Name: multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Vi takker David M. Patterson og Christopher S. McGinnis fra Dr. Zev J. Gartner Lab for deres type tilførsel av lipid baserte barcoding reagenser og forslag på eksperimentelle trinn og dataanalyse. Dette arbeidet ble grunnlagt av National Institutes of Health (HL13347202).

Dyret prosedyren er i samsvar med University of Pittsburgh institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. Mouse embryonale hjerte disseksjon og enkelt celle suspensjon forberedelse
Merk: dette trinnet kan ta noen timer, avhengig av antall embryo å analysere.
<ol><li>For å tilegne seg E 18.5 embryonale hjerter, euthanize en gravid CD1 mus av CO2 administrasjon. Bruk en barberhøvel til å fjerne uønsket hår i mageområdet og desinfisere hud...

<ol>
	<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).</li><li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution.">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li><li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development.">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development.">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476 (2019).</li><li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart.">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte.">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100 (2017).</li><li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies.">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367 (2018).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).</li><li>Gr&#252;n, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments.">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).</li><li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq.">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep</a> (2018)</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>. Agilent 4200 TapeStation System Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf</a> (2019)</li><li>. SPRIselect User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf">https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf</a> (2012)</li><li>. Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf</a> (2018)</li><li>. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf</a> (2016)</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).</li><li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly.">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li><li>. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep</a> (2017)</li></ol>

I denne studien har vi demonstrert en protokoll for å analysere enkelt celle transcriptional profiler. Vi har også gitt to valgfrie metoder for å multiplex prøver i scRNA-SEQ arbeidsflyt. Begge metodene har vist seg å være gjennomførbart på ulike laboratorier og gitt løsninger for å kjøre en kostnadseffektiv og batch effekt-gratis enkelt celle eksperiment18,26.
Det er noen skritt som bør følges nøye når du går gjennom p...

Den transcriptional profilen til hver enkelt celle varierer mellom celle populasjoner under embryoutvikling. Selv om enkelt molekylær in situ-hybridisering kan brukes til å visualisere uttrykk for et lite antall gener1, gir én celle mRNA sekvensering (ScRNA-SEQ) en upartisk tilnærming for å illustrere uttrykks mønstre av gener i hele Genova i enkeltceller. Etter at den først ble publisert i 20092, scRNA-SEQ har blitt brukt til å studere flere vev på flere utviklingsmessige stadier i de siste årene3,4,5. Også, som den menneskelige cellen Atlas har lansert sin utviklingsmessige-fokuserte prosjekter nylig, er mer enkelt celledata fra menneskelig embryonale vev forventes å bli generert i nær fremtid.
Hjertet som første organ for å utvikle spiller en avgjørende rolle i embryoutvikling. Hjertet består av flere celletyper og utviklingen av hver celle type er strengt regulert timelig og romlig. I løpet av de siste årene, opprinnelse og celle avstamning av CARDIAC celler på tidlige utviklingsmessige stadier har vært preget6, som gir en enorm nyttig navigeringsverktøy for å forstå medfødt hjertesykdom patogenesen, samt for å utvikle mer teknologisk avanserte metoder for å stimulere cardiomyocyte regenerering7.
ScRNA-SEQ har gjennomgått en rask ekspansjon de siste årene8,9,10. Med de nyutviklede metodene har design og analyse av enkelt celle eksperimenter blitt mer oppnåelig11,12,13,14. Metoden som presenteres her er en kommersiell prosedyre basert på dråpe-løsningene (se tabell over materialer)15,16. Denne metoden har å fange celler og sett med unikt Barcoded perler i en olje-vann emulsjon dråpe under kontroll av en mikrovæskebasert Controller system. Hastigheten på celle lasting i dråpene er ekstremt lav, slik at flertallet av dråpe emulsjoner inneholder bare en celle17. Prosedyren er genial design kommer fra enkelt celle separasjon i dråpe emulsjoner forekommende samtidig med barcoding, som muliggjør parallell analyse av individuelle celler ved hjelp av RNA-SEQ på en heterogen befolkning.
Innlemmelse av multipleksing strategier er en av de viktigste tilleggene til den tradisjonelle enkelt celle arbeidsflyten13,14. Dette tillegg er svært nyttig i å forkaste celle doublets, redusere eksperimentelle kostnader, og eliminere batch effekter18,19. En lipid basert barcoding strategi og et antistoff basert barcoding strategi (se tabell av materialer) er de to mest brukte multipleksing metoder. Spesifikke strekkoder brukes til å merke hvert utvalg i begge metodene, og de merkede eksemplene blandes deretter for enkelt celle henting, biblioteks forberedelser og sekvenser. Etterpå kan de grupperte sekvensering dataene skilles ved å analysere strekkode sekvensene (figur 1)19. Det finnes imidlertid betydelige forskjeller mellom de to metodene. Den lipid basert barcoding strategien er basert på lipid-modifisert oligonukleotider, som ikke har blitt funnet å ha noen celle type preferanser. Mens antistoff-baserte barcoding-strategien bare kan oppdage cellene som uttrykker antigen-proteinene19,20. I tillegg tar det ca 10 min å flekk på lipider men 40 min å beis antistoffer (figur 1). Videre er lipid-modifiserte oligonukleotider billigere enn antistoff-bøyd oligonukleotider, men ikke kommersielt tilgjengelig på tidspunktet for å skrive denne artikkelen. Til slutt, lipid-basert strategi kan multiplex 96 prøver i ett eksperiment, men antistoff-basert strategi for tiden bare kan multiplex 12 prøver.
Det anbefalte celle nummeret for å multiplex i et enkelt eksperiment bør være lavere enn 2,5 x 104, ellers vil det føre til en høy andel av celle doublets og potensiell ambient mRNA-forurensning. Gjennom multipleksing strategier, kostnaden for enkelt celle fangst, cDNA generasjon, og biblioteket forberedelse for flere prøver vil bli redusert til kostnadene for en prøve, men sekvensering kostnadene vil forbli den samme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120252 330019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium Controller</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250 230003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>330002, 120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Clip</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120253 230002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>25 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Chales River</td>
			<td>Strain Code 022</td>
			<td>ordered pregnant mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424R</td>
			<td>Appendorf</td>
			<td>2231000214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000073</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM Kit v3,4 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000094</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; Library Kit v3</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000095</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; v3 Gel Beads</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000059</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>11088807001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000048</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661020N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661000N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi Cell Strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td>Porosity 40 &#956;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td>Add 5 &#181;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &#181;l staining volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (IPA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0295239</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 4-pack (0.1&#8211;2.5&#956;L, 0.5-10&#956;L, 10&#8211;100&#956;L, 100&#8211;1,000&#956;L variable-volume pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318 (60ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template Switch Oligo</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>3000228</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Master Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The cell browser is Loup Cell Browser</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The well maintained R platform is Seurat V3</td>
			<td>satijalab</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-3710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155801</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155803</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155805</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq RPI primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells

Enkelt celle mRNA sekvensering har gjort betydelige fremskritt i de siste årene, og har blitt et viktig verktøy innen utviklingspsykologi biologi. Det har blitt brukt til å identifisere sjeldne celle populasjoner, oppdage romanen markør gener, og dekode romlige og timelige utviklingsmessige informasjon. Den enkle celle metoden har også utviklet seg fra den mikrovæskebasert baserte Fluidigm C1-teknologien til dråpe-baserte løsninger i de siste to til tre år. Her har vi brukt hjertet som et eksempel for å demonstrere hvordan å profil musen embryonale vev celler ved hjelp av dråpe basert scRNA-SEQ metode. I tillegg har vi integrert to strategier i arbeidsflyten for å profil flere prøver i et enkelt eksperiment. Ved hjelp av en av de integrerte metodene, har vi samtidig profilert mer enn 9 000 celler fra åtte hjerte prøver. Disse metodene vil være verdifulle for utviklingsbiologi feltet ved å tilby en kostnadseffektiv måte å samtidig profil enkeltceller fra ulike genetiske bakgrunner, utviklingsmessige stadier, eller anatomiske steder.

I denne studien, brukte vi musen embryonale hjertet som et eksempel for å vise hvordan multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering ble utført for å behandle de forskjellige prøvene fra separate deler av et organ samtidig. E 18.5 CD1 mus hjerter ble isolert og dissekert i venstre Atrium (LA), høyre Atrium (RA), venstre ventrikkel (LV) og høyre ventrikkel (RV). Den atrieflimmer og ventrikkel celler ble deretter Barcoded uavhengig ved hjelp av en lipid-baserte barcoding prosedyre og bl...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Her presenterte vi en multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering metode for å profil genuttrykk i musen embryonale vev. Dråpe BAS ert enkelt celle mRNA sekvensering (scRNA-SEQ) metode i kombinasjon med multipleksing strategier kan profilen enkeltceller fra flere prøver samtidig, som i betydelig grad reduserer reagens kostnader og minimerer eksperimentelle satsvise effekter.

Multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering analyse av Mouse embryonale celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

EncellemRNA-sekvensering er mye brukt til å forstå de biologiske prosessene på ett cellenivå. Bruk av multipleksing strategier har ytterligere utvidet sine forsterkninger ved å tillate profilering av flere prøver i et enkelt eksperiment, dramatisk redusere kostnadene og unngå batch effekter. Å demonstrere prosedyren vil være Wei Feng, en postdoktor, og Andrew Przysinda, en tekniker fra laboratoriet mitt.Etter telling, del cellene isolert fra embryonale dag 18,5 hjertekamre i fem ganger 10 til de femte aliquots og vask cellene to ganger med frisk PBS per vask. Resuspend pellets i 180 mikroliter PBS per prøve og tilsett 20 mikroliter anker strekkode lager løsning til hvert rør med mild blanding. Etter en fem minutters inkubasjon på is, legg til 20 mikroliter med co-anker strekkode lagerløsning til hvert rør med mild blanding for en ekstra fem minutters inkubasjon på is før du vasker cellene tre ganger med en milliliter kald PBS supplert med 1% storfe serum albumin per vask, og deretter filtrere prøvene til nye rør gjennom en 40-mikrometer celle sil per rør.Etter telling, monter chip B i en sponholder, og legg deretter til 75 mikroliter av en 50% glyserolløsning til de ubrukte brønnene i rad en, 40 mikroliter til de ubrukte brønnene i rad to og 280 mikroliter til de ubrukte brønnene i rad tre. Vær oppmerksom på at en treningsbrikke brukes her for å demonstrere prosedyren. Tilsett riktig volum av cellefjæring og kjernefritt vann til masterblandingen med mild pipettering.Legg til 75 mikroliter av den resulterende celleløsningen nederst i midten av prøven godt i rad en uten bobler. Vortex gelperlene i 30 sekunder før du sakte legger til 40 mikroliter perler til det nederste midten av gelperlen godt i rad to uten bobler. Tilsett 280 mikroliter med partisjonering av olje ned sideveggen av partisjonering oljebrønnen i rad tre.Fest pakningen til brikken uten å trykke ned på pakningen og hold pakningen horisontal for å unngå fukting av pakningen. Last den monterte brikken med pakningen i kromkontrolleren og kjør kroms encellede B-programmet. Merk at skjermen viser kromtrening for treningsbrikken, men for de virkelige eksperimentene vil skjermen vise krom encellede celle B.Når programmet er fullført, fjern umiddelbart brikken og kast pakningen.Brett lokket tilbake for å eksponere brønnene i en 45-graders vinkel og kontroller væskenivåene for å sikre at det ikke er til stede noen tresko. Aspirer sakte 100 mikroliter gelperler i emulsjon fra de laveste punktene i utvinningen godt og kontroller perlenes ensartethet. Dispenser de emulgerte perlene ned veggen på et nytt PCR-rør på is og legg røret i en termisk cycler for omvendt transkripsjon.For å forberede cDNA for forsterkning, legg til 125 mikroliter utvinningsmiddel til prøven ved romtemperatur. Ingen ugjennomsiktig væske bør observeres og unngå pipettering eller vortexing. Vent 60 sekunder før du sakte fjerner gjenopprettingsmiddelet fra bunnen av røret og tilsett 200 mikroliter vortex perleoppryddingsblanding til prøven.Pipette blandingen 10 ganger før inkubering i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter plasserer du prøvene på en magnet i høy stilling. Når løsningen klarner, fjern supernatanten og tilsett 200 mikroliter med 80% etanol til pelleten.Etter 30 sekunder, fjern etanol og gjenta vasken to ganger til. Etter siste vask sentrifuger du prøven kort og plasserer røret på magneten i lav posisjon for å la prøven lufttørke i mindre enn to minutter. Når prøven har tørket, fjern røret fra magneten og tilsett 35,5 mikroliter nylaget elutionløsning.Etter en to minutters inkubasjon ved romtemperatur plasserer du prøven på magneten i høy posisjon til oppløsningen klarner før du overfører 35 mikroliter av prøven til en ny rørstripe. For cDNA-forsterkning ved hjelp av den lipidbaserte barkodingsstrategien, tilsett forsterkningsreaksjonsblandingen til de 35 mikroliter cDNA-prøvene med grundig blanding før kort sentrifugering. På slutten av spinnet inkuber prøven i den termiske cycleren etter riktig cDNA forsterkningsprosedyre.Tilsett 120 mikroliter med utvalgte reagenser og 100 mikroliter ultrarent vann til 100 mikroliter prøve og pipette den resulterende 0,6x select reagens 15 ganger. Etter en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur, plasser prøven på magneten til løsningen blir klar. Overfør det overnaturlige til et 1,5 milliliter lavt bind rør for multipleksing strekkodet cDNA bibliotekkonstruksjon.Husk å lagre både supernatantene og basen som supernatantens innhold monterer strekkodet cDNA og grunninnholdet endogene cDNA. Rengjør endogene cDNA med 80% etanol og elute DNA med 40 mikroliter elution buffer, deretter kjøre en kvalitetskontroll kontroll av endogene cDNA før du forbereder en endogene transkripsjon bibliotek. CDNA-konsentrasjonen skal kvantifiseres og kvalifisert før bibliotekkonstruksjon.De konstruerte bibliotekene, inkludert endogene cDNA- og strekkodebibliotekene, bør også kvantifiseres og kvalifisert før sekvensering. Etter sekvensering kan strekkodeuttrykket analyseres i hver enkelt celle. For eksempel, i denne analysen ble det observert åtte grupper med enkeltceller som unikt uttrykte en type strekkode som representerer celler fra åtte forskjellige prøver.I tillegg uttrykte noen celler ingen strekkode og ble derfor definert som negative celler, mens andre celler uttrykte to forskjellige strekkoder som representerer dobler. Ved hjelp av singletcellene kan cellulær heterogenitet og molekylære forskrifter vurderes etter celletypemerknad, ny og sjelden celletypeidentifikasjon, anatomisk soneparativ analyse og gentopologiveianalyse, for eksempel cellesyklusfasesepara separasjoner. Det er nyttig å bilde gelperlene i emulsjon hvis du kan, som et bilde vil fortelle deg om prosedyren har vært vellykket opp til dette punktet.Eksempelplumksingen gir stor fleksibilitet i utformingen av eksperimentene dine. Etter å ha sett denne demonstrasjonen, håper jeg du vil være mer trygg på å starte dine egne eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Diagnostikk klarert Embryonic og barsel hjerter på Single-celle Oppløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse av retinsyre-indusert Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i to og tre-dimensjonale embryoidlegemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analyse av embryonale stamcelleforskningen blodkreft forløpere bruke enkeltcelle indeks sortering kombinert med endotelial celle nisje co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Encellede Transcriptomic analyser av musen bukspyttkjertelen endokrine celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...