Name: using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers
Uploaded: 2020-01-28T14:00:00
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著者らは、この方法に関する最初の訓練に対して、玉野井冬彦博士とビン・ヴー博士に感謝したいと考えています。エヴァ・コジオレク博士との議論は、このアプローチの最適化に役立ち、非常に高く評価されています。この研究は、以下の情報源からの資金提供なしには不可能でした:タバコ関連疾患研究プログラム博士研究員(27FT-0023、 ACS、国防総省(DoD)卵巣癌研究プログラム(W81XWH-17-1-0160)、NCI/NIH(1R21CA216770)、タバコ関連疾患研究プログラムハイインパクトパイロット賞(27IR-0016)、UCLA機関支援、 JCCCシードグラント(NCI /NIH P30CA016042)とLW研究担当副首相室からの3R助成金を含む。

本書に示された実験はすべて、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の適切な倫理委員会によって審査され、承認されました。識別されていない原発性ヒト腫瘍の使用は、UCLA機関審査委員会(プロトコル番号17-000037、17-001169、および11-001363)によって承認されています。UCLAでは、鶏の胚を使用した実験には動物研究委員会の審査は必要ありません。プロトコルの承認は、卵が孵化する場合に...

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	<li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine.">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li><li>Jackson, S. J., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue+models+in+cancer+research:+looking+beyond+the+mouse.">Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).</li><li>Cheon, D. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+chorioallantoic+membrane+(CAM)+assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis.">Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).</li><li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Chorioallantoic+Membrane+Assay:+A+3D+Animal+Model+for+Study+of+Human+Nasopharyngeal+Carcinoma.">Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).</li><li>Deryugina, E. I., Quigley, J. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Wnt+pathway+inhibition+of+human+squamous+cell+carcinoma+growth+and+metastasis+in+the+chick+chorioallantoic+model.">In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model.</a> Journal of Otolaryngology - Head &amp; Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).</li><li>Canale, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-27+inhibits+pediatric+B-acute+lymphoblastic+leukemia+cell+spreading+in+a+preclinical+model.">Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model.</a> Leukemia. 25, 1815 (2011).</li><li>Loos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino-functionalized+nanoparticles+as+inhibitors+of+mTOR+and+inducers+of+cell+cycle+arrest+in+leukemia+cells.">Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells.</a> Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).</li><li>Rovithi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+bioluminescent+chick+chorioallantoic+membrane+(CAM)+models+for+primary+pancreatic+cancer+cells:+a+platform+for+drug+testing.">Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing.</a> Scientific Reports. 7, 44686 (2017).</li><li>Majern&#237;k, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Insights+into+the+Effect+of+Hyperforin+and+Photodynamic+Therapy+with+Hypericin+on+Chosen+Angiogenic+Factors+in+Colorectal+Micro-Tumors+Created+on+Chorioallantoic+Membrane.">Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).</li><li>Swadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+chick+chorioallantoic+membrane+xenograft+model+of+neuroblastoma+for+drug+delivery.">Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery.</a> BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).</li><li>Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+chorioallantoic+membrane+as+an+in+vivo+xenograft+model+for+Burkitt+lymphoma.">The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma.</a> BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).</li><li>Avram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+A375+human+melanoma+models+on+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane+and+Balb/c+nude+mice.">Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice.</a> Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).</li><li>Zabielska-Koczywas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+as+an+in+vivo+model+to+study+morphological+and+histopathological+features+of+feline+fibrosarcomas.">3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas.</a> BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).</li><li>Skowron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+the+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane+assay+to+study+treatment+approaches+in+urothelial+carcinoma.">Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma.</a> Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).</li><li>Jefferies, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+imaging+of+engineered+human+tumors+in+the+living+chicken+embryo.">Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).</li><li>Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+rapid+in+vivo+system+for+testing+therapeutics+on+human+leukemias.">A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias.</a> Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).</li><li>Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+and+immunohistochemical+comparison+of+U87+human+glioblastoma+cell+xenografts+on+the+chicken+chorioallantoic+membrane+and+in+rat+brains.">Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains.</a> Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology.">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Non-integrating+Lentiviral+Approach+Overcomes+Cas9-Induced+Immune+Rejection+to+Establish+an+Immunocompetent+Metastatic+Renal+Cancer+Model.">A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 9, 203-210 (2018).</li></ol>

CAMモデルを用いた腫瘍の拡大および生着は既存のin vivo動物モデルよりより速く、直接観察可能な腫瘍の成長を可能にする。さらに、特に免疫不全マウスのコストと比較して、機器の最初の購入が完了すると、コストは大幅に低くなります。鶏の胚の初期の免疫不全状態は、ヒトおよびマウス組織の生着を容易に可能にする。これらの強みがあっても、CAM モデルには制限があります。長期的?...

マウスは、悪性腫瘍を含むヒト疾患の研究のための古典的なモデル生物として機能している。哺乳類として、彼らは人間と多くの類似点を共有しています。それらの高度な遺伝的類似性は、ヒト疾患の遺伝的制御に対する巨大な洞察を提供するために、マウスゲノムのトランスジェニック操作を可能にした1.マウスの取り扱いと実験に関する豊富な経験は、その結果、生物医学研究のための選択のモデルとなっています。しかし、マウスモデルに関する倫理的および科学的な懸念に加えて、彼らはまた、非常に高価で時間がかかる可能性があります2,3.腫瘍の発症には数週間から数ヶ月かかる場合があります。典型的な施設の住宅だけでも、腫瘍が発達している間、数百〜数千ドルで実行することができます。卵巣癌は、マウスモデルの成長が容易に数ヶ月かかることがあるため、この欠点の一例である。研究の進行の遅れは、卵巣癌患者の持続的に低い5年生存率にわずか47%(すなわち、30年間でわずか10%の生存率の増加)に影響を与える可能性4。同様に、泌尿器科癌(腎臓、前立腺、膀胱癌)は、米国における全癌症例の19%、癌関連死の11%を占めている4。したがって、婦人科癌と泌尿器科癌を研究するための新しいインビボアプローチは、たとえこのモデルが最初のスクリーニング実験にのみ適用されるとしても、実験室にかなりの時間、労力、そしてお金を節約できる。さらに、結果として得られる研究結果の加速は、これらの癌と診断された177,000人の個人に大きな影響を与える可能性があります。
Chicken CAMモデルは、前述の問題に対処する多くの利点を提供します。血管新生5、6、腫瘍細胞浸潤7、8、転移7、9を研究する一般的なモデルは、神経膠腫10、11、12、頭頸部および頸部扁平上皮癌13、14、白血病15、16、膵臓癌17、膵臓癌17、および膵臓癌17、および癌の多くの形態を研究するために既に使用されている大腸癌18.さらに、CAMモデルは、神経芽細胞腫19、バーキットリンパ腫20、黒色腫21、およびネコ線維肉腫22に対して生成されている。以前の研究では、膀胱癌23および前立腺癌細胞株24の生着も提示されているが、プロトコルの詳細は限られている。卵はマウスよりずっと安いだけでなく、再現性の高い結果25、26を生み出す。それらは速い血管系の発達を示し、腫瘍の生着は数日の速さで起こり、開いた窓を通して縦方向に視覚化することができる。卵子受精と孵化の間の21日の時間枠で、実験は数週間以内に完了することができます。さらに、低コスト、限られた住宅ニーズ、および小型は、マウス研究のために禁止される大規模な実験を容易に可能にする。
そこで、婦人科がんや泌尿器科がんの生着に向けてCAMモデルを最適化することを検討しました。初期の鶏胚27の免疫不全状態のために、マウスおよびヒト細胞の両方を容易に移植することができる。したがって、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌の生着に成功しました。これらの腫瘍タイプのそれぞれについて、CAMは確立されたマウスおよび/またはヒト腫瘍細胞株を容易に受け入れる。重要なことに、採取された新しい原発性ヒト腫瘍組織は、消化された細胞または高い成功率を有する固形組織の断片から生着することもできる。これらのがんの種類と細胞源のそれぞれは、最適化が必要です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings</td>
			<td>The O-Ring Store</td>
			<td>TEF010</td>
			<td>Nonstick ring for cell seeding. 1/4&#34;ID X 3/8&#34;OD X 1/16&#34;CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C4-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3314</td>
			<td>Human prostate cancer cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CWR22Rv1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-44929-0.02mg</td>
			<td>Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Firefly, potassium salt</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS6703</td>
			<td>This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8050-N/18</td>
			<td>This kit contains all necessary tools.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)</td>
			<td>AA Lab Eggs Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-1376</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1472</td>
			<td>Human bladder cancer cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit</td>
			<td>Incubator Warehouse</td>
			<td>HB1588D-NONE-1102-1588-1357</td>
			<td>Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ID8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Not commercially available, please see PMID: 10753190.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incu-Bright Cool Light Egg Candler</td>
			<td>Incubator Warehouse</td>
			<td>1102</td>
			<td>Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>15915</td>
			<td>This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Clipper Distributing</td>
			<td>0010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II In Vivo Imaging System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Extracellular matrix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyC-CaP</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3255</td>
			<td>Murine prostate cancer cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td>Any similar pipet controller would be appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td>This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RENCA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td>This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td>Human ovarian cancer cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72914</td>
			<td>This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton Balls</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-456-885</td>
			<td>This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>GRPL06</td>
			<td>This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T24</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-4</td>
			<td>Human bladder cancer cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8&#34; x 2 3/4&#34;</td>
			<td>Moore Medical</td>
			<td>21272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353803</td>
			<td>This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>AACUN017</td>
			<td>This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the chicken chorioallantoic membrane in vivo model to study gynecological and urological cancers

マウスモデルは、インビボ癌研究のベンチマーク検査です。しかし、コスト、時間、倫理的配慮により、生体内がんモデルの代替が求められています。鶏絨毛性膜(CAM)モデルは腫瘍の発生の直接視覚化を可能にし、生体内のイメージ投射のために適している安価で、急速な代わりの代わりを提供する。そこで、婦人科腫瘍と泌尿器科腫瘍をこのモデルに移植するための最適化されたプロトコルを開発しようとしました。受精後約7日間、空気細胞は卵の血管化側に移動し、そこで開口部がシェルに作成される。マウスおよびヒト細胞株および一次組織からの腫瘍は、その後生着することができる。これらは、通常、細胞外マトリックスと培地の混合物に播種され、細胞の分散を回避し、細胞が血管供給を募集するまで栄養補助を提供する。腫瘍は、卵が孵化する前にさらに14日間まで成長し得る。ホタルルシフェラーゼを安定してトランスキュアした細胞を移植することにより、生物発光イメージングは、胚全体に広がる膜および癌細胞上の腫瘍増殖の敏感な検出に使用することができる。このモデルは、潜在的に腫瘍原性、浸潤、転移、および治療効果を研究するために使用することができます。鶏のCAMモデルは従来のマウスモデルと比較してかなり少ない時間および財源を必要とする。卵は免疫不全で免疫寛容であるため、あらゆる生物の組織を、ヒト組織の移植に必要な高価なトランスジェニック動物(例えばマウス)なしで移植できる可能性がある。しかし、このモデルの利点の多くは、腫瘍発生時間の短縮や免疫不全/免疫寛容な状態など、潜在的に制限である可能性があります。さらに、ここに提示されたすべての腫瘍タイプは鶏絨毛性膜モデルに生着したが、腫瘍の成長の程度はさまざまである。

これまでのところ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌癌および膀胱癌に対してこの移植方法が成功することを発見した。各々は、柔軟性があるかもしれないが、移植のための特定の条件を識別するために最適化された。検査された腫瘍タイプのうち、卵巣癌の増殖は、生物発光イメージングの助けを借りずに顕著で、典型的には見えない(図1)。しかし?...

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Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

我々は、婦人科および泌尿器科癌細胞株および患者由来腫瘍の生着のための代替、移植可能なインビボモデルとして鶏絨毛アラント膜モデルを提示する。

生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

鶏絨毛膜(CAM)上への腫瘍の生着は、腫瘍原性、治療効果または細胞クロストークの研究に使用することができる。この方法は、生体内での免疫寛容における費用対効果の高い急速な腫瘍増殖を可能にする。CAMモデルを用いて、新しい治療アプローチは、細胞株または患者腫瘍標本を用いて迅速に試験することができる。このプロトコルの最も重要な側面は、適切なCAM形成を確保し、卵を開いている間にCAMまたは血管系を破壊しないことです。CAMが完全に発達した7または8日目に、卵回転子をオフにし、バイオセーフティキャビネットの卵ラックに約1〜3個の卵を入れます。ライトを消した状態で、卵殻に卵のろうそくを置いて1つの卵の空気細胞の位置を識別してマークし、卵のろうそくをシェルの上に移動して大きな血管ネットワークを見つけ、必要に応じて卵を回転させます。理想的な血管系は卵の真ん中付近に分岐します。マーカーを使用して、移植に使用する血管系を追跡します。ボンネットのライトを元に戻した後、シリコンカーバイド砥石を取り付けたコードレスロータリーツールを使用して、シェルの小さな穴をエアセルの中央に直接掘削します。シェルの大部分が除去されたが、白い内膜がそのままである場合は、ちょうど実証したように、血管窓が開く別の小さな穴を開けます。2つ目の穴が開いたら、18ゲージの針を使用して白い内膜を空気細胞の上に優しく突き刺し、血管構造は掘削領域全体全体で白い内膜ではなく、CAMが破壊されることを注意してください。フードライトを再び消灯したら、卵のろうそくを使って、空気細胞が卵の端から脈管構造上の領域に移されたことを確認します。必要に応じて、元の空気セルの穴の周りにピペットコントローラに挿入された真空チューブを配置し、穏やかに空気セルを移動するために短いバーストで吸引を適用します。空気CAM境界内の約0.5センチメートルの空気セルの新しい位置の輪郭をマークし、新しい空気セルの上に穴を覆うのに十分な大きさの梱包テープを固定します。ちょうど実証したように他の2つの卵を準備した後、卵をインキュベーターに戻し、実証したように1〜3のグループで実験のための追加の卵を開きます。すべての卵が開いたら、バイオセーフティキャビネットの卵ラックに空気細胞を再配置した卵を1〜3個の卵に移し、円形の切断ホイールを取り付けたコードレスロータリーツールを使用して、CAMまたは血管構造を破壊することなく、空気細胞の境界を完全に切断します。湾曲したはさみを使用して、残りの空気セルの周りを切り取ってシェルに窓を作成し、胚の生存率を確認する。生存可能な胚は、広範な血管系、明確なアルブミン、胚の動き、および/または目に見える心拍を表示します。非生存性の胚では、CAMは、存在する血管が少なく、胚が動きや心拍なしに小さくても存在しない場合でも不透明に見える。Semkin鉗子を使用して、無菌綿ボールから綿の小片を引っ張り、生き残った胚のCAM表面を穏やかにブロットしてシェルのほこりや破片を取り除き、CAMに触れることなく6%から7センチメートルの透明フィルムドレッシングでシェル開口部を覆い、開いた窓を上に向けたインキュベーターに卵を返します。卵ラック、卵回転子の縁、または転がり続ける卵を支えるために別の適切なアイテムを使用してください。移植のための癌細胞懸濁液を調製するために、遠心分離によって目的の癌細胞培養物から細胞を収穫し、細胞を沈下する。上清を吸引し、残留培地中の細胞を機械的に再懸濁する。細胞懸濁液を氷の上に置き、ピペットを使用して培地中の細胞の体積を測定します。その後、20〜100マイクロリットルの培地中の10〜200万マイクロリットルの濃度で細胞を再懸濁し、1ミリリットル細胞外マトリックスおよび任意の成長因子または他の目的の添加物を添加する。がん細胞移植の場合、ノンスティックリングを使用して、卵ラックに埋め込まれる卵を最大6個置き、透明なフィルムドレッシングの端を開いた窓に向かって転がして、皮からフィルムを取り除きます。卵が実行可能で健康であるかどうかを確認してください。理想的な卵は開いた区域の中心の小さい分岐容器を持つ大きい容器を持つ。湾曲した虹彩鉗子を使用して、理想的には分岐点の上に容器の上にCAMに無菌非粘着性リングを置く。滅菌ガラス攪拌棒を使用してCAMを優しくブラドし、癌細胞懸濁液をリングの中央にピペットします。すべての細胞が送達されたら、6%の4分の1から7センチメートルの透明なフィルムドレッシングで開口部を密封し、卵に適切なインプラント指定でラベルを付けます。その後、卵をインキュベーターにしっかりと入れ、殻の開口部を直立させます。非スティックリングを使用せずに癌細胞を移植するには、細胞懸濁液を適切なサイズのピペットチップに吸引し、先端の上部を慎重に取り出し、先端を無菌10センチメートルの組織培養皿に水平に置く。チップを積んだ後、皿を摂氏37度のインキュベーターに15〜30分間入れ、15分後に重合を確認します。少量の液体は、通常、各チップが皿に入れられると漏れ出します。この液体を使用して、先端内の重合の程度を推定する。マトリックスの準備ができたら、適切なサイズのピペットに1つのチップを置き、プランジャーを押し下げ、部分的に重合した細胞懸濁液をCAM上に押し付けます。これらの方法を用いて、ヒトおよびマウスの卵巣癌細胞株および原発性腫瘍片の両方が、他のin vivoモデルで観察されたものと一致する形態を有する腫瘍の生着に成功した。試験された腫瘍タイプのうち、卵巣癌の増殖ははるかに顕著ではなく、典型的には生物発光イメージングの助けを借りずに見えない。移植時に成長因子またはホルモンを加える効果もこれらの方法を使用してテストすることができます。.腎臓癌の場合、確立された細胞株または原発性ヒト腎腫瘍からの断片からの明確な細胞腎細胞癌細胞の移植は、迅速で堅牢な腫瘍形成を生じる。また、複数のヒトおよびマウス前立腺癌細胞株およびヒト膀胱癌細胞株および原発性腫瘍片を用いて、このモデルを用いて腫瘍を確立した。CAM と血管構造を破壊しないようにし、ウィンドウを開いている間に CAM がシェルに付着しないようにすることが重要です。生着が成功した後、CAMモデルは、腫瘍内の異なる細胞タイプ間の目的または相互作用の治療効果を評価するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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