Name: multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

ゼブ・J・ガートナー博士のデビッド・M・パターソンとクリストファー・S・マクギニス博士のサンプル・J・ガートナー博士に感謝し、脂質ベースのバーコード試薬の供給と実験ステップとデータ分析に関する提案を行いました。この作品は国立衛生研究所(HL13347202)によって設立されました。

動物の手順は、ピッツバーグ大学の動物ケアと使用委員会(IACUC)に従っています。
1. マウス胚性心臓解剖と単細胞懸濁製剤
メモ:この手順は、解剖する胚の数に応じて数時間かかる場合があります。
<ol><li>E18.5胚性心臓を取得するには、CO2投与により妊娠中のCD1マウスを安楽死させる。カミソリを使って腹部の不要な髪を取り除き、70%のエタ?...

<ol>
	<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).</li><li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep</a> (2018)</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>. Agilent 4200 TapeStation System Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf</a> (2019)</li><li>. SPRIselect User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf">https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf</a> (2012)</li><li>. Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf</a> (2018)</li><li>. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf</a> (2016)</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).</li><li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. 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本研究では、単一細胞転写プロファイルを解析するプロトコルを実証した。また、scRNA-Seqワークフローでサンプルを多重化する2つのオプションの方法も提供しています。両方の方法は、様々なラボで実現可能であることが証明され、費用対効果が高く、バッチ効果のない単一細胞実験を実行するためのソリューションを提供した。
<p class="jove_co...

各単一細胞の転写プロファイルは、胚発生中の細胞集団によって異なる。situハイブリダイゼーションにおける単一分子は、少数の遺伝子1の発現を可視化するために使用することができるが、単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)は、単一細胞における遺伝子のゲノムワイド発現パターンを例示する偏りのないアプローチを提供する。2009年2月に最初に出版された後、scRNA-Seqは、近年3、4、5の複数の発達段階で複数の組織を研究するために適用されている。また、ヒト細胞アトラスが最近発達に焦点を当てたプロジェクトを立ち上げているため、近い将来、ヒト胚組織からの単一細胞データの生成が期待されています。
最初に発達する臓器としての心臓は胚発生において重要な役割を果たす。心臓は複数の細胞型で構成され、各細胞型の発達は時間的および空間的に厳密に調節される。ここ数年、初期の発達段階における心臓細胞の起源と細胞系統は、先天性心疾患の病因を理解するための非常に有用なナビゲーションツールを提供する6を特徴とし、心筋細胞再生7を刺激するより技術的に高度な方法を開発する。
scRNA-Seqは、近年8、9、10で急速な拡大を遂げています。新たに開発された方法により、単一細胞実験の設計と解析がより達成可能になりました。ここで提示する方法は、液滴溶液に基づく商業手順である(材料表を参照)15、16。この方法は、マイクロ流体コントローラシステムの制御下にある油水エマルジョン液滴中の細胞および一意にバーコードされたビーズのセットを捕捉することを特徴とする。液滴への細胞負荷の速度は極めて低く、液滴エマルションの大部分は1つの細胞17のみを含む。この手順の独創的な設計は、バーコードングと同時に発生する液滴エマルジョンへの単一細胞分離から来ており、異種集団でRNA-Seqを使用して個々の細胞の並列分析を可能にします。
多重化戦略の組み込みは、従来の単一細胞ワークフロー13、14への重要な追加の1つである。この添加は、細胞ダブレットを廃棄し、実験コストを削減し、バッチ効果18、19を排除するのに非常に有用である。脂質ベースのバーコードング戦略と抗体ベースのバーコードング戦略(材料表参照)は、主に多重化法の2つである。特定のバーコードを使用して両方の方法で各サンプルにラベルを付け、ラベル付きサンプルを混合して単一セルのキャプチャ、ライブラリの準備、およびシーケンス処理を行います。その後、バーコードシーケンスを分析することによって、プールされたシーケンスデータを分離することができます (図 1)19.ただし、2 つの方法には大きな違いがあります。脂質ベースのバーコード戦略は、脂質修飾オリゴヌクレオチドに基づいており、細胞型の好みを有することが見つかっていない。抗体ベースのバーコードング戦略は、抗原タンパク質19、20を発現する細胞のみを検出できるが。また、脂質を染色するのに約10分かかりますが、抗体を染色するのに40分かかります(図1)。さらに、脂質修飾オリゴヌクレオチドは抗体共役オリゴヌクレオチドよりも安価であるが、本稿の執筆時点では市販されていない。最後に、脂質ベースの戦略は1回の実験で96サンプルを多重化できますが、抗体ベースの戦略は現在12サンプルしか多重化できません。
単一の実験で多重化する推奨細胞数は2.5 x 104より小さくする必要があり、そうでなければ、細胞ダブレットの高い割合と潜在的な周囲mRNA汚染につながります。多重化戦略により、複数のサンプルの単一セルキャプチャ、cDNA生成、ライブラリ調製のコストは1サンプルのコストに削減されますが、シーケンシングコストは変わりません。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120252 330019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium Controller</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250 230003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>330002, 120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Clip</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120253 230002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>25 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Chales River</td>
			<td>Strain Code 022</td>
			<td>ordered pregnant mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424R</td>
			<td>Appendorf</td>
			<td>2231000214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000073</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM Kit v3,4 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000094</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; Library Kit v3</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000095</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; v3 Gel Beads</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000059</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>11088807001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000048</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661020N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661000N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi Cell Strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td>Porosity 40 &#956;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td>Add 5 &#181;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &#181;l staining volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (IPA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0295239</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 4-pack (0.1&#8211;2.5&#956;L, 0.5-10&#956;L, 10&#8211;100&#956;L, 100&#8211;1,000&#956;L variable-volume pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318 (60ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template Switch Oligo</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>3000228</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Master Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The cell browser is Loup Cell Browser</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The well maintained R platform is Seurat V3</td>
			<td>satijalab</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-3710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155801</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155803</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155805</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq RPI primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells

単一細胞mRNAシーケンシングはここ数年で大きな進歩を遂げ、発生生物学の分野で重要なツールとなっています。希少細胞集団の同定、新規マーカー遺伝子の発見、空間的・時間的発達情報の解読に成功しています。単一細胞法は、マイクロ流体ベースのFluidigm C1技術から、過去2~3年で液滴ベースのソリューションへと進化しました。ここでは、液滴ベースのscRNA-Seq法を用いてマウス胚組織細胞をプロファイリングする方法を示す例として心臓を用いた。さらに、1 回の実験で複数のサンプルをプロファイリングするために、2 つの戦略をワークフローに統合しました。統合された方法の1つを使用して、我々は同時に8つの心臓サンプルから9,000以上の細胞をプロファイリングしました。これらの方法は、異なる遺伝的背景、発達段階、または解剖学的位置からの単一細胞を同時にプロファイルする費用対効果の高い方法を提供することにより、発生生物学分野にとって貴重です。

本研究では、マウス胚性心臓を例として、臓器の別々の部分から異なるサンプルを同時に処理するために多重化された単一細胞mRNAシーケンシングがどのように行われたかを示した。E18.5 CD1マウスの心臓を単離し、左心房(LA)、右心房(RA)、左心室(LV)および右心室(RV)に解剖した。心房細胞と心室細胞を脂質ベースのバーコード付きバーコード手順を用いて独立してバー?...

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Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

単一細胞mRNAシーケンシングは、単一細胞レベルでの生物学的プロセスを理解するために広く使用されている。多重化戦略の出現は、単一の実験で複数のサンプルのプロファイリングを可能にし、コストを大幅に削減し、バッチ効果を回避することによって、増幅をさらに拡大しました。この手順のデモンストレーションは、ポスドクのウェイ・フェンと、私の研究室の技術者アンドリュー・プジシンダです。カウント後、胚18.5日目の心臓室から分離した細胞を5倍の10から5番目のアリコートに分割し、洗浄ごとに新鮮なPBSで細胞を2回洗浄する。サンプルあたりPBSの180マイクロリットルでペレットを再懸濁し、穏やかな混合と各チューブにアンカーバーコードストック溶液の20マイクロリットルを追加します。氷の上に5分間のインキュベーションの後、20マイクロリットルの共同アンカーバーコードストック溶液を各チューブに加え、氷上でさらに5分間のインキュベーションを行い、1回の洗浄で1ミリリットルの冷たいPBSで細胞を3ミリリットル洗浄し、チューブあたり1つの40マイクロメートルセルストレーナーを通してサンプルを新しいチューブにフィルターします。カウント後、チップBをチップホルダーに組み立て、50%グリセロール溶液の75マイクロリットルを1行目の未使用の井戸に、40マイクロリットルを2行目の未使用の井戸に、280マイクロリットルを3行目の未使用の井戸に加えます。ここでは、手順を示すためにトレーニング チップを使用します。優しいピペットでマスターミックスに細胞懸濁液とヌクレアーゼフリー水の適切な量を追加します。結果として得られたセル溶液の75マイクロリットルを、気泡のない行の1の行ウェルの下の中央に加えます。ゲルビーズを30秒間ボルテックスしてから、泡のない2列目のゲルビーズの底中央に40マイクロリットルのビーズをゆっくりと加えます。3列目の仕切油井戸のサイドウォールに280マイクロリットルの仕切油を加えます。ガスケットを押さずにガスケットをチップに取り付け、ガスケットを水平に保ち、ガスケットを濡らさないようにします。組み立てたチップをクロムコントローラにガスケットでセットし、クロム単一セルBプログラムを実行します。画面にはトレーニングチップのクロムトレーニングが表示されますが、実際の実験ではクロム単一セルBが表示されます。蓋を折り返して45度の角度で井戸を露出させ、液体レベルをチェックして下駄がないことを確認します。回復の最も低い点からエマルジョン中のゲルビーズの100マイクロリットルをゆっくりと吸引し、ビーズの均一性を確認する。乳化ビーズを氷上の新しいPCRチューブの壁に分配し、逆転写のためにサーマルサイクラーにチューブを入れます。cDNAを増幅用に準備するには、室温で125マイクロリットルの回収剤をサンプルに加えます。不透明な液体は観察されず、ピペットや渦を避けてください。60秒待ってから、ゆっくりとチューブの底から回収剤を取り出し、200マイクロリットルの渦ビーズのクリーンアップ混合物をサンプルに加えます。混合物を10回ピペットしてから室温で10分間インキュベートする。次に、サンプルを磁石の上に高い位置に置きます。溶液がクリアされたら、上清を取り除き、80%エタノールの200マイクロリットルをペレットに加えます。30秒後、エタノールを取り除き、さらに2回洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、サンプルを短く遠心分離し、低い位置でマグネットの上にチューブを置き、サンプルが2分未満乾燥するようにします。サンプルが乾燥したら、マグネットからチューブを取り出し、作りたての溶出液を35.5マイクロリットル加えます。室温で2分間のインキュベーションの後、溶液がクリアされるまで磁石の上にサンプルを置き、サンプルの35マイクロリットルを新しいチューブストリップに移します。脂質ベースのバーコード戦略を用いたcDNA増幅の場合、35マイクロリットルcDNAサンプルに増幅反応混合物を加え、遠心分離を簡単に行う前に完全混合を行います。スピンの終了時に、適切なcDNA増幅手順に従って、サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。120マイクロリットルの選択試薬と100マイクロリットルの超純水を100マイクロリットルのサンプルに加え、得られた0.6倍の選択試薬を15回ピペットします。室温で5分間のインキュベーションの後、溶液が明らかになるまでサンプルを磁石の上に置きます。バーコード化されたcDNAライブラリ構造を多重化するために、上清を1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。上清の内容がバーコード化されたcDNAと内因性cDNAのベース内容を組み立てるので、上清とベースの両方を保存することを忘れないでください。80%エタノールで内因性cDNAを洗浄し、40マイクロリットルの溶出バッファーでDNAを溶出し、内因性転写ライブラリを準備する前に内因性cDNAの品質管理チェックを実行します。cDNA濃度は、ライブラリの構築前に定量化し、修飾する必要があります。内因性の cDNA ライブラリやバーコード ライブラリを含む構築されたライブラリも、シーケンス処理の前に定量化および修飾する必要があります。シーケンス処理後、バーコード式は各セルで分析できます。例えば、この分析では、8種類の異なるサンプルから1種類のバーコードを表すバーコードを一意に発現した8つのグループの単一細胞が観察された。さらに、一部のセルはバーコードを表さなかったため、負のセルとして定義され、他のセルは2つの異なるバーコードを表す2つの異なるバーコードを表しました。単一細胞を用いて、細胞の異種性および分子規制は、細胞型注釈、新規および稀な細胞型同定、解剖学的領域比較分析、および細胞周期相分離などの遺伝子オントロジー経路解析によって評価することができる。可能であれば、エマルジョンでゲルビーズを画像化すると、この時点まで手順が成功したかどうかが画像でわかります。サンプル多重化により、実験の設計に大きな柔軟性が加わることができます。このデモンストレーションを見て、あなた自身の実験を始めることに自信を持っていければと思います。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...