Name: multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells
Uploaded: 2020-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Vi tackar David M. Patterson och Christopher S. McGinnis från Dr. Zev J. Gartner Lab för deras vänliga försörjning av lipidbaserade streckkodning reagenser och förslag på experimentella steg och dataanalys. Detta arbete grundades av National Institutes of Health (HL13347202).

Det djura tillvägagångssättet är i överensstämmelse med universitetar av den Pittsburgh institutionella djuromsorg-och bruk kommittén (IACUC).
1. mus embryonal hjärt dissektion och Single cell suspension beredning
Anmärkning: detta steg kan ta några timmar beroende på antalet embryon att dissekera.
<ol><li>För att förvärva E 18.5 embryonala hjärtan, euthanize en gravid CD1 Mouse av CO2 administration. Använd en rakkniv för att ta bort o...

<ol>
	<li>Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).</li><li>Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiovascular+lineage+descendants+at+single-cell+resolution.">Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution.</a> Development. 142 (5), 846-857 (2015).</li><li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development.">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+expression+analysis+reveals+anatomical+and+cell+cycle-dependent+transcriptional+shifts+during+heart+development.">Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development.</a> Development. 146 (12), dev173476 (2019).</li><li>Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deployment+of+cell+lineages+that+form+the+mammalian+heart.">The deployment of cell lineages that form the mammalian heart.</a> Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+reconstructs+fate+conversion+from+fibroblast+to+cardiomyocyte.">Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte.</a> Nature. 551 (7678), 100 (2017).</li><li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies.">Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 1, (2018).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367 (2018).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).</li><li>Gr&#252;n, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+single-cell+sequencing+experiments.">Design and analysis of single-cell sequencing experiments.</a> Cell. 163 (4), 799-810 (2015).</li><li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods.">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).</li><li>Islam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+single-cell+transcriptional+landscape+by+highly+multiplex+RNA-seq.">Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.</a> Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets.">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>. Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep</a> (2018)</li><li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MULTI-seq:+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices.">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 1, (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).</li><li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis.">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li><li>. Agilent 4200 TapeStation System Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf</a> (2019)</li><li>. SPRIselect User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf">https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf</a> (2012)</li><li>. Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf</a> (2018)</li><li>. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf</a> (2016)</li><li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions,+technologies,+and+species.">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).</li><li>Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+fatty-acid+modified+oligonucleotides+to+live+cell+membranes+through+stepwise+assembly.">Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly.</a> Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).</li><li>. Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep</a> (2017)</li></ol>

I den här studien har vi visat ett protokoll för att analysera transkriptionella profiler för enskilda celler. Vi har också tillhandahållit två valfria metoder för att multiplex prover i scRNA-SEQ arbetsflöde. Båda metoderna har visat sig vara genomförbara på olika laboratorier och tillhandahållit lösningar för att driva en kostnadseffektiv och satsvis effekt-fri enda cell experiment18,26.
Det finns några steg som bör f...

Den transkriptionella profilen för varje enskild cell varierar mellan cellpopulationer under embryonal utveckling. Även om enstaka molekylära in situ hybridisering kan användas för att visualisera uttrycket av ett litet antal gener1, Single cell mRNA sekvensering (scrna-SEQ) ger en opartisk metod för att illustrera genombrett uttryck mönster av gener i enskilda celler. Efter det publicerades först i 20092, scrna-SEQ har tillämpats för att studera flera vävnader på flera utvecklingsstadier under de senaste åren3,4,5. Dessutom, som Human cell Atlas har lanserat sina utvecklingsfokuserade projekt nyligen, mer enstaka celldata från mänskliga embryonala vävnader förväntas genereras inom en snar framtid.
Hjärtat som det första orgeln att utveckla spelar en avgörande roll i embryonal utveckling. Hjärtat består av flera celltyper och utvecklingen av varje celltyp är tätt reglerad temporally och rumsligt. Under de senaste åren, ursprung och cell härstamning av hjärtceller vid tidiga utvecklingsstadier har karakteriserats6, som ger en enorm användbar navigering verktyg för att förstå medfödda hjärtsjukdom patogenes, samt för att utveckla mer tekniskt avancerade metoder för att stimulera kardiomyocyte förnyelse7.
Scrna-SEQ har genomgått en snabb expansion de senaste åren8,9,10. Med de nyutvecklade metoderna har design och analys av enstaka cell experiment blivit mer uppnåeliga11,12,13,14. Den metod som presenteras här är ett kommersiellt förfarande baserat på dropp-lösningarna (se tabell över material)15,16. Denna metod har fånga celler och uppsättningar av unikt barkodade pärlor i en olja-vatten emulsion dropp under kontroll av ett mikroflödessystem Controller system. Hastigheten för cell lastning i dropparna är extremt låg så att majoriteten av DROPP emulsioner innehåller endast en cell17. Procedurets geniala design kommer från enkel cellseparation till dropp-emulsioner som inträffar samtidigt med barkodning, vilket möjliggör parallell analys av enskilda celler med hjälp av RNA-SEQ på en heterogen population.
Införlivandet av multiplexering strategier är en av de viktiga tillägg till den traditionella Single cell arbetsflöde13,14. Detta tillägg är mycket användbart i kassering cell doublets, minska experimentella kostnader, och eliminera parti effekter18,19. En lipid baserad streckkodning strategi och en antikropp baserad streckkodning strategi (se tabell över material) är de två mest använda Multiplexing metoder. Specifika streckkoder används för att märka varje prov i båda metoderna, och de märkta exemplen blandas sedan för enkel cell fångst, biblioteks förberedelse och sekvensering. Efteråt kan poolsekvensering data separeras genom att analysera streckkoden sekvenser (figur 1)19. Det finns dock betydande skillnader mellan de två metoderna. Den lipidbaserade streckkodning strategi bygger på lipid-modifierade oligonukleotides, som inte har visat sig ha någon celltyp preferenser. Medan antikropps baserade streckkodning strategi bara kan upptäcka de celler som uttrycker antigen proteiner19,20. Dessutom tar det ca 10 min att färga lipider men 40 min att färga antikropparna (figur 1). Dessutom är de lipidmodifierade oligonukleotiderna billigare än antikroppskonjugerade oligonukleotider, men inte kommersiellt tillgängliga vid skrivande stund i denna artikel. Slutligen kan den lipidbaserade strategin multiplex 96 prover i ett experiment, men den antikroppsbaserade strategi för närvarande kan bara multiplex 12 prover.
Den rekommenderade cell nummer till multiplex i ett enda experiment bör vara lägre än 2,5 x 104, annars, det kommer att leda till en hög andel av cell dubletter och potentiell omgivande mRNA förorening. Genom multiplexering strategier, kostnaden för Single cell fånga, cDNA generation, och bibliotek förberedelse för flera prover kommer att reduceras till kostnaden för ett prov men sekvenserings kostnaden kommer att förbli densamma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chip Holder</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120252 330019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Chromium Controller</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Magnetic Separator</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120250 230003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Adapter</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>330002, 120251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Vortex Clip</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120253 230002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4200 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>25 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mice</td>
			<td>Chales River</td>
			<td>Strain Code 022</td>
			<td>ordered pregnant mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424R</td>
			<td>Appendorf</td>
			<td>2231000214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000073</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; GEM Kit v3,4 rxns</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000094</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; Library Kit v3</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>1000095</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39; v3 Gel Beads</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000059</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>10103578001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Sigma/Millipore</td>
			<td>11088807001</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C, store at -20 &#176;C after it dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5582</td>
			<td>University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne SILANE</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000048</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, United States</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661020N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10&#956;l</td>
			<td>Theromo Scientific</td>
			<td>4661000N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi Cell Strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td>Porosity 40 &#956;m, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3290-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td>Add 5 &#181;l of Human TruStain FcX per million cells in 100 &#181;l staining volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (IPA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0295239</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12090-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Ambion)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 4-pack (0.1&#8211;2.5&#956;L, 0.5-10&#956;L, 10&#8211;100&#956;L, 100&#8211;1,000&#956;L variable-volume pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-403-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B23318 (60ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Template Switch Oligo</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>3000228</td>
			<td>Store at -20 &#176;C, used in Master Mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The cell browser is Loup Cell Browser</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger" target="_blank">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The well maintained R platform is Seurat V3</td>
			<td>satijalab</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://satijalab.org/seurat/" target="_blank">https://satijalab.org/seurat/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-3710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1182-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1180-8710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155801</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155803</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>155805</td>
			<td>0.1 - 1.0 &#181;g of antibody in 100 &#181;l of staining buffer for every 1 million cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq RPI primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal I5</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Single-stranded DNA</td>
			<td>100 nmol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed single cell mrna sequencing analysis of mouse embryonic cells

Single cell mRNA sekvensering har gjort betydande framsteg under de senaste åren och har blivit ett viktigt verktyg inom området utvecklingsbiologi. Det har framgångsrikt använts för att identifiera sällsynta cellpopulationer, upptäcka nya markörer gener, och avkoda rumsliga och temporala utvecklingsinformation. Den enda cell metoden har också utvecklats från mikroflödessystem baserad fluidigm C1-teknik till droplet-baserade lösningar under de senaste två till tre åren. Här använde vi hjärtat som ett exempel för att demonstrera hur man profilerar mus embryonala vävnadsceller med hjälp av DROPP-baserade scrna-SEQ-metoden. Dessutom har vi integrerat två strategier i arbetsflödet för att profilera flera exempel i ett enda experiment. Genom att använda en av de integrerade metoderna har vi samtidigt profilerat mer än 9 000 celler från åtta hjärtprover. Dessa metoder kommer att vara värdefulla för utvecklingsbiologin fältet genom att tillhandahålla ett kostnadseffektivt sätt att samtidigt profilera enstaka celler från olika genetiska bakgrunder, utvecklingsstadier, eller anatomiska platser.

I denna studie använde vi mus embryonal hjärta som ett exempel för att ställa ut hur multiplexade Single cell mRNA sekvensering utfördes för att bearbeta de olika proverna från separata delar av ett organ samtidigt. E 18,5 CD1 mus hjärtan isolerades och dissekeras i vänster Atrium (LA), höger förmak (RA), vänster kammare (LV) och höger kammare (RV). De atriella och ventrikulära cellerna var sedan barkodad självständigt med hjälp av en lipid-baserade streckkodning förfara...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells at JoVE.com

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Här presenterade vi en multiplexade Single cell mRNA sekvenseringsmetod för att profilera genuttryck i mus embryonala vävnader. DROPP-baserade Single cell mRNA sekvensering (scRNA-SEQ) metod i kombination med Multiplexing strategier kan profilera enstaka celler från flera prover samtidigt, vilket avsevärt minskar reagenskostnader och minimerar experimentella batcheffekter.

Multiplexerade Single cell mRNA sekvensering analys av mus embryonala celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Single cell mRNA sekvensering används allmänt för att förstå de biologiska processerna på en enda cellnivå. Tillkomsten av multiplexing strategier har ytterligare utökat sina förstärkningar genom att tillåta profilering av flera prover i ett enda experiment, dramatiskt minska kostnaderna och undvika partiet effekter. Demonstrera förfarandet kommer att Wei Feng, en postdoc, och Andrew Przysinda, en tekniker från mitt labb.Efter räkning, dela cellerna isolerade från embryonala dag 18,5 hjärtkammare i fem gånger 10 till den femte alikvoter och tvätta cellerna två gånger med färska PBS per tvätt. Resuspend pelletsen i 180 mikroliter pbs per prov och tillsätt 20 mikroliter av ankar streckkod stamlösning till varje rör med skonsam blandning. Efter en fem minuters inkubation på is, tillsätt 20 mikroliter co-ankare streckkod stamlösning till varje rör med skonsam blandning för ytterligare fem minuters inkubation på is innan du tvättar cellerna tre gånger med en milliliter kall PBS kompletteras med 1%bovin serum albumin per tvätt, sedan filtrera proverna i nya rör genom en 40-mikrometer cell sil per rör.Efter räkning, montera chip B i en spånhållare, tillsätt sedan 75 mikroliter av en 50%glycerol lösning till de oanvända brunnarna i rad ett, 40 mikroliter till de oanvända brunnarna i rad två, och 280 mikroliter till de oanvända brunnarna i rad tre. Observera att ett träningschip används här för att demonstrera proceduren. Tillsätt lämplig volym av cellfjädring och nukleasfritt vatten till masterblandningen med skonsam pipettering.Lägg till 75 mikroliter av den resulterande celllösningen till underkanten av provet väl i rad ett utan bubblor. Vortex gelpärlorna i 30 sekunder innan de långsamt lägger till 40 mikroliter av pärlor till gelpärlens nedre mitt väl i rad två utan bubblor. Tillsätt 280 mikroliter av delningsolja ner sidovägg av partitionering olja väl i rad tre.Fäst packningen på spånan utan att trycka ner på packningen och håll packningen horisontell för att undvika att packningen blöts ned. Ladda det monterade chipet med packningen i kromregulatorn och kör kromet encells B-programmet. Observera att skärmen visar kromträning för träningschipet men för de verkliga experimenten skärmen kommer att visa krom enda cell B.När programmet har slutförts, omedelbart bort chip och kasta packningen.Vik tillbaka locket för att exponera brunnarna i 45 graders vinkel och kontrollera vätskenivåerna för att se till att inga träskor finns. Långsamt aspirera 100 mikroliter av gelpärlor i emulsion från de lägsta punkterna i återhämtningen väl och kontrollera enhetligheten i pärlorna. Dispensera de emulgerade pärlorna ner i väggen på ett nytt PCR-rör på is och placera röret i en termisk cycler för omvänd transkription.För att förbereda cDNA för förstärkning, tillsätt 125 mikroliter av återvinningsmedel till provet vid rumstemperatur. Ingen ogenomskinlig vätska bör observeras och undvika pipettering eller virvelning. Vänta 60 sekunder innan du långsamt tar bort återvinningsmedlet från botten av röret och tillsätt 200 mikroliter av vortex pärla sanering blandning till provet.Pipettera blandningen 10 gånger innan du inkuberas i 10 minuter i rumstemperatur. Därefter placerar du proverna på en magnet i högläget. När lösningen klarnat, ta bort supernatanten och tillsätt 200 mikroliter av 80%etanol till pelleten.Efter 30 sekunder, ta bort etanol och upprepa tvätten ytterligare två gånger. Efter den sista tvätten centrifugerar du provet kortfattat och placerar röret på magneten i lågläge för att provet ska kunna lufttorka mindre än två minuter. När provet har torkat, ta bort röret från magneten och tillsätt 35,5 mikroliter nyberedda elueringslösning.Placera provet på magneten i högt läge, efter två minuters inkubation i rumstemperatur, tills lösningen klarnat innan 35 mikroliter av provet överförs till en ny rörlist. För cDNA-amplifiering med hjälp av den lipidbaserade streckkodningsstrategin, tillsätt förstärkningsreaktionsblandning till cDNA-proverna med 35-mikroliter med grundlig blandning innan kort centrifugering. I slutet av snurrandet inkuberar du provet i termiskcyklern efter lämpligt cDNA-amplifieringsförfarande.Tillsätt 120 mikroliter av välj reagens och 100 mikroliter av ultrarent vatten till 100 mikroliter prov och pipetter den resulterande 0,6 x välj reagens 15 gånger. Efter en inkubering på fem minuter i rumstemperatur, placera provet på magneten tills lösningen blir klar. Överför supernatanten till ett 1,5 milliliter lågrör för multiplexer streckkodade cDNA-bibliotekskonstruktion.Kom ihåg att spara både supernatanterna och basen som supernatantens innehåll sätter ihop streckkodad cDNA och basinnehållet endogent cDNA. Rengör den endogena cDNA med 80%etanol och elute DNA med 40 mikroliter av ellutionsbuffert, kör sedan en kvalitetskontroll av den endogena cDNA innan du förbereder ett endogent avskriftsbibliotek. CDNA-koncentrationen bör kvantifieras och kvalificeras före bibliotekskonstruktion.De konstruerade biblioteken, inklusive de endogena cDNA- och streckkodsbiblioteken, bör också kvantifieras och kvalificeras före sekvensering. Efter sekvensering kan streckkodsuttrycket analyseras i varje enskild cell. Till exempel i denna analys åtta grupper av enstaka celler som unikt uttryckt en typ av streckkod som representerar celler från åtta olika prover observerades.Dessutom uttryckte vissa celler inte någon streckkod och därför definierades som negativa celler, medan andra celler uttryckte två olika streckkoder som representerar dubblerar. Med hjälp av singlet cellerna, cellulära heterogenitet och molekylära förordningar kan bedömas genom celltyp anteckning, nya och sällsynta celltyp identifiering, anatomiska zon jämförande analys och gen ontologi utbildningsavsnitt analys, såsom cellcykel fas separationer. Det är bra att bilden gelpärlorna i emulsion om du kan, som en bild kommer att berätta om förfarandet har varit framgångsrik fram till denna punkt.Provet multiplexering lägger stor flexibilitet i utformningen av dina experiment. Efter att ha sett denna demonstration, jag hoppas att du kommer att vara mer säker på att starta egna experiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generera crispr / Cas9 medierad monoallel Strykningar att studera Enhancer Funktion i mus embryonala stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared embryonala och postnatal Hearts vid encelliga Upplösning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analys av retinsyra-inducerade Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i två och tre-dimensionella Embryoid organ

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analys av hematopoetiska stamceller från embryon prekursorer använder enstaka Cell Index sortering kombinerade med endotelceller nisch samtidig kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Single-cell Transcriptomic analyser av mus bukspottkörtelns endokrina celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Beredning av små RNA-bibliotek för sekvensering från tidiga musembryon

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...