Name: identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par Des subventions en aide du Ministère de l'éducation, Culture, Sports, Science et Technologie, Japon (#19H03430 et #17K09405 à M.O., et #19J11829 à K.S.), par une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (#18H05024 à M.O.), par le Programme de recherche sur l'hépatite du Japon Agency for Medical Research and Development, AMED (à M.O., #JP19fk021005), par programme sur le développement innovant et l'application de nouveaux médicaments pour l'hépatite B.( #JP19fk0310102 à K.K.) la Japan Foundation for Applied Enzymology et de la Kobayashi Foundation for Cancer Research (à M.O.), par GSK Japan Research Grant 2018 (à K.S.), et par une subvention de la Miyakawa Memorial Research Foundation (à K.S.).

REMARQUE: Une représentation schématique de l'analyse de la luciferase fendue est indiquée à la figure 1A, et le processus d'analyse est décrit à la figure 1B. La dynamique d'interaction peut être mesurée en temps réel sans lyse cellulaire.
1. Préparation cellulaire
<ol><li>Maintenir les cellules HEK293T cultivées dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complé...

<ol>
	<li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hepatitis+B+infection:+a+review.">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+pathogenesis:+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA.">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li><li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression.">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).</li><li>Murphy, C. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+Methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).</li><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening.">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li><li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+as+drug+targets.">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li><li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., Andr&#233;, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomics:+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery.">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115 (2014).</li><li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens.">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li></ol>

Nous avons développé une méthode de criblage pratique utilisant un test de luciferase split pour trouver des inhibiteurs de liaison HBx-DDB1. La dynamique d'interaction peut être détectée en temps réel dans les cellules vivantes sans avoir besoin de lyse cellulaire. L'inhibition de l'interaction HBx-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6, ce qui entraîne la suppression de la transcription virale, l'expression des protéines, et la production cccDNA7. Ce nouveau mécanisme d'action antiv...

L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) est un problème majeur de santé publique dans le monde entier, avec des estimations annuelles de 240 millions de personnes infectées de façon chronique par le VHB et de 90 000 décès dus à des complications de l'infection, y compris la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (HCC)1. Bien que les agents thérapeutiques anti-HBV actuels, analogues nucléos(t)ide, inhibent suffisamment la transcription inverse virale, ils atteignent rarement l'élimination des protéines virales, qui est l'objectif clinique à long terme. Leur mauvais effet sur l'élimination des protéines virales est dû à leur manque d'effet direct sur la transcription virale des minichromosomes d'ADN circulaires épisomiques covalentement fermés (cccDNA) dans le noyau d'hépatocyte2.
La transcription du VHB est activée par la protéine HBV regulatory X (HBx)3. Des études récentes ont révélé que HBx dégrade le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), un facteur de restriction de l'hôte qui bloque la transcription du VHB de cccDNA, par le détournement d'un DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase complexe4,5,6. Par conséquent, une étape cruciale dans la promotion de la transcription virale de cccDNA est pensé pour être l'interaction HBx-DDB1. Les composés capables d'inhiber la liaison entre HBx et DDB1 peuvent bloquer la transcription virale, et en effet le nitazoxanide a été identifié comme un inhibiteur de l'interaction HBx-DDB1 via un système de criblage développé dans notre laboratoire7.
Ici, nous présentons notre système de criblage commode utilisé pour identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1, qui utilise un test complémentaire de luciferase fractionnée7,8. Les sous-unités de luciferase fendues sont fusionnées à HBx et DDB1, et l'interaction HBx-DDB1 amène les sous-unités à proximité pour former une enzyme fonctionnelle qui génère un signal luminescent lumineux. Comme l'interaction entre les sous-unités est réversible, ce système peut détecter des protéines HBx-DDB1 dissociantes rapidement dissociantes (figure 1). À l'aide de ce système, une grande bibliothèque de composés peut être facilement examinée, ce qui peut entraîner la découverte de nouveaux composés capables d'inhiber efficacement l'interaction HBx-DDB1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM</td>
			<td>Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene transfection reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301425</td>
			<td>Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>175012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 96 microplate luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBx&#8211;LgBit expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI starter systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2015</td>
			<td>Includes Nano-Glo Live Cell Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Described as &#34;buffered cell culture medium&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841</td>
			<td>Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate&#183;HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine&#183;HCl, micafungin, miconazole, midodrine&#183;HCl, miglitol, milnacipran&#183;HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril&#183;HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin&#183;Na, naftifine&#183;HCl, naratriptan&#183;HCl, natamycin, nebivolol&#183;HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&#183;HCl, olsalazine&#183;Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline&#183;HCl, paliperidone, palonosetron&#183;HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&#183;HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBit&#8211;DDB1 expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system

Il y a un besoin urgent de nouveaux agents thérapeutiques pour l'infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Bien que les analogues nucléos(t)ide actuellement disponibles inhibent puissamment la réplication virale, ils n'ont aucun effet direct sur l'expression des protéines virales transcrites à partir d'un ADN circulaire viril covalently fermé (cccDNA). Comme une charge élevée d'antigène viral peut jouer un rôle dans cette carcinogenèse chronique et liée au VHB, l'objectif du traitement du VHB est d'éradiquer les protéines virales. La protéine régulatrice du VHB X (HBx) se lie à la protéine 1 (DDB1) qui lie les dommages à l'ADN de l'hôte pour dégrader le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), ce qui entraîne l'activation de la transcription virale de l'ADN-ccc. Ici, à l'aide d'un système d'analyse de complémentarité de la luciférase fractionnée, nous présentons un système complet de dépistage composé pour identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1. Notre protocole permet une détection facile de la dynamique d'interaction en temps réel au sein des cellules vivantes. Cette technique peut devenir un essai clé pour découvrir de nouveaux agents thérapeutiques pour le traitement de l'infection par le VHB.

Les résultats représentatifs à la suite de l'utilisation de ce protocole sont indiqués à la figure 2A,B. Le rapport signal-arrière était supérieur à 80 et le facteurZ 9 (l'indice de qualité de l'étalon-or pour le dépistage à haut débit) était supérieur à 0,5, ce qui indique que ce système d'analyse était acceptable pour le dépistage à haut débit. Avec le seuil fixé à l'inhibition de 40% par rapp...

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Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Ici, nous présentons une méthode pour le dépistage des agents viraux anti-hépatite B qui inhibent l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'évaluation de la luciferase fractionnée. Ce système permet une détection facile des interactions protéines-protéines et convient à l'identification des inhibiteurs de ces interactions.

Identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'assay Split Luciferase

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

L’interaction HBX-DDB1 est une étape cruciale pour promouvoir la transcription du VPH à partir de l’AICDNA, de sorte que ce protocole peut devenir un atout clé pour découvrir de nouveaux agents thérapeutiques pour la guérison fonctionnelle du VPH. Notre procédure est simple et ne nécessite qu’un court laps de temps pour l’écran. L’interaction que je mélange peut être détectée en temps réel sans nécessiter de lyse cellulaire.En outre, la qualité de dépistage est satisfaisante avec un score élevé Z prime. L’inhibition de l’interaction HBX-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6, ce qui entraîne la suppression de la transcription du VPH, de l’expression des protéines et de la production de cccDNA. Ce nouveau mécanisme d’action antivirale peut surmonter les insuffisances des thérapies actuelles de HPV.Les interactions protéine-protéine sont une classe importante de cibles médicamenteuses. L’acide à base de luciferase fendue décrit ici, qui cible les interactions entre les protéines virales et hasS, peut fournir une nouvelle stratégie pour développer des remèdes pour d’autres maladies infectieuses. Bien que notre protocole soit simple et facile à comprendre, certaines étapes peuvent être difficiles à reproduire sans la démonstration visuelle.Ainsi, la démonstration visuelle sera d’une grande aide pour comprendre notre protocole. Commencez par ensemencer cinq fois 10 à la 5e cellule HEK293T dans un plat de 100 millimètres avec 10 millilitres de DMEM, et les incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, diluer un microgramme chacun de HBx-LgBit et SmBit-DDB1 exprimant des plasmides d’ADN et un tampon de condensation d’ADN pour un volume total de 300 microlitres.Ajouter 16 microlitres de solution enhancer, et mélanger les tubes par vortex pendant une seconde. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes, puis ajouter 60 microlitres de réavenant transfection. Vortex le tube pendant 10 secondes, et incuber l’échantillon pendant encore huit minutes.Pendant ce temps, aspirer le milieu du plat avec les cellules et les laver avec cinq millilitres de PVS. Aspirer le PVS et ajouter sept millilitres de DMEM. Ajouter trois millilitres de DMEM au tube avec les complexes de transfection, pipette de haut en bas pour mélanger, et ajouter le mélange aux cellules.Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 10 heures. Après l’incubation, retirer le milieu de culture usé et laver les cellules avec cinq millilitres de PVS. Retirez le PVS à un millilitre de 0,25% trypsine EDTA, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pour les détacher.Ensuite, ajouter quatre millilitres de DMEM, et disperser le milieu en le pipetting sur la surface de la couche cellulaire à plusieurs reprises, et transférer la suspension dans un tube. Centrifuger les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant, et de suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans un millilitre de PVS. Répétez la cérifugation et jetez le supernatant.Puis, re-suspendre la pastille cellulaire avec milieu de culture cellulaire tamponné complété par 10%FBS à une densité d’ensemencement d’un million de cellules par millilitre. Pipette 50 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, et retourner les cellules à l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant 10 heures. Pendant que les cellules couvent, diluer les composés de criblage et le solvant à 13,5 X de concentration.Ajouter 12,5 microlitres de substrat luminescent à chaque puits et incuber la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. Mesurez la luminescence de base à l’aide d’un luminomètre, et ajoutez cinq microlitres des composés et dmso contrôlé à chaque puits immédiatement après. Mesurer la luminescence toutes les 30 minutes pendant deux heures, puis calculer les effets inhibiteurs des composés par rapport au traitement DMSO.Des signaux de luminescence de ligne de base ont été mesurés, et le rapport signal-arrière-plan a été calculé pour être supérieur à 80. Le z prime était supérieur à 0,5, ce qui indique que ce système d’analyse est acceptable pour le criblage à haut débit. En fixant le seuil à plus de 40% d’inhibition par rapport au contrôle DMSO seulement, le nitazoxanide a été identifié comme un médicament candidat.Nous avons précédemment identifié le nitazoxanide comme inhibiteur de l’interaction HBX-DDB1 en sélectionnant une bibliothèque composée à petite échelle réactive avec cette méthode. En utilisant le nitazoxanide, nous confirmons que l’inhibition de l’interaction HBX-DDB1, cette réduction de la transcription virale, et les niveaux de produits viraux ultérieurs. La partie optimale de la luciferase fendue fusionnée à une protéine cible doit être déterminée à l’avance.Dans ce cas, HPX fusionné à Large Bit au terminus C de HPX et DDB1 fusionné à Small Bit à la fin terminus de DDB1 fourni les meilleurs résultats.

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