Name: multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

אנו מודים לדוד מ. פטרסון וכריסטופר ס. מק מ ד ר זאב ג. גרטנר מעבדה עבור האספקה האדיבה שלהם של ריאגנטים barcoding מבוסס ליפיד והצעות על שלבים ניסיוניים ניתוח נתונים. עבודה זו נוסדה על ידי המכון הלאומי לבריאות (HL13347202).

נוהל בעלי חיים הוא בהתאם לטיפול באוניברסיטת פיטסבורג בעלי חיים מוסדיים והוועדה השימוש (IACUC).
1. עכבר לנתיחה עובריים והשעיה תא יחיד הכנה
הערה: שלב זה עשוי להימשך מספר שעות, בהתאם למספר העוברים לנתח.
<ol><li>כדי לרכוש את E 29.8 לבבות עובריים, המתת החסד עכבר CD1 בהריון על ...

<ol>
	<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).</li><li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution.">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li><li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development.">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development.">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476 (2019).</li><li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart.">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte.">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100 (2017).</li><li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies.">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367 (2018).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).</li><li>Gr&#252;n, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments.">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).</li><li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq.">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep</a> (2018)</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>. Agilent 4200 TapeStation System Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf</a> (2019)</li><li>. SPRIselect User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf">https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf</a> (2012)</li><li>. Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf</a> (2018)</li><li>. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf</a> (2016)</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).</li><li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly.">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li><li>. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep</a> (2017)</li></ol>

במחקר זה, הדגמנו פרוטוקול כדי לנתח פרופילים תא יחיד הטרנססקריפט. כמו כן, סיפקנו שתי שיטות אופציונליות לדוגמיות של מולטיפלקס בזרימת העבודה scRNA-Seq. שתי השיטות הוכיחו להיות ריאלי במעבדות שונות סיפק פתרונות כדי להפעיל את הניסוי חסכוני ואצווה ללא אפקט תא יחיד18,26....

הפרופיל של כל תא בודד משתנה בין אוכלוסיות תאים במהלך התפתחות מעובדיות. למרות מולקולרי אחד באתרו היברידיזציה ניתן להשתמש כדי להמחיש את הביטוי של מספר קטן של גנים1, רצף mrna תא יחיד (ScRNA-Seq) מספק גישה משוחדת כדי להמחיש דפוסי ביטוי הגנום רחב של גנים בתאים בודדים. לאחר שפורסם לראשונה ב 20092, scRNA-Seq חלה לחקור רקמות מרובות בשלבים התפתחותיים מרובים בשנים האחרונות3,4,5. כמו כן, כמו אטלס התא האנושי השיקה פרויקטים התפתחותיים שלה ממוקדת לאחרונה, יותר נתונים תא בודד מרקמות עובריים אנושיים צפויים להיווצר בעתיד הקרוב.
הלב כמו האיבר הראשון לפתח משחק תפקיד קריטי בהתפתחות עובריים. הלב מורכב מסוגי תאים מרובים והתפתחות של כל סוג תא מוסדר באופן הדוק באופן זמני ו spatially. במהלך השנים האחרונות, המקור ואת שושלת התאים של תאי לב בשלבים התפתחותיים מוקדם כבר מאופיין6, אשר לספק כלי ניווט שימושי עצום להבנת מחלת לב מולדים פתוגנזה, כמו גם לפיתוח שיטות מתקדמות יותר מבחינה טכנולוגית כדי לעורר התחדשות הקרדיוציט7.
ScRNA-Seq עברה התרחבות מהירה בשנים האחרונות8,9,10. עם שיטות שפותחו לאחרונה, עיצוב וניתוח של ניסויים תא בודד הפך השגה יותר11,12,13,14. השיטה המוצגת כאן היא הליך מסחרי המבוסס על פתרונות ה-droplet (ראה טבלת חומרים)15,16. שיטה זו כוללת לכידת תאים וסטים של חרוזי ברקודים ייחודיים ב-droplet של מי השמן, שתחת שליטה של מערכת בקרי מיקרו-פלואידיג. שיעור הטעינה של התאים בטיפות נמוך מאוד כך שרוב האמולסיות של droplet מכילים תא אחד בלבד17. העיצוב הגאוני של התהליך מגיע מהפרדה בין תאים בודדים לאמולסיות של droplet המתרחשים בו זמנית עם ברקוד, המאפשר ניתוח מקבילי של תאים בודדים באמצעות RNA-Seq באוכלוסיה הטרוגנית.
התאגדות של אסטרטגיות ריבוב היא אחת התוספות החשובות לזרימת העבודה המסורתית תא13,14. תוספת זו שימושית מאוד בסילוק תא doublets, הפחתת עלויות נסיוניות וביטול אפקטים של אצווה18,19. אסטרטגיה בסיס השומנים המבוססת על מבוסס ואסטרטגיה ברקוד מבוסס נוגדן (ראה טבלת חומרים) הם שני שיטות ריבוב משומשים בעיקר. ברקודים ספציפיים משמשים לתווית כל מדגם בשתי השיטות, והדגימות שסומנו מעורבות לאחר מכן עבור לכידת תא בודד, הכנה לספריות ורצף. לאחר מכן, הנתונים ברצף במאגר יכול להיות מופרדים על ידי ניתוח רצפי ברקוד (איור 1)19. עם זאת, הבדלים משמעותיים קיימים בין שתי השיטות. אסטרטגיית barcoding המבוססת על השומנים מבוססת על olig, שעברו שינוי השומנים, אשר לא נמצא יש העדפות סוג תא כלשהו. בעוד אסטרטגיה ברקוד מבוסס הנוגדן יכול רק לזהות את התאים המבטאים את החלבונים אנטיגן19,20. בנוסף, זה לוקח בערך 10 דקות כדי להכתים את השומנים אבל 40 דקות כדי להכתים את הנוגדנים (איור 1). יתרה מזאת, הננו-שינויים המשומנים הינם זולים יותר מאשר מצובי נוגדנים בעלי מניות, אך לא זמין באופן מסחרי בזמן כתיבת מאמר זה. לבסוף, האסטרטגיה המבוססת על השומנים יכול להיות במגה 96 דגימות בניסוי אחד, אבל האסטרטגיה מבוסס נוגדן כרגע יכול רק מאחד 12 דגימות.
מספר התא המומלץ לקולנוע בניסוי בודד צריך להיות נמוך מ 2.5 x 104, אחרת, זה יוביל אחוז גבוה של תאים doublets וזיהום mrna הסביבה הפוטנציאלית. באמצעות אסטרטגיות ריבוב, העלות של תא בודד לכידת, cDNA דור, והכנה הספריה עבור מספר דגימות יופחת לעלות של מדגם אחד אבל העלות רצף יישאר זהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120252 330019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium Controller</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250 230003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>330002, 120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Clip</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120253 230002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>25 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Chales River</td>
			<td>Strain Code 022</td>
			<td>ordered pregnant mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424R</td>
			<td>Appendorf</td>
			<td>2231000214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000073</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM Kit v3,4 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000094</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; Library Kit v3</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000095</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; v3 Gel Beads</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000059</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>11088807001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000048</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661020N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661000N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi Cell Strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td>Porosity 40 &#956;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td>Add 5 &#181;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &#181;l staining volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (IPA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0295239</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 4-pack (0.1&#8211;2.5&#956;L, 0.5-10&#956;L, 10&#8211;100&#956;L, 100&#8211;1,000&#956;L variable-volume pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318 (60ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template Switch Oligo</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>3000228</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Master Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The cell browser is Loup Cell Browser</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The well maintained R platform is Seurat V3</td>
			<td>satijalab</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-3710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155801</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155803</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155805</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq RPI primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells

רצף mRNA תא יחיד עשה התקדמות משמעותית בשנים האחרונות והפך כלי חשוב בתחום הביולוגיה ההתפתחותית. הוא השתמש בהצלחה כדי לזהות אוכלוסיות תאים נדירות, לגלות גנים סמן הרומן, ולפענח מידע התפתחותי מרחבי וזמני. שיטת התאים הבודדת התפתחה גם מתוך הטכנולוגיה המבוססת על המיקרו-פלואידיק C1 לפתרונות מבוססי-droplet בשנתיים האחרונות עד שלוש שנים. כאן השתמשנו בלב כדוגמה כדי להדגים כיצד לפרופיל את התאים מתחלקים העכבר באמצעות השיטה scRNA-Seq מבוסס droplet. בנוסף, אנו משולבים שתי אסטרטגיות לתוך זרימת העבודה כדי לפרופיל דגימות מרובות בניסוי אחד. באמצעות אחת השיטות המשולבות, יש לנו בו פרופיל יותר מ 9,000 תאים משמונה דגימות לב. שיטות אלה יהיו בעלות ערך לתחום הביולוגיה ההתפתחותית על ידי מתן דרך חסכונית לפרופיל בו תאים בודדים מרקעים גנטיים שונים, שלבים התפתחותיים, או מיקומים אנטומיים.

במחקר זה, השתמשנו הלב העובריים העכבר כדוגמה להפגין כיצד מופרדים רצף mRNA תא יחיד בוצע כדי לעבד את דגימות שונות מחלקים נפרדים של איבר בו. E 29.8 CD1 לבבות העכבר היו מבודדים לגזור באטריום שמאל (LA), הימני אטריום (RA), החדר השמאלי (LV) ואת החדר הימני (RV). ואת התאים החדרית היו לאחר מכן ברקו ?...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

רצף mRNA של תא יחיד נמצא בשימוש נרחב כדי להבין את התהליכים הביולוגיים ברמת תא יחיד. הופעתן של אסטרטגיות multiplexing הרחיבה עוד יותר את ההגברות שלה על ידי מתן פרופיל של דגימות מרובות בניסוי אחד, הפחתת באופן דרמטי את העלות והימנעות אפקטי אצווה. הדגימה של ההליך תהיה וואי פנג, פוסט-דוק, ואנדרו פרזיינדה, טכנאי מהמעבדה שלי.לאחר הספירה, לפצל את התאים מבודדים מיום עוברי 18.5 תאי לב לחמש פעמים 10 כדי aliquots החמישי ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS טרי לכל לשטוף. תוכלו להשתמש מחדש ב-180 מיקרוליטרים של PBS לדגימה ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תווי ברקוד עוגן לכל צינור עם ערבוב עדין. לאחר דגירה של חמש דקות על קרח, הוסיפו 20 מיקרוליטר של פתרון מלאי ברקוד משותף לכל צינור עם ערבוב עדין להדגירה נוספת של חמש דקות על קרח לפני שאתם שוטפים את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS קר בתוספת אלבומין סרום 1%bovine לכל שטיפה, ואז לסנן את הדגימות לצינורות חדשים באמצעות מסננת תאים אחת של 40 מיקרומטר לכל צינור.לאחר הספירה, להרכיב שבב B לתוך מחזיק שבב, ולאחר מכן להוסיף 75 microliters של פתרון 50% גליצרול ל בארות שאינן שימוש בשורה אחת, 40 microliters ל בארות שאינן שימוש בשורה השנייה, ו 280 microliters ל בארות שאינן שימוש בשורה שלוש. שים לב כי שבב אימון משמש כאן כדי להדגים את ההליך. הוסיפו את הנפח המתאים של השעיית תאים ומים נטולי גרעין לתערובת האב עם צינורות עדינים.הוסף 75 microliters של פתרון התא וכתוצאה מכך למרכז התחתון של המדגם גם בשורה אחת ללא בועות. Vortex גם גם חרוזים ג'ל במשך 30 שניות לפני הוספת לאט 40 microliters של חרוזים למרכז התחתון של חרוזים ג'ל גם בשורה השנייה ללא בועות. הוסף 280 microliters של חלוקת שמן במורד הצד של שמן החלוקה גם בשורה שלוש.חבר את אטם לשבב מבלי ללחוץ על אטם ולשמור על אטם אופקית, כדי למנוע הרטבת אטם. טען את השבב שהורכב עם אטם בבקר הכרום והפעל את תוכנית הכרום יחיד תא B. שים לב כי המסך מראה אימון כרום עבור שבב האימון אבל עבור הניסויים האמיתיים המסך יציג כרום תא יחיד B.כאשר התוכנית הושלמה, מיד להסיר את השבב ולהשליך את אטם.מקפלים את המכסה לאחור כדי לחשוף את בארות בזווית של 45 מעלות ולבדוק את רמות הנוזלים כדי לוודא שאין כפכפים נוכחים. לאט לאט שאף 100 microliters של חרוזים ג'ל אמולסיה מן הנקודות הנמוכות ביותר של ההתאוששות היטב ולבדוק את האחידות של חרוזים. לוותר על חרוזים אמולסיה במורד הקיר של צינור PCR חדש על קרח ולמקום את הצינור במחזור תרמי עבור שעתוק הפוך.כדי להכין את cDNA להגברה, להוסיף 125 microliters של סוכן התאוששות לדגימה בטמפרטורת החדר. אין לראות נוזל אטום ולהימנע צינורות או מערבולת. המתן 60 שניות לפני הסרת לאט סוכן ההתאוששות מתחתית הצינור ולהוסיף 200 microliters של תערובת ניקוי חרוזים מערבולת לדגימה.פיפטה את התערובת 10 פעמים לפני הדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הדגימות על מגנט במיקום גבוה. כאשר הפתרון מתנקה, להסיר את supernatant ולהוסיף 200 microliters של 80% אתנול גלולה.לאחר 30 שניות, להסיר את האתנול ולחזור על לשטוף פעמיים נוספות. לאחר הכביסה האחרונה, לזמן קצר צנטריפוגה את המדגם מניחים את הצינור על המגנט במצב נמוך כדי לאפשר את המדגם לאוויר יבש במשך פחות משתי דקות. כאשר המדגם התייבש, להסיר את הצינור מן המגנט ולהוסיף 35.5 microliters של פתרון אלוטיון מוכן טרי.לאחר דגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את המדגם על המגנט בתדר הגבוה עד שהפתרון מתבהר לפני העברת 35 מיקרוליטרים של הדגימה לרצועת צינור חדשה. להגברת cDNA באמצעות אסטרטגיית הקידוד מבוססת השומנים, הוסיפו תערובת תגובת הגברה לדגימות CDNA של 35 מיקרוליטר עם ערבוב יסודי לפני צנטריפוגה קצרה. בסוף הספין, הדגירה את המדגם במחזור התרמי בעקבות הליך הגברה cDNA המתאים.הוסף 120 מיקרוליטרים של רייגנט נבחר ו-100 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים ל-100 מיקרוליטרים של דגימה ופיגט, 15 פעמים. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הדגימה על המגנט עד שהפתרון מתבהר. העבר את העל-טבעי לצינור איגוד נמוך של 1.5 מיליליטר לבניית ספריית cDNA מרובת-קידודים.זכור לשמור הן את supernatants ואת הבסיס כמו התוכן של supernatant להרכיב cDNA ברקוד ואת cDNA אנדוגני תוכן הבסיס. נקה את cDNA אנדוגני עם 80%אתנול ולחמק ה-DNA עם 40 microliters של חיץ אלוטיון, ולאחר מכן להפעיל בדיקת בקרת איכות של cDNA אנדוגני לפני הכנת ספריית תעתיק אנדוגני. ריכוז cDNA צריך להיות מכמת ומוסמך לפני בניית הספרייה.הספריות הבנויות, כולל ספריות cDNA וברקוד אנדוגני, צריך גם לכמת ולאשר לפני רצף. לאחר רצף, ניתן לנתח את ביטוי הברקוד בכל תא בודד. לדוגמה, בניתוח זה נצפו שמונה קבוצות של תאים בודדים שהתבטאו באופן ייחודי בסוג אחד של ברקוד המייצג תאים משמונה דגימות שונות.בנוסף, תאים מסוימים לא הביעו ברקוד ולכן הוגדרו כתאים שליליים, בעוד שתאים אחרים ביטאו שני ברקודים שונים המייצגים כפילויות. באמצעות תאי סינגלט, ההטרוגניות התאית והתקנות המולקולריות ניתן להעריך על ידי ביאור סוג התא, זיהוי סוג תאים חדשני ונדיר, ניתוח השוואתי אזור אנטומי, וניתוח מסלול אונטולוגיה גנים, כגון הפרדות שלב מחזור התא. זה מועיל כדי דימוי גם גם את גם תותחי הג'ל באמולסיה אם אתה יכול, כמו תמונה תגיד לך אם ההליך הצליח עד לנקודה זו.מולטי-שינג לדוגמה מוסיף גמישות רבה בתכנון הניסויים שלך. לאחר שצפית בהדגמה זו, אני מקווה שתהיה בטוח יותר להתחיל ניסויים משלך.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...