Name: identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System at JoVE.com

इस काम को शिक्षा मंत्रालय से अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी, जापान (#19H03430 और M.O.के लिए #17K09405, और K.S. के #19J11829), एक अनुदान में अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (#18H05024 से M.O.), जापान एजेंसी से चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए हेपेटाइटिस पर अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा, AMED (M.O., #JP19fk021005), अभिनव विकास और हेपेटाइटिस बी के लिए नई दवाओं के आवेदन पर कार्यक्रम द्वारा (#JP19fk0310102 के केके) से अनुदान से, AMईडी से अनुदान से जापान फाउंडेशन फॉर एप्लाइड एंजाइमोलॉजी और कोबायाशी फाउंडेशन फॉर कैंसर रिसर्च (एमओ) से, जीएसके जापान रिसर्च ग्रांट 2018 (केएस) द्वारा, और मियाकावा मेमोरियल रिसर्च फाउंडेशन (केएस) से अनुदान द्वारा।

नोट:स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1एमें दिखाया गया है और परख प्रक्रिया को चित्रा 1बीमें रेखांकित किया गया है । इंटरैक्शन डायने?...

<ol>
	<li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hepatitis+B+infection:+a+review.">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+pathogenesis:+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA.">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li><li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression.">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).</li><li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5/6+to+Enhance+HBV+Replication.">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li><li>Decorsi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5/6+complex+as+a+host+restriction+factor.">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li><li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Smc5/6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection.">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648 (2017).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction.">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li><li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+Methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).</li><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening.">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li><li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+as+drug+targets.">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li><li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., Andr&#233;, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomics:+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery.">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115 (2014).</li><li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens.">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li></ol>

हमने एचबीएक्स-डीडीबी1 बाध्यकारी अवरोधकों को खोजने के लिए एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख का उपयोग करके एक सुविधाजनक स्क्रीनिंग विधि विकसित की। कोशिका ओं की आवश्यकता के बिना जीवित कोशिकाओं में वास्तविक स?...

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय है, २४०,०००,००० लोगों के वार्षिक अनुमानों के साथ लंबे समय से एचबीवी से संक्रमित और ९०,००० संक्रमण से जटिलताओं के कारण मौतें, सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी)1सहित । हालांकि वर्तमान एंटी-एचबीवी चिकित्सीय एजेंट, नाभिक (टी) इडालॉग, वायरल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को पर्याप्त रूप से रोकते हैं, वे शायद ही कभी वायरल प्रोटीन के उन्मूलन को प्राप्त करते हैं, जो दीर्घकालिक नैदानिक लक्ष्य है। वायरल प्रोटीन उन्मूलन पर उनका खराब प्रभाव हेपेटोसाइट नाभिक2में एपीसोमल वायरल सहसंयोजक रूप से बंद परिपत्र डीएनए (सीसीसीटीएना) मिनीक्रोमोसोम से वायरल ट्रांसक्रिप्शन पर सीधे प्रभाव की कमी के कारण है।
एचबीवी ट्रांसक्रिप्शन एचबीवी रेगुलेटरी एक्स (एचबीएक्स) प्रोटीन3द्वारा सक्रिय है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एचबीएक्स गुणसूत्रों 5/6 (Smc5/6) के संरचनात्मक रखरखाव को नीचा दिखाता है, एक मेजबान प्रतिबंध कारक है कि सीसीडीएनए से एचबीवी प्रतिलेखन ब्लॉक, एक DDB1-CUL4-ROC1 E3 सर्वव्यापी लिगास परिसर4,5,6अपहरण के माध्यम से । इसलिए, सीसीसीटीएसे वायरल ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण कदम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन माना जाता है। एचबीएक्स और डीडीबी1 के बीच बाध्यकारी को बाधित करने में सक्षम यौगिकों वायरल ट्रांसक्रिप्शन को अवरुद्ध कर सकता है, और वास्तव में नाइटाज़ोक्सनाइड को हमारी प्रयोगशाला7में विकसित स्क्रीनिंग प्रणाली के माध्यम से एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधक के रूप में पहचाना गया था।
यहां, हम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली अपनी सुविधाजनक स्क्रीनिंग प्रणाली पेश करते हैं, जो एक विभाजन लूसिफ़ेरेज़ पूरक परख7,8का उपयोग करता है। स्प्लिट लूसिफ़ेरेज उपइकाइयों को एचबीएक्स और डीडीबी1 में जोड़ दिया जाता है, और एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन उपइकाइयों को एक कार्यात्मक एंजाइम बनाने के लिए निकटता में लाता है जो एक उज्ज्वल ल्यूमिनेसेंट संकेत उत्पन्न करता है। चूंकि उपइकाइयों के बीच बातचीत उलटा है, इसलिए यह प्रणाली एचबीएक्स-डीडीबी1 प्रोटीन(चित्रा 1)को तेजी से अलग करने का पता लगा सकती है। इस प्रणाली का उपयोग करके, एक बड़े यौगिक पुस्तकालय की आसानी से जांच की जा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन को कुशलतापूर्वक बाधित करने में सक्षम उपन्यास यौगिकों की खोज हो सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM</td>
			<td>Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene transfection reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301425</td>
			<td>Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>175012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 96 microplate luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBx&#8211;LgBit expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI starter systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2015</td>
			<td>Includes Nano-Glo Live Cell Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Described as &#34;buffered cell culture medium&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841</td>
			<td>Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate&#183;HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine&#183;HCl, micafungin, miconazole, midodrine&#183;HCl, miglitol, milnacipran&#183;HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril&#183;HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin&#183;Na, naftifine&#183;HCl, naratriptan&#183;HCl, natamycin, nebivolol&#183;HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&#183;HCl, olsalazine&#183;Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline&#183;HCl, paliperidone, palonosetron&#183;HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&#183;HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBit&#8211;DDB1 expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण के लिए उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों की तत्काल आवश्यकता है। हालांकि वर्तमान में उपलब्ध नाभिक (टी) आईडीई एनालॉग शक्तिशाली रूप से वायरल प्रतिकृति को रोकते हैं, लेकिन वायरल सहसंयोजक बंद परिपत्र डीएनए (सीसीसीटीएना) से लिखित वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर उनका कोई सीधा प्रभाव नहीं पड़ता है। चूंकि उच्च वायरल एंटीजन लोड इस पुरानी और एचबीवी से संबंधित कार्सिनोजेनेसिस में भूमिका निभा सकता है, इसलिए एचबीवी उपचार का लक्ष्य वायरल प्रोटीन को समाप्त करना है। एचबीवी नियामक प्रोटीन एक्स (एचबीएक्स) गुणसूत्रों 5/6 (Smc5/6) के संरचनात्मक रखरखाव को नीचा दिखाने के लिए मेजबान डीएनए क्षति-बाध्यकारी प्रोटीन 1 (DDB1) प्रोटीन को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप सीसीसीटीडीएनए से वायरल ट्रांसक्रिप्शन की सक्रियता होती है । यहां, एक विभाजन लूसिफ़ेरेज़ पूरक परख प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक व्यापक यौगिक स्क्रीनिंग प्रणाली पेश करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं के भीतर वास्तविक समय में बातचीत की गतिशीलता का आसानी से पता लगाने में सक्षम बनाता है। यह तकनीक एचबीवी संक्रमण के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों की खोज करने के लिए एक महत्वपूर्ण परख बन सकती है।

इस प्रोटोकॉल के उपयोग के बाद प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2ए, बीमें दिखाए जाते हैं। सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात 80 से अधिक था और जेड फैक्टर9 (उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के ...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System at JoVE.com

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

यहां, हम एंटी-हेपेटाइटिस बी वायरल एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख सिस्टम का उपयोग करके एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन को रोकते हैं। यह प्रणाली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का आसानी से पता लगाने की अनुमति देती है और ऐसी बातचीत के अवरोधकों की पहचान करने के लिए उपयुक्त है।

एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख सिस्टम का उपयोग करके एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करना

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

एचबीएक्स-डीडीबी 1 इंटरैक्शन सीसीडीएनए से एचपीवी ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, इसलिए यह प्रोटोकॉल एचपीवी कार्यात्मक इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों की खोज करने के लिए एक महत्वपूर्ण संपत्ति बन सकता है। हमारी प्रक्रिया सरल है और स्क्रीन करने के लिए केवल एक कम समय की आवश्यकता है। मैं जिस बातचीत को मिलाऊं, उसे वास्तविक समय में सेल लाइसिस की आवश्यकता के बिना पता लगाया जा सकता है।इसके अलावा, स्क्रीनिंग गुणवत्ता एक उच्च जेड प्राइम स्कोर के साथ संतोषजनक है। एचबीएक्स-डीडीबी 1 इंटरैक्शन के अवरोध से Smc5/6 की बहाली होती है, जिसके परिणामस्वरूप एचपीवी ट्रांसक्रिप्शन, प्रोटीन अभिव्यक्ति और सीसीसीडीएनए उत्पादन का दमन होता है । एंटीवायरल कार्रवाई का यह उपन्यास तंत्र वर्तमान एचपीवी चिकित्सा की अपर्याप्तता को दूर कर सकता है।प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन दवा लक्ष्यों का महत्वपूर्ण वर्ग है। यहां वर्णित स्प्लिट-लूसिफ़ेरेस आधारित एसिड, जो वायरल और हास प्रोटीन के बीच बातचीत को लक्षित करता है, अन्य संक्रामक रोगों के लिए इलाज विकसित करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकता है । यद्यपि हमारा प्रोटोकॉल सरल और समझने में आसान है, लेकिन दृश्य प्रदर्शन के बिना कुछ कदम पेश करना मुश्किल हो सकता है।इस प्रकार, दृश्य प्रदर्शन हमारे प्रोटोकॉल को समझने में एक बड़ी मदद होगी। डीएमईएम के 10 मिलीलीटर के साथ 100 मिलीमीटर डिश में 5वीं HEK293T कोशिकाओं को पांच बार 10 से सीडिंग करके शुरू करें, और उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करें। अगले दिन, एचबीएक्स-एलजीबिट और एसएमबिट-डीडीबी1 के एक माइक्रोग्राम को पतला करें, जो 300 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा के लिए डीएनए प्लाज्मिड और डीएनए संघनन बफर व्यक्त करते हैं।वर्धक समाधान के 16 माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक सेकंड के लिए भंवर से ट्यूबों को मिलाएं। तीन मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना इनक्यूबेट, तो ट्रांसफैक्शन अभिकर्ण के ६० माइक्रोलीटर जोड़ें । भंवर 10 सेकंड के लिए ट्यूब, और एक और आठ मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेट ।इस बीच, कोशिकाओं के साथ पकवान से माध्यम को एस्पिरेट करें और उन्हें पीवीएस के पांच मिलीलीटर से धोएं। पीवीएस को एएसपाइप करें और डीएमईएम के सात मिलीलीटर जोड़ें। ट्रांसफेक्शन कॉम्प्लेक्स के साथ ट्यूब में डीएमईएम के तीन मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें, और मिश्रण को कोशिकाओं में जोड़ें।इसके बाद कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और पांच फीसद कार्बन डाई ऑक्साइड को 10 घंटे तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, खर्च किए गए संस्कृति माध्यम को हटा दें, और कोशिकाओं को पीवीएस के पांच मिलीलीटर से धोएं। 0.25% ट्राइप्सिन ईडीटीए के एक मिलीलीटर पर पीवीएस निकालें, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि उन्हें अलग किया जा सके।इसके बाद, डीएमईएम के चार मिलीलीटर जोड़ें, और कई बार सेल परत की सतह पर इसे पाइपिंग करके माध्यम को तितर-बितर करें, और निलंबन को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें। पांच मिनट के लिए 500 बार जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, फिर सुपरनेट को त्यागें, और पीवीएस के एक मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। सेट्रिफ्यूजन दोहराएं और सुपरनेट को त्याग दें।फिर, प्रति मिलीलीटर दस लाख कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व के लिए 10% एफबीएस के साथ 10% एफबीएस के साथ पूरक बफर सेल कल्चर मीडियम के साथ सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। एक ९६-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के पिपेट ५० माइक्रोलीटर, और 10 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं को वापस । जबकि कोशिकाओं इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं, स्क्रीनिंग यौगिकों को पतला और १३.५ एक्स एकाग्रता को विलायक ।प्रत्येक कुएं में ल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट के 12.5 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। एक ल्यूमिनोमीटर के साथ बेसलाइन ल्यूमिनेसेंस को मापें, और यौगिकों के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और तुरंत बाद प्रत्येक अच्छी तरह से डीएमएसओ को नियंत्रित करें। दो घंटे के लिए हर 30 मिनट में चिकनाई मापें, फिर डीएमएसओ उपचार की तुलना में यौगिकों के निरोधात्मक प्रभावों की गणना करें।बेसलाइन ल्यूमिनेसेंस सिग्नलों को मापा गया था, और सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात की गणना 80 से अधिक की गई थी। जेड प्राइम ०.५ से अधिक था, यह दर्शाता है कि यह परख प्रणाली उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए स्वीकार्य है । डीएमएसओ-केवल नियंत्रण की तुलना में 40% से अधिक अवरोध की सीमा निर्धारित करके, निताजोक्सानाइड को उम्मीदवार दवा के रूप में पहचाना गया था।हमने पहले इस विधि के साथ एक प्रतिक्रियाशीलता छोटे पैमाने पर यौगिक पुस्तकालय की स्क्रीनिंग करके एचबीएक्स-डीडीबी 1 इंटरैक्शन के अवरोधक के रूप में nitazoxanide की पहचान की थी। निताजोक्सानाइड का उपयोग करके, हम एचबीएक्स-डीडीबी 1 इंटरैक्शन के अवरोध, वायरल ट्रांसक्रिप्शन की कमी और बाद में वायरल उत्पाद के स्तर की पुष्टि करते हैं। एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए जुड़े विभाजन लूसिफ़ेरेस के इष्टतम भाग को पहले से निर्धारित किया जाना चाहिए।इस मामले में, एचपीएक्स और डीडीबी1 के सी टर्मिनस पर बड़े बिट के लिए जुड़े हुए डीडीबी 1 के अंत टर्मिनस में स्मॉल बिट के लिए जुड़े हुए हैं।

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

कार्सिनोमा - एसोसिएटेड Fibroblasts के प्रायोगिक मानव स्तन Fibroblasts से जनरेशन (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial चुंबकीय उत्तेजना का उपयोग मानव Neuromuscular प्रणाली का अध्ययन

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

पूति के पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए उपन्यास हर्बल चिकित्सा मूल्यांकन

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Intraoperative Detection of Subtle Endometriosis: A Novel Paradigm for Detection and Treatment of Pelvic Pain Associated with the Loss of Peritoneal Integrity

सूक्ष्म Endometriosis के Intraoperative जांच: श्रोणि पेरिटोनियल वफ़ादारी की हानि के साथ जुड़े दर्द का पता लगाने और उपचार के लिए एक उपन्यास प्रतिमान

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

ट्यूमर स्ट्रोमल इंटरेक्शन के लिए तीन आयामी सह संस्कृति मॉडल

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर उपगोल आक्रमण परख

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

शीतल अग्रवाल कालोनी गठन परख की उपयोगिता स्तन कैंसर की कोशिकाओं में Tumorigenicity के inhibitors पहचानें

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

ड्रग Repurposing परिकल्पना पीढ़ी &quot;उत्तर: ठीक ड्रग्स&quot; का उपयोग कर प्रणाली

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice

चूहों में Radiotelemetry प्रणाली का उपयोग करते हुए लौकिक पालि मिर्गी और ईईजी निगरानी के Pilocarpine मॉडल

Temporal lobe epilepsy (TLE) is a common neurological disorder in adulthood. For translational studies of chronic epilepsy, pilocarpine-induced status ...