Name: multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Wir danken David M. Patterson und Christopher S. McGinnis vom Labor Dr. Zev J. Gartner für ihre Art und Weise der Bereitstellung der lipidbasierten Barcoding-Reagenzien und Vorschläge zu den experimentellen Schritten und der Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (HL13347202) gegründet.

Das Tierverfahren entspricht dem Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der University of Pittsburgh (IACUC).
1. Maus Embryonale Herzsektion und Einzelzellsuspension Separpreparation
HINWEIS: Dieser Schritt kann je nach Anzahl der zu sezierenden Embryonen einige Stunden dauern.
<ol><li>Um E18.5 embryonale Herzen zu erwerben, einschläfern Sie eine schwangere CD1-Maus durchCO2-Verabreichung. Verwenden Sie ein Rasiermesser, um die unerwünscht...

<ol>
	<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).</li><li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep</a> (2018)</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>. Agilent 4200 TapeStation System Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf</a> (2019)</li><li>. SPRIselect User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf">https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf</a> (2012)</li><li>. Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf</a> (2018)</li><li>. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf</a> (2016)</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).</li><li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly.">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li><li>. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep</a> (2017)</li></ol>

In dieser Studie haben wir ein Protokoll zur Analyse von einzelzelligen Transkriptionsprofilen demonstriert. Wir haben auch zwei optionale Methoden für Multiplex-Proben im scRNA-Seq-Workflow bereitgestellt. Beide Methoden haben sich in verschiedenen Labors als machbar erwiesen und Lösungen für ein kostengünstiges und batcheffektfreies Einzelzellexperiment18,26geliefert.
Es gibt ein paar Schritte, die sorgfältig befolgt werden soll...

Das Transkriptionsprofil jeder einzelnen Zelle variiert zwischen den Zellpopulationen während der embryonalen Entwicklung. Obwohl die einzelne molekulare In-situ-Hybridisierung verwendet werden kann, um die Expression einer kleinen Anzahl von Genen1zu visualisieren, bietet die einzellige mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) einen unvoreingenommenen Ansatz zur Veranschaulichung genomweiter Expressionsmuster von Genen in Einzelzellen. Nach der erstveröffentlichung im Jahr 20092wurde scRNA-Seq in den letzten Jahren zur Untersuchung mehrerer Gewebe in mehreren Entwicklungsstadienangewendet 3,4,5. Da der Atlas der menschlichen Zellen in jüngster Zeit seine entwicklungsorientierten Projekte gestartet hat, werden in naher Zukunft weitere Einzelzelldaten aus menschlichen embryonalen Geweben erwartet.
Das Herz als erstes Organ, das sich entwickelt, spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung. Das Herz besteht aus mehreren Zelltypen und die Entwicklung jedes Zelltyps ist zeitlich und räumlich streng reguliert. In den letzten Jahren wurden der Ursprung und die Zellabstammung von Herzzellen in frühen Entwicklungsstadien charakterisiert6, die ein enormes nützliches Navigationswerkzeug für das Verständnis der angeborenen Krankheitspathogenese bieten, sowie für die Entwicklung technologisch fortschrittlicherer Methoden zur Stimulierung der Kardiomyozytenregeneration7.
Der scRNA-Seq hat sich in den letzten Jahren rasant erweitert8,9,10. Mit den neu entwickelten Methoden ist design und analysis of single cell experiments um11,12,13,14erreichbarer geworden. Die hier vorgestellte Methode ist ein kommerzielles Verfahren, das auf den Tröpfchenlösungen basiert (siehe Materialtabelle)15,16. Diese Methode verfügt über die Erfassung von Zellen und Sets von eindeutig barcoded Perlen in einem Öl-Wasser-Emulsionströpfchen unter der Kontrolle eines mikrofluidischen Steuerungssystems. Die Rate der Zellbelastung in die Tröpfchen ist extrem niedrig, so dass die Mehrheit der Tröpfchenemulsionen nur eine Zelle17enthält. Das ausgeklügelte Design des Verfahrens ergibt sich aus der Einzelzelltrennung in Tröpfchenemulsionen, die gleichzeitig mit Barcoding auftreten, was die parallele Analyse einzelner Zellen mit RNA-Seq an einer heterogenen Population ermöglicht.
Die Integration von Multiplexing-Strategien ist eine der wichtigen Ergänzungen des traditionellen Einzelzell-Workflows13,14. Diese Ergänzung ist sehr nützlich, um Zelldoublets zu verwerfen, die experimentellen Kosten zu senken und Batcheffekte zu eliminieren18,19. Eine lipidbasierte Barcoding-Strategie und eine Antikörper-basierte Barcoding-Strategie (siehe Tabelle der Materialien) sind die beiden meist verwendeten Multiplexing-Methoden. Bestimmte Barcodes werden verwendet, um jedes Beispiel in beiden Methoden zu beschriften, und die beschrifteten Proben werden dann für die Einzelzellenerfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung gemischt. Anschließend können die gepoolten Sequenzierungsdaten durch Analyse der Barcodesequenzen getrennt werden (Abbildung 1)19. Zwischen den beiden Methoden bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Die lipidbasierte Barcoding-Strategie basiert auf lipidmodifizierten Oligonukleotiden, die keine Zelltyppräferenzen haben. Während die Antikörper-basierte Barcoding-Strategie kann nur die Zellen, die die Antigen-Proteine19,20. Darüber hinaus dauert es etwa 10 min, um die Lipide zu färben, aber 40 min, um die Antikörper zu färben (Abbildung 1). Darüber hinaus sind die lipidmodifizierten Oligonukleotide billiger als antikörperkonjugierte Oligonukleotide, aber zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels nicht kommerziell erhältlich. Schließlich kann die Lipid-basierte Strategie 96-Proben in einem Experiment multiplexen, aber die Antikörper-basierte Strategie kann derzeit nur Multiplex 12 Proben.
Die empfohlene Zellzahl zum Multiplex in einem einzigen Experiment sollte niedriger als 2,5 x 104sein, da sie andernfalls zu einem hohen Anteil an Zelldoublets und einer potenziellen mRNA-Kontamination in der Umgebung führt. Durch die Multiplexing-Strategien werden die Kosten für die Einzelzellerfassung, cDNA-Generierung und Bibliotheksvorbereitung für mehrere Samples auf die Kosten für eine Probe reduziert, aber die Sequenzierungskosten bleiben gleich.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120252 330019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium Controller</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250 230003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>330002, 120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Clip</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120253 230002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>25 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Chales River</td>
			<td>Strain Code 022</td>
			<td>ordered pregnant mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424R</td>
			<td>Appendorf</td>
			<td>2231000214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000073</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM Kit v3,4 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000094</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; Library Kit v3</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000095</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; v3 Gel Beads</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000059</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>11088807001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000048</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661020N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661000N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi Cell Strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td>Porosity 40 &#956;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td>Add 5 &#181;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &#181;l staining volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (IPA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0295239</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 4-pack (0.1&#8211;2.5&#956;L, 0.5-10&#956;L, 10&#8211;100&#956;L, 100&#8211;1,000&#956;L variable-volume pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318 (60ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template Switch Oligo</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>3000228</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Master Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The cell browser is Loup Cell Browser</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The well maintained R platform is Seurat V3</td>
			<td>satijalab</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-3710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155801</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155803</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155805</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq RPI primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells

Die einzellige mRNA-Sequenzierung hat in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einem wichtigen Instrument auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie geworden. Es wurde erfolgreich verwendet, um seltene Zellpopulationen zu identifizieren, neue Markergene zu entdecken und räumliche und zeitliche Entwicklungsinformationen zu entschlüsseln. Die Einzelzellmethode hat sich in den letzten zwei bis drei Jahren auch von der mikrofluidischen Fluidigm C1-Technologie zu den Tropfen-basierten Lösungen entwickelt. Hier haben wir das Herz als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie man die embryonalen Gewebezellen der Maus mit der tröpfchenbasierten scRNA-Seq-Methode profiliert. Darüber hinaus haben wir zwei Strategien in den Workflow integriert, um mehrere Samples in einem einzigen Experiment zu profilieren. Mit einer der integrierten Methoden haben wir gleichzeitig mehr als 9.000 Zellen aus acht Herzproben profiliert. Diese Methoden werden für den Bereich der Entwicklungsbiologie wertvoll sein, indem sie eine kostengünstige Möglichkeit bieten, einzelne Zellen aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen, Entwicklungsstadien oder anatomischen Orten gleichzeitig zu profilieren.

In dieser Studie verwendeten wir mausembryonales Herz als Beispiel, um zu zeigen, wie multiplexierte einzelzellige mRNA-Sequenzierung durchgeführt wurde, um die verschiedenen Proben aus separaten Teilen eines Organs gleichzeitig zu verarbeiten. E18.5 CD1 Mausherzen wurden isoliert und in linkes Atrium (LA), rechtes Atrium (RA), linke Herzkammer (LV) und rechte Herzkammer (RV) seziert. Die vorgerichtlichen und ventrikulären Zellen wurden dann unabhängig mit einem lipidbasierten Barcodin...

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Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Die mRNA-Sequenzierung mit einzelligen Zellen wird häufig verwendet, um die biologischen Prozesse auf einer einzelnen Zellebene zu verstehen. Das Aufkommen von Multiplexing-Strategien hat seine Amplifikationen weiter erweitert, indem es die Profilerstellung mehrerer Proben in einem einzigen Experiment ermöglicht, die Kosten drastisch reduziert und die Batch-Effekte vermieden hat. Demonstriert wird das Verfahren von Wei Feng, einem Postdoc, und Andrew Przysinda, einem Techniker aus meinem Labor.Nach dem Zählen die zellenisoliert vom embryonalen Tag 18,5 Herzkammern in fünf mal 10 bis die fünften Aliquoten und waschen Sie die Zellen zweimal mit frischen PBS pro Wäsche. Setzen Sie die Pellets in 180 Mikroliter PBS pro Probe wieder auf und fügen Sie 20 Mikroliter Anker-Barcode-Lagerlösung zu jedem Rohr mit sanftem Mischen hinzu. Nach einer fünfminütigen Inkubation auf Eis 20 Mikroliter Co-Anchor Barcode Stock Lösung zu jedem Rohr mit sanfter Mischung für eine zusätzliche fünfminütige Inkubation auf Eis hinzufügen, bevor Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter kalten PBS mit 1% Rinderserumalbumin pro Wäsche waschen, dann filtern Sie die Proben in neue Röhren durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb pro Tube.Nach dem Zählen Chip B zu einem Spanhalter zusammenbauen und dann 75 Mikroliter einer 50%glyzerinlösung in die ungenutzten Brunnen in Reihe eins, 40 Mikroliter zu den ungenutzten Brunnen in Reihe zwei und 280 Mikroliter zu den ungenutzten Brunnen in Reihe drei hinzufügen. Beachten Sie, dass hier ein Trainingschip verwendet wird, um das Verfahren zu demonstrieren. Fügen Sie das entsprechende Volumen von Zellsuspension und nukleasefreiem Wasser in die Master-Mischung mit sanfter Pipettierung.Fügen Sie 75 Mikroliter der resultierenden Zelllösung in die untere Mitte der Probe gut in Reihe eins ohne Blasen. Wirbeln Sie die Gelperlen für 30 Sekunden, bevor Sie langsam 40 Mikroliter Perlen in die untere Mitte der Gelperle gut in Reihe zwei ohne Blasen hinzufügen. Fügen Sie 280 Mikroliter Trennöl die Seitenwand des Trennölbrunnens in Reihe drei hinzu.Befestigen Sie die Dichtung am Chip, ohne auf die Dichtung zu drücken und die Dichtung horizontal zu halten, um eine Benetzung der Dichtung zu vermeiden. Laden Sie den montierten Chip mit der Dichtung in den Chromregler und führen Sie das Chrom-Einzelzellen-B-Programm aus. Beachten Sie, dass der Bildschirm Chrom-Training für den Trainingschip zeigt, aber für die realen Experimente wird der Bildschirm Chrom-Einzelzelle B anzeigen. Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie sofort den Chip und entsorgen Sie die Dichtung.Falten Sie den Deckel zurück, um die Brunnen in einem 45-Grad-Winkel freizulegen, und überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen vorhanden sind. Langsam 100 Mikroliter Gelperlen in Emulsion von den tiefsten Punkten der Erholung gut aspirieren und die Gleichmäßigkeit der Perlen überprüfen. Geben Sie die emulgierten Perlen an der Wand eines neuen PCR-Rohrs auf Eis und legen Sie das Rohr in einen thermischen Cycler für die umgekehrte Transkription.Um die cDNA für die Amplifikation vorzubereiten, fügen Sie der Probe 125 Mikroliter Wiederherstellungsmittel bei Raumtemperatur hinzu. Es sollte keine undurchsichtige Flüssigkeit beobachtet werden und Pipettieren oder Wirbel vermeiden. Warten Sie 60 Sekunden, bevor Sie das Wiederherstellungsmittel langsam von der Unterseite des Rohres entfernen und 200 Mikroliter Wirbelperlen-Reinigungsmischung in die Probe geben.Pipette die Mischung 10 Mal vor der Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes legen Sie die Proben auf einen Magneten in der hohen Position. Wenn die Lösung abläuft, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 200 Mikroliter 80% Ethanol hinzu.Nach 30 Sekunden das Ethanol entfernen und das Waschen zwei weitere Male wiederholen. Nach der letzten Wäsche die Probe kurz zentrifugieren und das Rohr auf den Magneten in die niedrige Position legen, damit die Probe weniger als zwei Minuten trocknen kann. Wenn die Probe getrocknet ist, entfernen Sie das Rohr vom Magneten und fügen Sie 35,5 Mikroliter frisch zubereitete Elutionslösung hinzu.Legen Sie die Probe nach einer zweiminütigen Inkubation bei Raumtemperatur in die hohe Position des Magneten, bis sich die Lösung entfernt, bevor Sie 35 Mikroliter der Probe auf einen neuen Rohrstreifen übertragen. Zur cDNA-Verstärkung mit der lipidbasierten Barcoding-Strategie fügen Sie den 35-Mikroliter-cDNA-Proben eine Amplifikationsreaktionsmischung mit gründlicher Durchmischung vor der kurzen Zentrifugierung hinzu. Am Ende des Spins die Probe im thermischen Cycler nach dem entsprechenden cDNA-Amplifikationsverfahren inkubieren.Fügen Sie 120 Mikroliter ausgewähltere Reagenz und 100 Mikroliter Reinstwasser zu 100 Mikroliter Probe und Pipette das resultierende 0,6x ausgewählte Reagenz 15 Mal. Legen Sie die Probe nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur auf den Magneten, bis die Lösung klar wird. Übertragen Sie den Überstand auf ein 1,5-Milliliter-Low-Bind-Rohr für Multiplexing-Barcode-cDNA-Bibliotheksbau.Denken Sie daran, sowohl die Überstandals als auch die Basis zu speichern, da der Inhalt des Überstandes barcoded cDNA und den Grundinhalt endogene cDNA zusammensetzt. Reinigen Sie die endogene cDNA mit 80% Ethanol und löschen Sie die DNA mit 40 MikroliterElutionspuffer, und führen Sie dann eine Qualitätskontrolle der endogenen cDNA durch, bevor Sie eine endogene Transkriptbibliothek vorbereiten. Die cDNA-Konzentration sollte vor dem Bibliotheksbau quantifiziert und qualifiziert werden.Die konstruierten Bibliotheken, einschließlich der endogenen cDNA- und Barcode-Bibliotheken, sollten ebenfalls vor der Sequenzierung quantifiziert und qualifiziert werden. Nach der Sequenzierung kann der Barcodeausdruck in jeder einzelnen Zelle analysiert werden. In dieser Analyse wurden beispielsweise acht Gruppen von Einzelzellen beobachtet, die eindeutig einen Barcodetyp aus acht verschiedenen Proben exprimierten.Darüber hinaus drückten einige Zellen keinen Barcode aus und wurden daher als negative Zellen definiert, während andere Zellen zwei verschiedene Barcodes ausdrückten, die Doublets darstellten. Anhand der Einzelzellen könnten die zelluläre Heterogenität und die molekularen Vorschriften anhand von Zelltyp-Anmerkungen, neuartiger und seltener Zelltyp-Identifikation, anatomischer Zonenvergleichsanalyse und Genontologie-Pfadanalyse, wie z. B. Zellzyklusphasentrennungen, beurteilt werden. Es ist hilfreich, die Gelperlen in Emulsion abzubilden, wenn Sie können, wie ein Bild Ihnen sagen wird, ob das Verfahren bis zu diesem Zeitpunkt erfolgreich war oder nicht.Das Beispielmultiplexing bietet eine große Flexibilität beim Entwerfen Ihrer Experimente. Nachdem Sie sich diese Demonstration angeschaut haben, hoffe ich, dass Sie zuversichtlicher sein werden, Ihre eigenen Experimente zu starten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...