Name: multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

نشكر ديفيد م. باترسون وكريستوفر س. ماجينس من مختبر الدكتور زيف غارتنر لتوريدها النوع من الكواشف الشفرة القائمة علي الدهن واقتراحات بشان الخطوات التجريبية وتحليل البيانات. تاسست هذه الاعمال من قبل المعاهد الوطنية للصحة (HL13347202).

الاجراء حيوانيه وفق الجامعة من [بيتسبورغ] مؤسسه رعاية حيوانيه واستعمال لجنه ([اياكوك]).
1. الماوس الجنينية تشريح القلب والاعداد تعليق خليه واحده
ملاحظه: قد تستغرق هذه الخطوة بضع ساعات اعتمادا علي اعداد الاجنه لتشريحها.
<ol><li>للحصول علي E 18.5 القلوب الجنينية ، موت...

<ol>
	<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).</li><li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution.">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li><li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development.">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development.">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476 (2019).</li><li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart.">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte.">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100 (2017).</li><li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies.">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367 (2018).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).</li><li>Gr&#252;n, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments.">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).</li><li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq.">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep</a> (2018)</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>. Agilent 4200 TapeStation System Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf</a> (2019)</li><li>. SPRIselect User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf">https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf</a> (2012)</li><li>. Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf</a> (2018)</li><li>. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf</a> (2016)</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).</li><li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly.">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li><li>. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep</a> (2017)</li></ol>

في هذه الدراسة ، وقد أظهرنا بروتوكول لتحليل الملفات الشخصية الاحاديه الخلية. كما قدمنا طريقتين اختياريه لعينات متعددة الإرسال في سير العمل المتسلسل scRNA. وقد ثبت ان كلا الأسلوبين ممكنة في مختبرات مختلفه وقدمت حلولا لتشغيل تجربه خليه واحده فعاله من حيث التكلفة وخاليه من التاثير الدفعي<sup clas...

ويختلف الملف التعريفي لكل خليه من خلايا الخلية الواحدة بين مجموعات الخلايا اثناء النمو الجنيني. علي الرغم من ان التهجين الجزيئي الواحد في الموقع يمكن استخدامه لتصور التعبير عن عدد صغير من الجينات1، فان تسلسل الخلايا الاحاديه الخلية (Scrna-Seq) يوفر نهجا غير متحيز لتوضيح أنماط التعبير علي نطاق الجينوم للجينات في الخلايا المفردة. بعد نشرها لأول مره في 20092، تم تطبيق scrna-Seq لدراسة الانسجه المتعددة في مراحل تنموية متعددة في السنوات الاخيره3،4،5. كما انه نظرا لان أطلس الخلايا البشرية قد أطلق مؤخرا مشاريعه التي تركز علي التنمية ، فمن المتوقع ان تتولد في المستقبل القريب بيانات أكثر من خليه واحده من الانسجه الجنينية البشرية.
يلعب القلب كالجهاز اولي ان يطور دور حاسمه في تطوير جنينيه. يتالف القلب من يتعدد خليه أنواع والتطوير من كل خليه نوع يكون باحكام ينظم وقتيا و [سبتيلي]. علي مدي السنوات القليلة الماضية ، وقد تميزت سلاله المنشا والخلية من خلايا القلب في مراحل النمو المبكر6، والتي توفر أداه الملاحة مفيده هائله لفهم المسببة للامراض القلب الخلقية ، وكذلك لتطوير أساليب أكثر تقدما من الناحية التكنولوجية لتحفيز التجدد عضله7.
خضع ال [سكرنا-تلي] توسع سريعة في سنون أخيره8,9,10. مع الأساليب التي تم تطويرها حديثا ، وتصميم وتحليل التجارب خليه واحده أصبحت أكثر قابليه للتحقيق11،12،13،14. الطريقة المعروضة هنا هي اجراء تجاري يستند إلى حلول الحبريه (انظر جدول المواد)15,16. هذه الطريقة ميزات التقاط الخلايا ومجموعات من الخرز المرمزة بشكل فريد في قطره مستحلب زيت الماء تحت السيطرة علي نظام تحكم ميكروفلويدريك. معدل تحميل الخلية في قطرات منخفضه للغاية بحيث الغالبية العظمي من المستحلبات الحبريه تحتوي علي خليه واحده فقط17. وياتي التصميم البارع للاجراء من فصل الخلايا الواحدة إلى المستحلبات التجميعية التي تحدث في وقت واحد مع الترميز ، والتي تمكن التحليل الموازي للخلايا الفردية باستخدام الحمض الريبي-المتسلسل علي السكان غير المتجانسين.
دمج استراتيجيات تعدد الإرسال هي واحده من الإضافات الهامه لسير العمل التقليدية خليه واحده13,14. هذه الاضافه مفيده جدا في التخلص من الشكوك الخلية ، والحد من التكاليف التجريبية ، والقضاء علي اثار الدفعات18،19. استراتيجية الترميز القائم علي الدهن واستراتيجية الترميز المضادة القائمة علي الأضداد (انظر جدول المواد) هي الطريقتين الأكثر استخداما لتعدد الإرسال. تستخدم الباركود المحددة لتسميه كل عينه في كلا الأسلوبين ، ومن ثم يتم خلط العينات المسمية للتقاط خليه واحده ، واعداد المكتبة ، والتسلسل. بعد ذلك ، يمكن فصل بيانات التسلسل المجمع عن طريق تحليل تسلسلات الباركود (الشكل 1)19. ومع ذلك ، توجد اختلافات كبيره بين الطريقتين. وتستند استراتيجية الترميز القائم علي الدهن علي الدهون المعدلة قله الكريات التي لم يتم العثور علي اي تفضيلات نوع الخلية. في حين ان الأجسام المضادة القائمة علي استراتيجية الترميز يمكن فقط الكشف عن الخلايا التي تعبر عن البروتينات مستضد19,20. الاضافه إلى ذلك ، فانه ياخذ حوالي 10 دقيقه لتلطيخ الدهون ولكن 40 دقيقه لوصمه عار الأجسام المضادة (الشكل 1). وعلاوة علي ذلك ، فان قله الكريات الدهنية المعدلة بالدهن أرخص من الأجسام المضادة-قله الكريات الوحيدة المترافقة ولكنها ليست متاحه تجاريا في وقت كتابه هذه المقالة. وأخيرا ، يمكن للاستراتيجية القائمة علي الدهن تعدد العينات 96 في تجربه واحده ، ولكن الاستراتيجية القائمة علي الأجسام المضادة لا يمكن حاليا الا تعدد 12 عينات.
يجب ان يكون رقم الخلية الموصي بها لتعدد الإرسال في تجربه واحده اقل من 2.5 × 104، والا ، فانه سيؤدي إلى نسبه عاليه من الشكوك الخلية والتلوث mrna المحيطة المحتملة. من خلال استراتيجيات تعدد الإرسال ، سيتم تخفيض تكلفه التقاط خليه واحده ، وجيل cDNA ، واعداد المكتبة لعينات متعددة إلى تكلفه عينه واحده ولكن تكلفه التسلسل ستبقي هي نفسها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120252 330019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium Controller</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250 230003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>330002, 120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Clip</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120253 230002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>25 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Chales River</td>
			<td>Strain Code 022</td>
			<td>ordered pregnant mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424R</td>
			<td>Appendorf</td>
			<td>2231000214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000073</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM Kit v3,4 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000094</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; Library Kit v3</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000095</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; v3 Gel Beads</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000059</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>11088807001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000048</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661020N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661000N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi Cell Strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td>Porosity 40 &#956;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td>Add 5 &#181;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &#181;l staining volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (IPA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0295239</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 4-pack (0.1&#8211;2.5&#956;L, 0.5-10&#956;L, 10&#8211;100&#956;L, 100&#8211;1,000&#956;L variable-volume pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318 (60ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template Switch Oligo</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>3000228</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Master Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The cell browser is Loup Cell Browser</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The well maintained R platform is Seurat V3</td>
			<td>satijalab</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-3710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155801</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155803</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155805</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq RPI primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells

وقد أحرز التسلسل التسلسلي للخلية الواحدة تقدما كبيرا في السنوات العديدة الماضية وأصبح أداه هامه في مجال البيولوجيا التنموية. وقد استخدمت بنجاح لتحديد السكان الخلايا النادرة ، واكتشاف الجينات علامة الرواية ، وفك المعلومات التنموية المكانية والزمانيه. وقد تطورت طريقه الخلية الواحدة أيضا من تكنولوجيا Fluidigm C1 المستندة إلى ميكروفلوديميك إلى الحلول القائمة علي القطرات في السنتين أو الثلاث سنوات الماضية. هنا استخدمنا القلب كمثال لشرح كيفيه التعريف خلايا الانسجه الجنينية الماوس باستخدام الطريقة التي تستند إلى القطرة scRNA-Seq. الاضافه إلى ذلك ، قمنا بدمج استراتيجيتين في سير العمل لتشكيل عينات متعددة في تجربه واحده. باستخدام واحده من الأساليب المتكاملة ، لدينا في وقت واحد لمحه أكثر من 9,000 خلايا من عينات القلب ثمانيه. ستكون هذه الأساليب ذات قيمه لمجال البيولوجيا التنموية من خلال توفير طريقه فعاله من حيث التكلفة لتشكيل خلايا منفردة في ان واحد من خلفيات وراثيه مختلفه أو مراحل تنموية أو مواقع تشريحيه.

في هذه الدراسة ، استخدمنا الماوس القلب الجنيني كمثال لإظهار كيفيه الإرسال المتعدد خليه واحده mRNA التسلسل تم تنفيذها لمعالجه عينات مختلفه من أجزاء منفصلة من الجهاز في وقت واحد. تم عزل e 18.5 CD1 الماوس قلوب وتشريحها في الأذين الأيسر (LA) ، الأذين الأيمن (RA) ، البطين الأيسر (LV) والب...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

هنا قدمنا مضاعفه خليه واحده mRNA أسلوب التسلسل إلى التعبير الجيني الشخصي في الانسجه الجنينية الماوس. الخلية المفردة القائمة علي القطرات mRNA التسلسل (scRNA-Seq) الأسلوب في تركيبه مع استراتيجيات تعدد الإرسال يمكن الملفات الشخصية خلايا واحده من عينات متعددة في وقت واحد ، مما يقلل بشكل كبير من تكاليف الكاشف ويقلل من اثار الدفعة التجريبية.

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

ويستخدم تسلسل مرنا خلية واحدة على نطاق واسع لفهم العمليات البيولوجية على مستوى خلية واحدة. وقد أدى ظهور استراتيجيات تعدد التضخيم إلى زيادة توسيع نطاق تضخيمها من خلال السماح بتحديد سمات عينات متعددة في تجربة واحدة، مما أدى إلى خفض التكلفة بشكل كبير وتجنب الآثار الدفعية. إثبات الإجراء سيكون وي فنغ، وهو ما بعد الدكتوراه، وأندرو Przysinda، وهو فني من مختبري.بعد العد، وتقسيم الخلايا المعزولة من اليوم الجنيني 18.5 غرف القلب إلى خمس مرات 10 إلى aliquots الخامس وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. Resuspend الكريات في 180 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل عينة وإضافة 20 ميكرولترات من الباركود مرساة حل الأسهم إلى كل أنبوب مع خلط لطيف. بعد حضانة لمدة خمس دقائق على الجليد، إضافة 20 ميكرولترات من الأسهم الباركود المشارك مرساة حل لكل أنبوب مع خلط لطيف لاحتضان إضافية لمدة خمس دقائق على الجليد قبل غسل الخلايا ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من PBS الباردة تكملها 1٪ بولين مصل لكل غسل، ثم تصفية العينات في أنابيب جديدة من خلال واحد مصفاة خلية 40 ميكرومتر لكل أنبوب.بعد العد، وتجميع رقاقة B إلى حامل رقاقة، ثم إضافة 75 ميكرولترات من محلول 50٪ الجلسرول إلى الآبار غير المستخدمة في الصف واحد، 40 microliters إلى الآبار غير المستخدمة في الصف الثاني، و 280 ميكرولترات إلى الآبار غير المستخدمة في الصف الثالث. لاحظ أنه يتم استخدام شريحة تدريب هنا لشرح الإجراء. أضف الحجم المناسب من تعليق الخلية والمياه الخالية من النوى إلى المزيج الرئيسي مع الأنابيب اللطيفة.إضافة 75 ميكرولترات من الحل الخلية الناتجة إلى مركز أسفل العينة جيدا في الصف واحد دون فقاعات. دوامة حبات هلام لمدة 30 ثانية قبل إضافة ببطء 40 ميكرولترات من الخرز إلى المركز السفلي من حبة هلام جيدا في الصف الثاني دون فقاعات. إضافة 280 microliters من تقسيم النفط أسفل الجدار الجانبي للزيت تقسيم بئر في الصف الثالث.نعلق طوقا إلى رقاقة دون الضغط على طوقا والحفاظ على طوقا الأفقي لتجنب ترطيب طوقا. تحميل رقاقة تجميعها مع طوقا في وحدة تحكم الكروم وتشغيل الكروم خلية واحدة B البرنامج. لاحظ أن الشاشة يظهر الكروم التدريب لرقاقة التدريب ولكن للتجارب الحقيقية الشاشة سوف تعرض الكروم خلية واحدة B.When البرنامج قد أكملت، على الفور إزالة رقاقة وتجاهل طوقا.أضعاف الغطاء مرة أخرى لفضح الآبار في زاوية 45 درجة والتحقق من مستويات السائل للتأكد من عدم وجود القباقيب. التعرق ببطء 100 ميكرولترات من حبات هلام في مستحلب من أدنى نقطة من الانتعاش جيدا والتحقق من توحيد الخرز. الاستغناء عن الخرز المستحلب أسفل جدار أنبوب PCR جديد على الجليد ووضع الأنبوب في دورة حرارية للنسخ العكسي.لإعداد cDNA للتضخيم، إضافة 125 ميكرولترات من عامل الانتعاش إلى العينة في درجة حرارة الغرفة. لا ينبغي ملاحظة أي سائل مبهم وتجنب الأنابيب أو الدوامة. انتظر 60 ثانية قبل إزالة عامل الاسترداد ببطء من أسفل الأنبوب وإضافة 200 ميكرولترات من خليط تنظيف حبة الدوامة إلى العينة.الميفط الخليط 10 مرات قبل احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ضع العينات على مغناطيس في الموضع العالي. عندما يمسح الحل، وإزالة عظمى وإضافة 200 ميكرولترات من 80٪ الإيثانول إلى بيليه.بعد 30 ثانية، وإزالة الإيثانول وكرر غسل مرتين أكثر. بعد الغسيل الأخير، طرد مركزي لفترة وجيزة العينة ووضع الأنبوب على المغناطيس في وضع منخفض للسماح للعينة للهواء الجافة لمدة تقل عن دقيقتين. عندما جفف العينة، وإزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة 35.5 ميكرولترات من محلول elution الطازجة.بعد فترة حضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ضع العينة على المغناطيس في وضعية عالية حتى يمسح المحل قبل نقل 35 ميكرولترات من العينة إلى شريط أنبوب جديد. بالنسبة لتضخيم cDNA باستخدام استراتيجية التكويد المستندة إلى الدهون ، أضف خليط تفاعل التضخيم إلى عينات cDNA ذات الـ 35 ميكرومتر مع خلط دقيق قبل الطرد المركزي لفترة وجيزة. في نهاية الدوران، احتضان العينة في دورة حرارية بعد إجراء التضخيم cDNA المناسبة.إضافة 120 ميكرولترات من الكاشف مختارة و 100 ميكرولترات من المياه فائقة الpure إلى 100 ميكرولترات من العينة والماصات الناتجة 0.6x اختيار الكاشف 15 مرة. بعد فترة حضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ضع العينة على المغناطيس حتى يصبح الحل واضحًا. نقل supernatant إلى أنبوب الربط المنخفض 1.5 ملليلتر لإنشاء مكتبة cDNA الباركود multixing.تذكر لحفظ كل من عظمى والقاعدة كما محتويات supernatant تجميع الباركود cDNA ومحتويات قاعدة cDNA الذاتية. تنظيف cDNA الذاتية مع 80٪ الإيثانول و elute الحمض النووي مع 40 ميكرولترات من عازلة elution، ثم تشغيل فحص مراقبة الجودة من cDNA الذاتية قبل إعداد مكتبة نسخة الذاتية. وينبغي تحديد كمية تركيزات ناو (cDNA) ونعتها قبل بناء المكتبة.كما ينبغي تحديد كمي المكتبات التي تم بناؤها، بما في ذلك مكتبات cDNA المحلية ومكتبات الباركود، قبل ترتيبها. بعد التسلسل، يمكن تحليل التعبير الباركود في كل خلية واحدة. على سبيل المثال، في هذا التحليل، لوحظت ثماني مجموعات من الخلايا المفردة التي عبّرت بشكل فريد عن نوع واحد من الباركود الذي يمثل خلايا من ثماني عينات مختلفة.بالإضافة إلى ذلك، لم تعبر بعض الخلايا عن أي الباركود وبالتالي تم تعريفها كخلايا سلبية، في حين عبرت خلايا أخرى عن شريطين باركود مختلفين يمثلان الزبلان. باستخدام الخلايا المفردة، يمكن تقييم التغاير الخلوي واللوائح الجزيئية حسب شرح نوع الخلية، وتحديد نوع الخلايا الجديد والنادرة، والتحليل المقارن للمنطقة التشريحية، وتحليل مسار علم الأنطولوجيا الجينية، مثل فصل مرحلة دورة الخلية. من المفيد أن تصور حبات الجل في مستحلب إذا كنت تستطيع ، حيث أن صورة ستخبرك ما إذا كان الإجراء قد نجح حتى هذه النقطة أم لا.يضيف تعدد الالنماذج مرونة كبيرة في تصميم تجاربك. بعد مشاهدة هذه المظاهرة، آمل أن تكون أكثر ثقة حول بدء تجاربك الخاصة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...