 10 läggs unika indexprimers till varje reaktion. Baserat på sekvenserna i dessa index, för multiplikator på låg nivå, är vissa indexkombinationer optimala. Sekvenserna av dessa index krävs för att demultiplexing data efter sekvensering. Sekvenserna och rekommenderade multiplexningskombinationer finns i kompletterande tabell 3. I samma steg är det viktigt att notera att antalet rekommenderade PCR-cykler varierar beroende på kvaliteten på RNA som används, och, viss optimering kan krävas för att förhindra PCR överförstärkning. För ImmunoPrism Intact Control RNA och andra högkvalitativa RNA, starta optimering med 10 PCR cykler. För ImmunoPrism FFPE Control RNA och andra mycket försämrade/FFPE RNA, starta optimering med 15 PCR cykler. Att producera ett testbibliotek med RNA-representant för det material som ska analyseras för att optimera PCR-cykler rekommenderas. Det minsta antalet PCR-cykler som konsekvent ger tillräckligt förinsamling bibliotek avkastning (> 200 ng) bör användas. En sekundär topp runt 1000 bp på Bioanalyzer spår är ett tecken på över-förstärkning(figur 4). Överförstärkning bör minimeras, men närvaron av en liten sekundär topp kommer inte att störa analysen resultat.
För att minimera provförlust och undvika att byta rör kan steg 13 utföras i PCR-rör, bandrör eller en 96-brunnpcrplatta i stället för 1,5 ml mikrorör, om din vakuumkoncentrator tillåter. Rotorn kan tas bort på många koncentratorer. Detta gör det möjligt för bandrören eller plattorna att passa in i vakuumet. Vakuumkoncentrationen kan sedan köras med hjälp av vattenförinnans uttorkningsinställning utan centrifugering. Se handboken för din vakuumkoncentrator för instruktioner. Om proverna torkas ner i bandrör eller en 96-brunnsplatta kan hybridiseringssteget utföras i samma kärl.
Under steg 17, se till att virvla var 10-12 min för att öka pärp fånga effektivitet. Håll försiktigt locken på de varma bandrören vid blandning för att förhindra att rören öppnas.
De tvättar som beskrivs i steg 18 är avgörande för att undvika hög ospecifik kontaminering och måste följas noga. Var noga med att helt avbryta pärlorna vid varje tvätt, helt ta bort tvättbuffertarna och under wash buffer 2-tvätten överför du proverna till ett nytt bandrör (steg 18.6.5). Se till att streptavidinpärlorna är helt återsuspenderade och förblir i suspension under hela inkubationstiden. Stänk på rörlocken kommer inte att påverka fångsten negativt. Under rumstemperaturtvättar kan en microplate virvelmixer användas för att virvla proverna under hela den två minuter långa inkubationstiden för enklare återsuspension. Låt inte streptavidinpärlorna torka ut. Om det behövs, utöka inkubationsi buffertarna för att undvika torkning av pärlorna. Om du använder mer än ett bandrör, arbeta med ett bandrör i taget för varje tvätt medan de andra bandrören sitter i termocycler. Detta kan bidra till att undvika över torkning av pärlor eller rusar, vilket resulterar i dålig resuspension eller andra suboptimala tekniker. För första gången rekommenderas det inte att bearbeta mer än 8 biblioteksreaktioner åt gången.
Nuvarande immunprofileringstekniker ger ett kontinuum av information - från tusentals datapunkter som kräver betydande tolkning (RNA-sekvensering) till en individuell, diskret datapunkt (single-plex IHC). Protokollet som beskrivs här representerar en metod som är någonstans i mitten, med ett fokuserat utrymme som möjliggör hög känslighet, men fånga endast en delmängd av kliniskt relevanta transkriptomiska data. På grund av arten av bulk RNA utvinning, detta protokoll ger inte information om de rumsliga relationerna mellan immunceller och tumör mikromiljön, men resultaten kan kompletteras med bildteknik för att lägga till denna information. Det finns en myriad av tillämpningar för de data som genereras av detta protokoll, eftersom det finns mycket att lära om biologi av cancer som en sjukdom, och terapier utvecklas för att behandla det. Som visas i representativa resultat, den individuella immunrapporten är användbar för att förstå hur en patients immunprofil kan förändras som svar på händelser som sjukdomsprogression eller behandling. Även om resultaten som presenteras här ger några exempel användningfall, andra tillämpningar inklusive undersöka verkningsmekanismen för en terapi och identifiera förmodade biomarkörer av kliniska resultat såsom progression slös och total överlevnad är också Praktiska. När du använder detta protokoll för biomarkör upptäckt applikationer, Är det viktigt att öva god studie design för att säkerställa homogena populationer analyseras, tillräckliga prover ingår för statistisk makt, och källor till partiskhet beaktas. På grund av analysens fokuserade, strömlinjeformade natur är det möjligt att föreställa sig en väg mot klinisk validering och nedströms applicering av dessa biomarkörer en gång upptäckt.

Kvantifiering av tumörinfiltreralymfocyter (TILs) och andra immunrelaterade molekyler i formalin-fasta och paraffin inbäddade (FFPE) fast tumör mänskliga vävnadprover har visat värde i klinisk forskning1,2,3. Vanliga tekniker som flödecytometri och single-cell ribonucleic syra (RNA) sekvensering är användbara för färsk vävnad och blod4, men är olämpliga för analys av FFPE material på grund av oförmåga att skapa livskraftiga cellsuspensioner. Nuvarande metoder som har använts för att kvantifiera dessa celler i FFPE vävnad lider av stora utmaningar. Immunohistochemistry (IHC) och andra liknande bildframställning arbetsflöden kräver specifika antikroppar för att upptäcka cell-ytan proteiner, vilket kan vara svårt att standardisera mellan laboratorier för att möjliggöra reproducerbara kvantifiering5. Plattformar som nCounter-systemet förlitar sig på uttrycket av enskilda gener för att definiera viktiga immunceller6, vilket begränsar känsligheten och specificiteten hos detektion. Mer generiska RNA sekvensering metoder, tillsammans med fristående mjukvaruverktyg, finns tillgängliga men kräver betydande optimering och validering före användning7,8,9,10,11,12. Senaste framstegen i att kombinera laser capture microdissection (LCM) med RNA sekvensering för FFPE vävnad har visat löfte; En mer hög genomströmning krävs dock nyckelfärdiga lösningar för translationella studier som syftar till att identifiera robusta biomarkörer13,14. Metoder för att generera flerdimensionella biomarkörer, såsom Prediktiv immunmodellering, som definierar patientkohorter inklusive terapi responders, cancer subtyper, eller överlevnad resultat med hög prediktiv noggrannhet och statistisk signifikans blir allt viktigare i en ålder av precision medicin och immunterapi15,16.
För att ta itu med detta behov utvecklades en immunprofileringanalys för att möjliggöra känslig och specifik kvantifiering av immunceller i solid tumör FFPE-vävnad med hjälp av standardiserade RNA-sekvenseringreagenser och molnbaserade informatik. Förutom att ta emot försämrade RNA från FFPE-vävnad kan protokollet rymma RNA från att begränsa vävnadsprover som kärnnålbiopsier, nålaspirater och mikro- eller makrodissekerad vävnad. RNA-data från varje prov jämförs med en databas med genuttrycksmodeller av immunceller, som kallas immunsystemets hälsouttrycksmodeller, för att kvantifiera immunceller i procent av de totala cellerna som finns i provet. Kort, dessa modeller byggdes med hjälp av maskininlärningsmetoder för att identifiera unika multigena uttrycksmönster från heltranskriptomdata som genereras från renade immuncellpopulationer (isolerade med kanoniska cell-yta markörer)17,18. De flerdimensionella hälsouttrycksmodeller som ligger till grund för tekniken gör det möjligt för analysen att kvantifiera varje immuncell som en procent av de totala celler som finns i den heterogena blandningen. Detta gör det möjligt för forskaren att generera jämförelser mellan och inom urvalet immunceller, som har visat sig ha kliniskt värde19,20. Andra tillämpningar är kvantifiering av immunsvar före och efter behandling, enligt beskrivningen i de representativa resultaten. Analysen rapporterar om flera funktioner i immuncontexture av tumör och tumör mikromiljö inklusive de absoluta procentsatserna av åtta immuncelltyper (härledda från genuttryckmodeller): CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, CD56+ Natural Killer celler, CD19+ B-celler, CD14+ monocyter, Tregs, M1 makrofager och M2 makrofager. Dessutom rapporterar analysen uttrycket (i transkriptioner per miljon, eller TPM) av tio immunflyktgener: PD-1, PD-L1, CTLA4, OX40, TIM-3, BTLA, ICOS, CD47, IDO1 och ARG1.
Reagenssatsen används för att göra bibliotek av hög kvalitet redo för sekvensering på en Illumina-plattform efter en hybridinsamlingsbaserad biblioteksberedningsmetod, som visas i figur 1. Om en forskare inte har en Illumina sekvenseringsplattform i sitt laboratorium, får de lämna in sina prover till ett kärnlaboratorium för sekvensering. När sekvenseringsdata har genererats laddas upp till Prismportalen för automatiserad analys och en omfattande kvantitativ profil för varje enskilt prov returneras till användaren i form av immunrapporten (figur 2A. Användare kan också definiera provgrupperier i Prismportalen för att generera en Biomarker-rapport (figur 2B), som belyser statistiskt signifikanta biomarkörer som skiljer två patientkohorter. Viktigt är att de data som genereras av reagenssatsen endast är avsedda för forskningsanvändning och får inte användas för diagnostiska ändamål.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig1a.jpg"> Bild 1: Översikt över arbetsflödet. I detta protokoll konverteras RNA först till cDNA. Sekvensering sadaptrar är ligated, och adapter-ligated cDNA förstärks och streckkodas av PCR för att skapa en pre-capture bibliotek. Biotinylated sonder hybridiseras sedan till specifika cDNA mål som sedan fångas med streptavidin pärlor. Obundet, icke-riktat cDNA avlägsnas genom tvätt. En slutlig PCR-anrikning ger ett bibliotek efter inspelning redo för sekvensering. *Totalt RNA måste komma från mänskliga prover. kan vara intakt eller försämrad (FFPE) RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig2.jpg"> Figur 2: Representant Immun rapporter. Arbetsflödet genererar två rapporter, en individuell immunrapport (A)för varje bearbetade prov och en biomarkörrapport(B)för definierade patientkohorter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Protokollet kräver cirka 16 h förberedelsetid (från totalt RNA till bibliotek redo för sekvensering); Det finns dock ett antal valfria stopppunkter, som anges i protokollet. Analysen använder sig av den rika, dynamiska karaktären av transkriptomics att gå bortom äldre single-analyte biomarkörer till flerdimensionella genuttryck modeller, vilket möjliggör omfattande biologisk karakterisering av vävnadsprover med standardiserade reagenser och lättanvända programvaruverktyg. Det ger forskare möjlighet att använda en modern teknik i sitt eget laboratorium, genom att utnyttja maskininlärning och en databas med hälsouttrycksmodeller för att härleda mer exakta, kvantitativa immunprofiler av värdefulla kliniska prover och upptäcka flerdimensionella RNA biomarkörer med fullständig statistisk analys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR 8 tube strip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2700</td>
			<td>USA Scientific 0.2 mL PCR 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td>Prepare 80% by mixing with nuclease-free water on the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well thermal cyclers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase Reversible Immobilization (SPRI) Beads</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>Agencourt AMPure XP &#8211; PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis chips and kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA chips and kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Beads</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoPrism Kit &#8211; 24 reaction</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-302</td>
			<td>Cofactor ImmunoPrism Immune Profiling Kit &#8211; 24 reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15279011</td>
			<td>Invitrogen brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack</td>
			<td>Alpaqua/Invitrogen</td>
			<td>A001322/12331D</td>
			<td>96-well Magnetic Ring Stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td>USA Scientific 1.5 mL low-adhesion microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq550</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Any Illumina sequencer may be used for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Extraction Kit</td>
			<td>Cofactor Genomics</td>
			<td>CFGK-401</td>
			<td>Cofactor Prism FFPE Extraction Kit &#8211; 24 samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified RNA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Purified from human tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Qubit 4 System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometric Assay Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>0.5mL Thin Wall PCR Tubes with Flat Caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity Fluorometric Reagent Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>VacufugePlus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath or heating block</td>
			<td>VWR/USA Scientific</td>
			<td>NA/2510-1102</td>
			<td>VWR water bath/USA Scientific heating block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predictive immune modeling of solid tumors

Immunterapier visar löfte vid behandling av onkologipatienter, men komplexa heterogenitet av tumörmikromiljön gör förutsäga behandlingssvar utmanande. Förmågan att lösa de relativa populationerna av immunceller som finns i och runt tumörvävnaden har visat sig vara kliniskt relevant för att förstå svar, men begränsas av traditionella tekniker som flödecytometri och immunohistokemi ( IHC), på grund av den stora mängd vävnad som krävs, brist på exakta markörer celltyp, och många tekniska och logistiska hinder. En analys (t.ex. immunoprism immunprofileringassay) övervinner dessa utmaningar genom att ta emot båda små mängder RNA och mycket försämrade RNA, vanliga funktioner i RNA som utvinns ur kliniskt arkiverad fast tumörvävnad. Analysen nås via en reagenskit och molnbaserade informatik som ger en kvantitativ, hög genomströmning immunprofileringslösning för Illumina sekvenseringsplattformar. Forskare börjar med så få som två delar av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnad eller 20-40 ng av totala RNA (beroende på provkvalitet), och protokollet genererar en immun profil rapport kvantifiera åtta immuncelltyper och tio immun fly gener, fånga en fullständig bild av tumör mikromiljön. Ingen ytterligare bioinformatisk analys krävs för att använda sig av de resulterande uppgifterna. Med lämpliga provkohorter kan protokollet också användas för att identifiera statistiskt signifikanta biomarkörer inom en patientpopulation av intresse.

Det finns ett antal kontrollpunkter i hela protokollet som gör det möjligt för en användare att utvärdera kvaliteten och kvantiteten av genererat material. Efter steg 12 som beskrivs i protokollet genereras ett elektropherogram enligt figur 3, representativt för ett typiskt förfångade bibliotek för ett intakt RNA-prov (RIN = 7.8).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig3.jpg"> Bild 3: Typiskt Förfångaavingsbibliotek Bioanalyzer spår för ett intakt RNA-prov. Förfångabara bibliotek visas som en bred topp runt 250-400 baspar (bp) i storlek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Försiktighet bör iakttas för att undvika överförstärkning, vilket indikeras av den andra toppen runt 1000 bp som visas i figur 4, ett representativt elektropherogram av ett förfångade bibliotek som genereras från ett FFPE RNA-prov (DV200 = 46). Om denna topp är liten i förhållande till huvudtoppen (ca 250-400 baspar (bp), som visas), kommer det inte att störa nedströms steg eller analys. Om den andra toppen är stor i förhållande till 250-400 bp topp, pre-capture biblioteket kan göras om med färre PCR cykler för att minska överförstärkning.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig4.jpg"> Bild 4: Typiskt Förfångakande bibliotek Bioanalyzer spår för en FFPE RNA prov. Den andra toppen runt 1000 bp är ett tecken på överförstärkning. Om denna topp är liten i förhållande till huvudtoppen runt 250-400 bp (som visas), kommer det inte att störa nedströms steg eller analys. Om den andra toppen är stor i förhållande till 250-400 bp topp, pre-capture biblioteket kan göras om med färre PCR cykler för att minska över-förstärkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Som beskrivs i steg 12.1.3 bör förekomsten av adapterdimor utvärderas för att avgöra om ytterligare rensning är nödvändig. De elektropherogram som visas i figur 5 är representativa för oacceptabla (figur 5A,DV200 = 33) och godtagbara (figur 5B,DV200 = 46) nivåer av adapterdimer, som visas som den skarpa toppen runt 128 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig5.jpg"> Bild 5: Förfångande bibliotek Bioanalyzer spår. Adaptern dimer dyker upp som en skarp topp runt 128 bp. (A) Överdriven adapter dimers finns i detta elektropherogram. (B)Acceptabla adapternivåer avbildas i detta spår. Båda spåren visar tecken på mild överförstärkning, men detta bör inte störa ImmunoPrism Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig5alarge.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Vid slutförandet av protokollet, före sekvensering, utvärderas de slutliga biblioteken igen med hjälp av digital elektrofores. Bibliotek tillverkade av FFPE RNA tenderar att ha en mindre genomsnittlig storleksfördelning än bibliotek gjorda av intakt RNA. För intakta RNA-prover bör den resulterande spårningen se ut ungefär som figur 6 (RIN = 9.5). För försämrade eller FFPE RNA bör den resulterande spårningen se ut ungefär som figur 7 (DV200 = 36).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig6.jpg"> Figur 6: Typiskt Sista bibliotek Bioanalyzer spår för en intakt RNA prov. Slutbibliotek visas som en bred topp runt 250-400 baspar (bp) i storlek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig7.jpg"> Bild 7: Typiskt Bioanalysator spår för ett FFPE RNA-prov. Bibliotek tillverkade av FFPE RNA tenderar att ha en mindre genomsnittlig storleksfördelning än bibliotek gjorda av intakt RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Som beskrivits kan de resultat som genereras med det här protokollet tillämpas på två viktiga sätt, som visas i figur 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig8.jpg"> Bild 8: Två användningsfall i protokollet. De resultat som genereras av denna immun profilering analys tillämpas i två viktiga translationella applikationer. (A)Det första användningsfallet börjar från mänsklig fast tumörvävnad (inklusive FFPE-arkiv) och genererar en individuell immunprofil för provet. (B)När data har genererats för en kohort av mänskliga prover kombineras de med hjälp av Prismportalen för att generera en flerdimensionell biomarkör och motsvarande Biomarkörrapport. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
För att demonstrera vart och ett av dessa användningsfall ingår representativa data från en liten translationell studie21. De prover som används i denna studie är en uppsättning exemplar från 7 patienter som diagnostiserats och behandlas för icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Proverna är patientmatchade fast tumörvävnad från före och efter behandling tarmbiopsier. Först analyserades enskilda prover för att generera en immunprofil, till exempel exempelrapporten som visas i figur 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig9.jpg"> Figur 9: Exempel på individuell immunrapport för ett NSCLC-prov. Prism Portal pipeline genererar en grafisk rapport för varje prov bearbetas, med en representativ rapport som genereras för en NSCLC solid tumör prov som visas här. (A)I rapportens framsida avbildas grafiskt nedbrytningen av immunceller som finns i RNA-provet som extraheras från FFPE-vävnaden. (B)På baksidan av rapporten ingår en tabell över immunceller (i absoluta procentsatser) och utrymningsgenuttryck (i transkriptioner per miljon, eller TPM) samt ett resultatuttalande för analysen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig9alarge.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Immunprofilerna före och efter behandling kan användas för att förstå hur en behandling (kemoterapi eller strålning, i denna studie) har modifierat tumörmikromiljön. Ett exempel visas i figur 10, där förändringar i procent för varje immuncell och totalt immuninnehåll visas före och efter kemoterapi, för en enda patient.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig10.jpg"> Figur 10: Exempel resultat före och efter behandling. Enskilda immunceller och totalt immuninnehåll data som genereras från före och efter behandling prover från en enda NSCLC patient visas. I det här exemplet fick patienten en kemoterapi regim som behandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Patienter kan grupperas efter kriterier såsom kliniska resultat eller fenotyper för jämförelse. I figur 11jämfördes proverna i NSCLC-studien till exempel beroende på tid till sjukdomsprogression efter behandling. En delmängd av patienterna visade sjukdomsåterkommer i >18 månader, och en annan delmängd fortskmade snabbare, under ≤18 månader. Mediandeltatsvärdet (skillnaden mellan värden före och efter behandling) jämförs för varje prov för att identifiera förmodade biomarkörer för sjukdomsprogression.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig11.jpg"> Figur 11: Exempel på klinisk resultatjämförelse. Kvantitativa förändringar mellan immuncellprocenten i matchade NSCLC-prover före och efter behandlingen beräknades och rapporterades som "delta"-värdet. De markerade i gult visar tydliga signaländringar mellan överlevnadsstatusen. Blå staplar representerar mediandeltavärden för >18 månader fram till sjukdomsprogression, orange staplar representerar mediandeltavärden för ≤18 månader fram till sjukdomsprogression. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig11large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Slutligen kan liknande provgrupper användas för att titta specifikt på förbehandlingsprover för att identifiera prediktiva biomarkörer genom att använda Prism-portalen för att generera en Biomarkörrapport. Visas i figur 12, samma kliniska fenotyp (sjukdomsprogression) som beskrivs ovan definierar provgrupperingar. I detta exempel identifierades två immunflyktsgener som statistiskt signifikanta differentiatorer av provgrupperingarna (CD47 och OX40, som visas i den nedre panelen av figur 12A). I det här exemplet, eftersom de enskilda genbiomarkörerna är robusta med tydlig statistisk signifikans, tillför den flerdimensionella biomarkören inte något betydande prediktivt värde (ImmunoPrism, som märks i det övre högra stapeldiagrammet i figur 12B). Den fullständiga dataförteckningen, inklusive resultat för alla 18 analyter för analysen, sammanfattas på baksidan av rapporten, inklusive statistisk analys och en kort sammanfattning av metoderna.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60645/60645fig12.jpg"> Bild 12: Exempel på biomarkörrapport för NSCLC-prover. Biomarker Discovery-pipelinen levererar en visuell rapport över enskilda biomarkörer och en flerdimensionell biomarkör för maskininlärning med detaljerad statistik. (A)För denna studie identifierade rörledningen två individuella biomarkörer (CD47 och OX40) som statistiskt signifikanta för att definiera sjukdomsprogression med en tröskel på 18 månader. (B)Närmare uppgifter om metoden och fullständiga resultat ingår på baksidan av rapporten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/60645fig12alarge.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande tabell 1: Reagens kit material. En lista över material som finns i ImmunoPrism Kit listas, tillsammans med de artikelnummer som refereras i tillverkarens protokoll. All annan utrustning och alla material som krävs finns upptagna i materialförteckningen. Besök <a href="https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/" target="_blank">https://cofactorgenomics.com/product/immunoprism-kit/</a> för säkerhetsdatablad (SDS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Kompletterande tabell 2: Termisk cycler program. De rekommenderade cykelprogram som refereras i hela protokollet sammanfattas för enkel programmering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table2.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).</a>
Kompletterande tabell 3: Sekvensering Index Guide. Indexprimers som anges i reagenssatsen visas. en unik primer läggs till varje reaktion för post-sekvensering demultiplexing. Rekommenderade kombinationer av multiplexning på låg nivå finns också. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60645/supplemental_table3.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Predictive Immune Modeling of Solid Tumors at JoVE.com

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Användningen av en RNA-baserad metod för att bestämma kvantitativa immunprofiler av solida tumörvävnader och utnyttja kliniska kohorter för immunonkologi biomarkör upptäckt beskrivs genom en molekylär och informatik protokoll.

Prediktiv immunmodellering av solida tumörer

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

Omfattande karakterisera tumören mikromiljö är viktigt i immuno-onkologi forskning. Denna analys är den första att använda RNA-baserade hälsouttryck modeller för att mäta immunceller i solid tumörvävnad. Denna analys gör det möjligt för forskare att få mycket känsliga och specifika mätningar av immun contexture i FFB solida tumörvävnader och att kombinera dessa resultat till en flerdimensionell biomarkör.Alla cancerbehandlingar, inte bara immunterapier, framkalla ett immunsvar på platsen för den fasta tumören. Att mäta detta immunsvar är viktigt för att förstå sjukdomsprogression och terapisvar. Detta protokoll kombinerar traditionella RNA-biblioteket förberedelse tekniker med riktade fånga.Medan tidskrävande, efter tvätten steg och övervakning av kontrollpunkter kvalitetskontroll som föreslås är mycket viktigt för framgång. För hög nedstärkad RNA från formalin-fast paraffin inbäddade prover, montera den första strängen syntesreaktion på is enligt tabellen. Blanda reaktionerna noggrant genom att pipettera upp och ner flera gånger innan du kort kort snurrar ner proverna i en mikrocentrifug.I slutet av centrifugeringen placerar du omedelbart proverna i en förvärmd termisk cycler som följer program nummer tre från bordet. För högkvalitativt intakt RNA, montera den första strängsyntesreaktionen på is i ett nukleasfritt PCR-rör som skisseras i tabellerna. Till att börja detta förfarande, blanda 200 nanogram av streckkodade biblioteket av intresse med två mikrogram COT-1 DNA och två microliters av blockering oligos i en nukleas-fri PCR-röret.Använd sedan en vakuumkoncentrator inställd på 30 till 45 grader Celsius för att torka innehållet i röret. Efter hybridisering, ta bort proverna från den termiska cyclern och ställ in termisk cycler att inkubera vid 65 grader Celsius med det uppvärmda locket inställt på 70 grader Celsius. Använd en flerkanalig pipett för att överföra 17 mikroliter av helt homogeniserade pärlor till proverna och pipetten noggrant upp och ner 10 gånger.För att binda DNA till pärlorna, placera rören i termisk cycler följande program 10 kort ta bort avskalade rören var 10 till 12 minuter för tre sekunder av mild virvelning för att hålla pärlorna återanvänds. Omedelbart efter bindningsinkubationen, avlägsna en remsa av rör från termisk cycler och tillsätt 100 mikroliter av förvärmd tvättbuffert en till rören. Pipett noggrant upp och ner 10 gånger och placera rören på ett magnetiskt rack för att låta pärlorna att helt separera från tvättlösningen innan de aspirerar det obundna DNA som innehåller supernatant.Ta bort rören från racket och tillsätt 150 mikroliter av förvärmda stränga tvätt buffert med grundlig blandning för att helt återanvända pärlorna noga med att undvika bubblor. Placera rören tillbaka till termisk cycler på 65 grader Celsius i fem minuter innan du placerar rören tillbaka på den magnetiska rack så att pärlorna att helt separera från supernatanter. Kasta obundet DNA som innehåller supernatanter, tvätta pärlorna en gång till med förvärmd sträng tvättbuffert som just visat för totalt två stränga tvättar.Efter den sista tvätten, ta bort supernatanten och tillsätt 150 mikroliter av rumstemperaturtvättbuffert en till rören. Pipettera tvätten 10 till 20 gånger för att helt resuspend pärlorna och inkubera proverna med locket förseglat i två minuter omväxlande mellan vortexing i 30 sekunder och vila i 30 sekunder. I slutet av inkubationen, centrifug kort och placera rören på den magnetiska rack och ta bort supernatanten när pärlorna har helt anslutit sig till magneten.Centrifugera rören kort med locken stängda och återföra proverna till magnetstället. Använd en 10 mikroliterpipett för att ta bort eventuell resttvättbuffert och tillsätt 150 mikroliter av rumstemperaturtvättbuffert två. Pipettera tvätten 10 till 20 gånger för att helt återanvänd pärlorna och inkubera proverna med locken förseglade i två minuter omväxlande mellan virvel i 30 sekunder och vila i 30 sekunder.Efter en kort centrifugering överför du hela volymen av pärlor från varje rör till rena nukleasfria PCR-rör och placerar rören på det magnetiska stället. Efter att ha kastat det obundna DNA som innehåller supernatanter, centrifugerar du kort proverna igen och använder en 10 mikroliterpipett för att ta bort eventuella kvarvarande tvättbuffert från pärlorna medan de är i det magnetiska stället. Tillsätt 150 mikroliter av tvättbuffert tre till rören och pipetten upp och ner 10 till 20 gånger för att helt återanvända pärlorna.Inkubera röret i två minuter omväxlande mellan 30 sekunder av mild virvel och 30 sekunders vila innan kort centrifugering. Placera rören på den magnetiska rack att aspirera supernatanterna och kort centrifug pärla proverna igen. Använd en 10 mikroliterpipett för att ta bort eventuell resttvättbuffert från pärlorna medan de är i magnetstället innan du tar bort rören från racket och resuspending pärlorna i 20 mikroliter av nukleasfritt vatten per rör.Sedan pipettera pärlorna 10 gånger för att säkerställa att eventuella pärlor fastnat på sidan av rören har återsuspade. Förekomsten av adapter dimers bör utvärderas för att avgöra om ytterligare rensning är nödvändig. Till exempel visar detta elektroferogram en acceptabel nivå av adapter dimer som visas som en skarp topp runt 128 baspar medan detta elektroferogram visar en oacceptabel nivå av adapter dimer.Immunprofilerna före och efterbehandling kan användas för att förstå effekterna av en specifik terapi på tumörmikromiljö som i denna representativa analys för vilka förändringarna i procent för varje immuncell av intresse och det totala immuninnehållet visas före och efter kemoterapi för en enda patient. I denna analys jämfördes prover mellan patientgrupperna enligt deras tid till sjukdomsprogression efter behandling. En undergrupp av patienterna visade sjukdom återkommer efter 18 månader medan en annan delmängd utvecklats snabbare i 18 eller färre månader.Medianvärdet för delta kunde sedan jämföras för varje prov för att identifiera förmodade biomarkörer för sjukdomsprogression. Till exempel, här två immun flykt gener identifierades som statistiskt signifikanta differentiatorer av urvalet grupperingar. Eftersom de enskilda genbiomarkörerna var robusta med tydlig statistisk signifikans, tillförde den flerdimensionella biomarkören inte signifikant prediktivt värde.Var noga med att utföra de uppvärmda tvättar en remsa i taget för att förhindra provkylning och kom ihåg att överföra pärlorna till färska rör för att undvika förorening utanför målet. Detta protokoll visar användningen av genuttryck modeller för att kvantifiera immunceller och tumör vävnad. Nya modeller utvecklas för att mäta cellstater som utmattning eller aktivering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av immun fettvävnad celler

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissekera Innate Immun Signalering i Viral Evasion av cytokinproduktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...