Name: multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Vi takker David M. Patterson og Christopher S. McGinnis fra Dr. ZEV J. gartner Lab for deres slags levering af de lipid-baserede barkodnings reagenser og forslag til eksperimentelle trin og dataanalyse. Dette arbejde blev grundlagt af National Institutes of Health (HL13347202).

Den animalske procedure er i overensstemmelse med University of Pittsburgh det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC).
1. mus embryonale hjerte dissektion og enkelt celle suspension forberedelse
Bemærk: dette trin kan tage et par timer afhængigt af antallet af embryoner til dissekere.
<ol><li>For at erhverve e 18.5 embryonale hjerter, aflive en gravid CD1-mus ved co2 administration. Brug en barberkniv til at fjerne uønsket hår ...

<ol>
	<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).</li><li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution.">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li><li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development.">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development.">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476 (2019).</li><li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart.">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte.">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100 (2017).</li><li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies.">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367 (2018).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).</li><li>Gr&#252;n, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments.">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).</li><li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq.">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep</a> (2018)</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>. Agilent 4200 TapeStation System Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf</a> (2019)</li><li>. SPRIselect User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf">https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf</a> (2012)</li><li>. Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf</a> (2018)</li><li>. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf</a> (2016)</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).</li><li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly.">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li><li>. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep</a> (2017)</li></ol>

I denne undersøgelse har vi demonstreret en protokol til at analysere enkelt celle transkriptionelle profiler. Vi har også givet to fakultative metoder til multiplex-prøver i arbejdsgangen for scRNA-SEQ. Begge metoder har vist sig at være gennemførlige på forskellige laboratorier og leverede løsninger til at køre en omkostningseffektiv og batch effekt-gratis enkelt celle eksperiment18,26.
Der er et par skridt, der bør følges ...

Den transkriptionelle profil af hver enkelt celle varierer blandt cellepopulationer under fosterudviklingen. Selv om en enkelt Molekylær in situ-hybridisering kan bruges til at visualisere et lille antal gener1, giver enkelt celle mRNA-sekventering (scrna-SEQ) en upartisk tilgang til at illustrere Genome-dækkende udtryks mønstre af gener i enkeltceller. Efter at det først blev offentliggjort i 20092, er scrna-SEQ blevet anvendt til at studere flere væv på flere udviklingsmæssige stadier i de seneste år3,4,5. Også, som den menneskelige celle Atlas har lanceret sine udviklingsorienterede projekter for nylig, mere enkelt celledata fra humane embryonale væv forventes at blive genereret i den nærmeste fremtid.
Hjertet som det første organ til at udvikle spiller en afgørende rolle i fosterudviklingen. Hjertet består af flere celletyper og udviklingen af hver celletype er stramt reguleret tidsmæssigt og rumligt. I løbet af de sidste par år, oprindelse og celle Lineage af hjerte celler på tidlige udviklingsmæssige stadier har været karakteriseret6, som giver en enorm nyttig navigation værktøj til at forstå medfødt hjertesygdomme patogenese, samt for at udvikle mere teknologisk avancerede metoder til at stimulere kardiomyocyte Regeneration7.
Scrna-SEQ har gennemgået en hurtig ekspansion i de seneste år8,9,10. Med de nyudviklede metoder er design og analyse af enkelt celle eksperimenter blevet mere opnåelige11,12,13,14. Den metode, der præsenteres her, er en kommerciel procedure baseret på dråbe opløsninger (Se tabel over materialer)15,16. Denne metode har indfangning af celler og sæt af unikt barkodede perler i en olie-vand emulsion dråbe under kontrol af et mikrofluidisk controller system. Hastigheden af celle indlæsning i dråberne er ekstremt lav, så størstedelen af dråbe emulsioner indeholder kun én celle17. Procedurens geniale design kommer fra enkelt celleseparation til dråbe emulsioner, der opstår samtidig med barkodning, hvilket muliggør parallel analyse af individuelle celler ved hjælp af RNA-SEQ på en heterogen population.
Inkorporering af multiplexing strategier er en af de vigtige Tilføjelser til den traditionelle enkelt celle workflow13,14. Denne tilføjelse er meget nyttig i kassere celle doublets, reducere eksperimentelle omkostninger, og eliminere batch effekter18,19. En lipid-baseret barkodnings strategi og en antistof baseret barkodnings strategi (Se tabel over materialer) er de to mest anvendte multiplexing metoder. Specifikke stregkoder bruges til at mærke hver prøve i begge metoder, og de mærkede prøver blandes derefter for enkelt celle optagelse, biblioteks forberedelse og sekvensering. Bagefter kan de samlede sekvensering data adskilles ved at analysere stregkode sekvenser (figur 1)19. Der er dog betydelige forskelle mellem de to metoder. Den lipid-baserede barkodnings strategi er baseret på lipid-modificerede oligonukleotider, som ikke er blevet fundet at have nogen celletype præferencer. Mens antistof baseret barkodnings strategi kun kan detektere cellerne, som udtrykker antigen proteiner19,20. Derudover tager det ca. 10 minutter at plette lipiderne, men 40 min for at plette antistofferne (figur 1). Desuden er de lipid-modificerede oligonukleotider billigere end antistof-konjugeret oligonukleotider, men ikke kommercielt tilgængelige på tidspunktet for skrivning af denne artikel. Endelig, den lipid-baserede strategi kan multiplex 96 prøver i et eksperiment, men den antistof-baserede strategi i øjeblikket kun kan multiplex 12 prøver.
Det anbefalede celle nummer til multiplex i et enkelt eksperiment bør være lavere end 2,5 x 104, ellers vil det føre til en høj procentdel af celle form og potentiel omgivende mRNA-kontaminering. Gennem multiplexing strategier, omkostningerne ved enkelt celle indfangning, cDNA generation, og bibliotek forberedelse til flere prøver vil blive reduceret til omkostningerne ved en prøve, men sekventering omkostninger vil forblive den samme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120252 330019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium Controller</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250 230003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>330002, 120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Clip</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120253 230002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>25 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Chales River</td>
			<td>Strain Code 022</td>
			<td>ordered pregnant mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424R</td>
			<td>Appendorf</td>
			<td>2231000214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000073</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM Kit v3,4 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000094</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; Library Kit v3</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000095</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; v3 Gel Beads</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000059</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>11088807001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000048</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661020N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661000N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi Cell Strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td>Porosity 40 &#956;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td>Add 5 &#181;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &#181;l staining volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (IPA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0295239</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 4-pack (0.1&#8211;2.5&#956;L, 0.5-10&#956;L, 10&#8211;100&#956;L, 100&#8211;1,000&#956;L variable-volume pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318 (60ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template Switch Oligo</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>3000228</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Master Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The cell browser is Loup Cell Browser</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The well maintained R platform is Seurat V3</td>
			<td>satijalab</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-3710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155801</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155803</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155805</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq RPI primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells

Enkelt celle mRNA sekventering har gjort betydelige fremskridt i de sidste mange år og er blevet et vigtigt redskab inden for udviklingsmæssige biologi. Det er blevet brugt med succes til at identificere sjældne cellepopulationer, opdage nye markørgener, og afkode rumlige og tidsmæssige udviklingsmæssige oplysninger. Den enkelt celle metode har også udviklet sig fra den mikrofluidisk baseret fluidigm C1-teknologi til de droplet-baserede løsninger i de sidste to til tre år. Her brugte vi hjertet som et eksempel til at demonstrere, hvordan man profilere mus embryonale vævsceller ved hjælp af dråbe baseret scRNA-SEQ metode. Derudover har vi integreret to strategier i arbejdsprocessen for at profilere flere prøver i et enkelt eksperiment. Ved hjælp af en af de integrerede metoder, vi har samtidig profileret mere end 9.000 celler fra otte hjerte prøver. Disse metoder vil være værdifulde for udviklingsbiologi felt ved at give en omkostningseffektivmåde at samtidig profilere enkeltceller fra forskellige genetiske baggrunde, udviklingsmæssige stadier, eller anatomiske steder.

I denne undersøgelse brugte vi mus embryonale hjerte som et eksempel til at udstille hvordan multiplexed enkelt celle mRNA sekventering blev udført for at behandle de forskellige prøver fra separate dele af et organ samtidigt. E 18.5 CD1 mus hjerter blev isoleret og dissekeret i venstre atrium (LA), højre atrium (RA), venstre ventrikel (LV) og højre ventrikel (RV). De atriale og ventrikulære celler blev derefter barkodet selvstændigt ved hjælp af en lipid-baserede barkodnings proc...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Her præsenterede vi en multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering metode til profil genekspression i mus embryonale væv. Den droplet-baserede enkelt celle mRNA sekventering (scrna-SEQ) metode i kombination med multiplexing strategier kan profilere enkeltceller fra flere prøver samtidigt, hvilket reducerer reagens omkostningerne betydeligt og minimerer eksperimentelle batch effekter.

Multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering analyse af mus embryonale celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Enkeltcelle mRNA sekventering er almindeligt anvendt til at forstå de biologiske processer på et enkelt celleniveau. Fremkomsten af multiplexing strategier har yderligere udvidet sine forstærkninger ved at tillade profilering af flere prøver i et enkelt eksperiment, dramatisk reducere omkostningerne og undgå batch effekter. Demonstration af proceduren vil være Wei Feng, en postdoc, og Andrew Przysinda, en tekniker fra mit laboratorium.Efter optælling opdeles cellerne isoleret fra embryonal dag 18,5 hjertekamre i fem gange 10 til den femte aliquots og vask cellerne to gange med frisk PBS pr vask. Opslæm pellets i 180 mikroliter PBS pr. prøve og tilsæt 20 mikroliter anker stregkode lager opløsning til hvert rør med blid blanding. Efter fem minutters inkubation på is tilsættes 20 mikroliter med co-anchor stregkode stock opløsning til hvert rør med blid blanding i yderligere fem minutters inkubation på is, før du vasker cellerne tre gange med en milliliter kold PBS suppleret med 1% kvæg serumalbumin per vask, derefter filtrere prøverne i nye rør gennem en 40-mikrometer celle si per rør.Efter optælling, samle chip B i en chip holder, derefter tilføje 75 mikroliter af en 50% glycerol løsning til de ubrugte brønde i række et, 40 mikroliter til de ubrugte brønde i række to, og 280 mikroliter til de ubrugte brønde i række tre. Bemærk, at der bruges en træningschip her til at demonstrere proceduren. Tilsæt passende volumen af celle suspension og nuklease-fri vand til master mix med blid pipettering.Tilføj 75 mikroliter af den resulterende celleopløsning til det nederste midten af prøven godt i række et uden bobler. Vortex gel perlerne i 30 sekunder, før langsomt at tilføje 40 mikroliter af perler til det nederste midten af gelperlen godt i række to uden bobler. Tilføj 280 mikroliter af partitionering olie ned sidevæggen af partitionering olie godt i række tre.Fastgør pakningen til spånen uden at trykke ned på pakningen og holde pakningen vandret for at undgå at befugte pakningen. Den samlede spån aflæsses med pakningen i kromregulatoren, og kør krom enkeltcelle B-programmet. Bemærk, at skærmen viser krom træning for uddannelse chip, men for de virkelige eksperimenter skærmen vil vise krom enkelt celle B.Når programmet er afsluttet, straks fjerne chippen og kassér pakningen.Fold låget tilbage for at eksponere brøndene i en 45-graders vinkel og kontrollere væskeniveauerne for at sikre, at der ikke er træsko til stede. Langsomt aspirere 100 mikroliter gel perler i emulsion fra de laveste punkter i opsvinget godt og kontrollere ensartethed perlerne. Dispenser de emulgeret perler ned ad væggen i et nyt PCR-rør på is og læg røret i en termisk cycler til omvendt transskription.For at forberede cDNA til forstærkning skal der tilsættes 125 mikroliter genvindingsagent til prøven ved stuetemperatur. Der må ikke observeres uigennemsigtig væske, og der må ikke undgås pipettering eller hvirvlende. Vent 60 sekunder, før langsomt at fjerne genvindingsmidlet fra bunden af røret og tilsæt 200 mikroliter af vortex perle oprydning blandingen til prøven.Pipette blandingen 10 gange før inkubering i 10 minutter ved stuetemperatur. Dernæst placere prøverne på en magnet i høj position. Når opløsningen ryddes, skal du fjerne supernatanten og tilsætte 200 mikroliter på 80% ethanol til pellet.Efter 30 sekunder fjernes ethanolen, og vasken gentages to gange mere. Efter den sidste vask skal prøven centrifuges kortvarigt, og røret anbringes på magneten i lav position, så prøven kan lufttørres i mindre end to minutter. Når prøven er tørret, fjernes røret fra magneten, og der tilsættes 35,5 mikroliter frisklavet opløsning.Efter to minutters inkubation ved stuetemperatur anbringes prøven på magneten i høj position, indtil opløsningen er klar, før 35 mikroliter af prøven overføres til en ny slangestrimmel. Til cDNA-forstærkning ved hjælp af den lipidbaserede stregkodestrategi tilsættes forstærkningsreaktionsblandingen til 35-mikroliter-cDNA-prøverne med grundig blanding, før den kortvarigt centrifugeres. Ved afslutningen af centrifuger prøven i den termiske cycler efter den relevante cDNA-forstærkningsprocedure.Der tilsættes 120 mikroliter udvalgte reagenser og 100 mikroliter ultrarent vand til 100 mikroliter af prøven, og der pipettes den resulterende 0,6 x udvalgte reagens 15 gange. Efter fem minutters inkubation ved stuetemperatur anbringes prøven på magneten, indtil opløsningen bliver klar. Overfør supernatanten til et 1,5 milliliter lavbindingsrør til multiplexing stregkodet cDNA bibliotekskonstruktion.Husk at gemme både supernatanterne og basen, når supernatantens indhold samler stregkodet cDNA og basisindholdet endogen cDNA. Rengør den endogene cDNA med 80% ethanol og eluter DNA'et med 40 mikroliter af elution buffer, og kør derefter en kvalitetskontrol af den endogene cDNA, før du forbereder en endogen udskrift bibliotek. CDNA-koncentrationen skal kvantificeres og kvalificeres før bibliotekskonstruktionen.De konstruerede biblioteker, herunder de endogene cDNA- og stregkodebiblioteker, bør også kvantificeres og kvalificeres inden sekvensering. Efter sekvensering kan stregkodeudtrykket analyseres i hver enkelt celle. For eksempel blev der i denne analyse observeret otte grupper af enkelte celler, der entydigt udtrykte en type stregkode, der repræsenterer celler fra otte forskellige prøver.Desuden udtrykte nogle celler ingen stregkode og blev derfor defineret som negative celler, mens andre celler udtrykte to forskellige stregkoder, der repræsenterede doublets. Ved hjælp af singlet celler, den cellulære heterogenitet og molekylære regler kunne vurderes efter celletype anmærkning, nye og sjældne celletype identifikation, anatomiske zone sammenlignende analyse, og gen ontologi vej analyse, såsom celle cyklus fase separationer. Det er nyttigt at forestille gel perler i emulsion, hvis du kan, som et billede vil fortælle dig, om proceduren har været en succes op til dette punkt.Eksempelekspografien giver stor fleksibilitet i udformningen af dine eksperimenter. Efter at have set denne demonstration, håber jeg du vil være mere sikker på at starte dine egne eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 Mediated monoallelisk Sletninger til Studieinformationen Enhancer funktion i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering af murint embryonale Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared Embryonale og postnatal hjerter på Single-celle Opløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse af retinoidsyre-induceret Neural Differentiation af muse embryonale stamceller i to og tre-dimensionelle embryoide legemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonede analyse af embryonale hæmatopoietisk stamcelle prækursorer ved hjælp af enkelt celle indeks sortering kombineret med endotel celle Niche Co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Encellede transkriptom analyser af mus i bugspytkirtlen endokrine celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurale differentiering ved hjælp af enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...