Name: identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da Grants-in-Aid del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, Science, and Technology, Japan (#19H03430 and #17K09405 to M.O., and #19J11829 to K.S.), by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#18H05024 to M.O.), by the Research Program on Hepatitis from Lepitis from Medical Agency for Medical Research and Development, AMED (to M.O., #JP19fk021005), by program on the Innovative Development and the Application of New Drugs for Hepatitis B (#JP19fk0310102 to K.K.) from AMED, #JP19fk021005 la Japan Foundation for Applied Enzymology e la Kobayashi Foundation for Cancer Research (a M.O.), dal GSK Japan Research Grant 2018 (per K.S.), e da una sovvenzione della Miyakawa Memorial Research Foundation (a K.S.).

NOTA: Una rappresentazione schematica dell'analisi di suddivisione luciferate è illustrata nella Figura 1Ae il processo di analisi è descritto nella figura 1B. La dinamica di interazione può essere misurata in tempo reale senza lisi cellulare.
1. Preparazione delle cellule
<ol><li>Mantenere le cellule HEK293T coltivate nel mezzo modificato di Dulbecco Eagle (DMEM) integrato con 1...

<ol>
	<li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hepatitis+B+infection:+a+review.">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+pathogenesis:+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA.">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li><li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression.">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).</li><li>Murphy, C. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+Methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).</li><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening.">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li><li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+as+drug+targets.">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li><li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., Andr&#233;, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomics:+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery.">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115 (2014).</li><li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens.">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un comodo metodo di screening usando un saggio di luciferasi diviso per trovare inibitori di legame HBx-DDB1. Le dinamiche di interazione possono essere rilevate in tempo reale nelle cellule viventi senza la necessità di lisi cellulare. L'inibizione dell'interazione HBx-DDB1 porta al ripristino di Smc5/6, che si traduce nella soppressione della trascrizione virale, espressione proteica e produzione di cccDNA7. Questo nuovo meccanismo di azione antivirale può superare le inadeg...

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica in tutto il mondo, con stime annuali di 240 milioni di persone cronicamente infettate da HBV e 90.000 decessi a causa di complicazioni dovute all'infezione, tra cui cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC)1. Anche se gli attuali agenti terapeutici anti-HBV, gli analoghi nucleos(t)ide, inibiscono sufficientemente la trascrizione inversa virale, raramente raggiungono l'eliminazione delle proteine virali, che è l'obiettivo clinico a lungo termine. Il loro scarso effetto sull'eliminazione delle proteine virali è dovuto alla loro mancanza di effetto diretto sulla trascrizione virale da minicromosomi circolari con chiusura apicale (cccDNA) nel nucleo epatocite2.
La trascrizione HBV è attivata dalla proteina X (HBx) regolatrice HBV3. Recenti studi hanno rivelato che HBx degrada la manutenzione strutturale dei cromosomi 5/6 (Smc5/6), un fattore di restrizione dell'ospite che blocca la trascrizione HBV dal cccDNA, dirottando un DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase complex4,5,6. Pertanto, un passo cruciale nella promozione della trascrizione virale da cccDNA è pensato per essere l'interazione HBx-DDB1. Composti in grado di inibire l'associazione tra HBx e DDB1 possono bloccare la trascrizione virale, e infatti il nitazoxanide è stato identificato come un inibitore dell'interazione HBx-DDB1 attraverso un sistema di screening sviluppato nel nostro laboratorio7.
Qui, presentiamo il nostro comodo sistema di screening utilizzato per identificare gli inibitori dell'interazione HBx-DDB1, che utilizza una spaccatura luciferasi di qualità7,8. Le sottounità luciferasi divise sono fuse in HBx e DDB1, e l'interazione HBx-DDB1 porta le sottounità in prossimità di formare un enzima funzionale che genera un segnale luminoso luminescente. Poiché l'interazione tra le sottounità è reversibile, questo sistema è in grado di rilevare proteine HBx-DDB1 rapidamente dissocianti (Figura 1). Utilizzando questo sistema, una grande libreria composta può essere facilmente esaminata, che può portare alla scoperta di nuovi composti in grado di inibire in modo efficiente l'interazione HBx-DDB1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM</td>
			<td>Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene transfection reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301425</td>
			<td>Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>175012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 96 microplate luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBx&#8211;LgBit expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI starter systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2015</td>
			<td>Includes Nano-Glo Live Cell Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Described as &#34;buffered cell culture medium&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841</td>
			<td>Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate&#183;HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine&#183;HCl, micafungin, miconazole, midodrine&#183;HCl, miglitol, milnacipran&#183;HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril&#183;HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin&#183;Na, naftifine&#183;HCl, naratriptan&#183;HCl, natamycin, nebivolol&#183;HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&#183;HCl, olsalazine&#183;Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline&#183;HCl, paliperidone, palonosetron&#183;HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&#183;HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBit&#8211;DDB1 expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system

C'è un urgente bisogno di nuovi agenti terapeutici per l'infezione da virus dell'epatite B (HBV). Sebbene gli analoghi nucleos(t)ide attualmente disponibili inibiscano potentemente la replicazione virale, non hanno alcun effetto diretto sull'espressione di proteine virali trascritte da un DNA circolare virale covalentmente chiuso (cccDNA). Poiché l'elevato carico di antigene virale può svolgere un ruolo in questa carcinogenesi cronica e correlata all'HBV, l'obiettivo del trattamento HBV è quello di sradicare le proteine virali. La proteina regolatoria HBV X (HBx) si lega alla proteina 1 (DDB1) che lega il danno al DNA ospite per degradare la manutenzione strutturale dei cromosomi 5/6 (Smc5/6), con conseguente attivazione della trascrizione virale da cccDNA. Qui, usando un sistema di analisi di completamento della luciferasi divisa, presentiamo un sistema completo di screening composto per identificare gli inibitori dell'interazione HBx-DDB1. Il nostro protocollo consente di rilevare facilmente le dinamiche di interazione in tempo reale all'interno delle cellule viventi. Questa tecnica può diventare un test chiave per scoprire nuovi agenti terapeutici per il trattamento dell'infezione da HBV.

I risultati rappresentativi dopo l'utilizzo di questo protocollo sono riportati nella figura 2A,B. Il rapporto segnale-sfondo era maggiore di 80 e il fattore9 (l'indice di qualità standard dell'oro per lo screening ad alta velocità) era maggiore di 0,5, indicando che questo sistema di analisi era accettabile per lo screening ad alto rendimento. Con la soglia impostata su >40% di inibizione rispetto al controllo (solo...

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Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Qui, presentiamo un metodo per lo screening degli agenti virali anti-epatite B che inibiscono l'interazione HBx-DDB1 utilizzando un sistema di analisi luciferasi divisa. Questo sistema consente una facile individuazione delle interazioni proteina-proteina ed è adatto per identificare gli inibitori di tali interazioni.

Identificare gli inibitori dell'interazione HBx-DDB1 utilizzando un sistema di valutazione di Luciferase diviso

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

L'interazione HBX-DDB1 è un passo cruciale per promuovere la trascrizione HPV da cccDNA, quindi questo protocollo può diventare una risorsa chiave per scoprire nuovi agenti terapeutici per la cura funzionale HPV. La nostra procedura è semplice e richiede solo un breve tempo per lo schermo. L'interazione che mescolo può essere rilevata in tempo reale senza richiedere lisi cellulare.Inoltre, la qualità dello screening è soddisfacente con un punteggio primo Z elevato. L'inibizione dell'interazione HBX-DDB1 porta al ripristino di Smc5/6, che si traduce nella soppressione della trascrizione HPV, dell'espressione proteica e della produzione di cccDNA. Questo nuovo meccanismo di azione antivirale può superare le inadeguatezze delle attuali terapie HPV.Le interazioni proteina-proteina sono un'importante classe di bersagli farmacologici. L'acido a base di split-luciferasi qui descritto, che prende di mira le interazioni tra proteine virali e hasS, può fornire una nuova strategia per sviluppare cure per altre malattie infettive. Sebbene il nostro protocollo sia semplice e facile da capire, alcuni passaggi potrebbero essere difficili da riprodurre senza la dimostrazione visiva.Pertanto, la dimostrazione visiva sarà di grande aiuto per comprendere il nostro protocollo. Inizia seminando cinque volte 10 fino alla 5 ° cellule HEK293T in un piatto da 100 millimetri con 10 millilitri di DMEM e incubandoli durante la notte a 37 gradi celsius. Il giorno successivo, diluire un microgrammo ciascuno di HBx-LgBit e SmBit-DDB1 esprimendo plasmidi di DNA e tampone di condensazione del DNA per un volume totale di 300 microlitri.Aggiungere 16 microlitri di soluzione di esaltatore e mescolare i tubi vortice per un secondo. Incubare il campione a temperatura ambiente per tre minuti, quindi aggiungere 60 microlitri di reagente di trasfezione. Vortice il tubo per 10 secondi e incubare il campione per altri otto minuti.Nel frattempo, aspirare il mezzo dal piatto con le cellule e lavarle con cinque millilitri di PVS. Aspirare il PVS e aggiungere sette millilitri di DMEM. Aggiungere tre millilitri di DMEM al tubo con i complessi di trasfezione, pipettare su e giù per mescolare e aggiungere la miscela alle cellule.Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per 10 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo di coltura trascorso e lavare le cellule con cinque millilitri di PVS. Rimuovere il PVS con un millilitro dello 0,25% di tripside EDTA e incubare le cellule a 37 gradi celsius per staccarle.Successivamente, aggiungere quattro millilitri di DMEM e disperdere il mezzo tubazione più volte sulla superficie dello strato cellulare e trasferire la sospensione su un tubo. Centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti, quindi scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in un millilitro di PVS. Ripetere la cetrifugazione e scartare il supernatante.Quindi, sospendere nuovamente il pellet cellulare con un mezzo di coltura cellulare tamponato integrato con 10%FBS a una densità di semina di un milione di cellule per millilitro. Pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di 96 po 'e riportare le cellule all'incubatore di 37 gradi celsius per 10 ore. Mentre le cellule stanno incubando, diluire i composti di screening e il solvente alla concentrazione del 13,5%.Aggiungere 12,5 microlitri di substrato luminescente ad ogni pozzo e incubare la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente. Misurare la luminescenza di base con un luminometro e aggiungere cinque microlitri dei composti e del DMSO controllato a ciascun pozzo immediatamente dopo. Misurare la luminescenza ogni 30 minuti per due ore, quindi calcolare gli effetti inibitori dei composti rispetto al trattamento DMSO.Sono stati misurati i segnali di luminescenza di base e il rapporto segnale-sfondo è stato calcolato essere maggiore di 80. Il primo Z era maggiore di 0,5, indicando che questo sistema di dosaggio è accettabile per lo screening ad alta produttività. Impostando la soglia su un'inibizione superiore al 40% rispetto al controllo solo DMSO, il nitazoxanide è stato identificato come un farmaco candidato.In precedenza abbiamo identificato il nitazoxanide come un inibitore dell'interazione HBX-DDB1 vagliando una libreria composta su piccola scala di reattività con questo metodo. Usando il nitazoxanide, confermiamo che l'inibizione dell'interazione HBX-DDB1, quella riduzione della trascrizione virale e i successivi livelli di prodotto virale. La porzione ottimale della luciferasi divisa fusa a una proteina bersaglio deve essere determinata in anticipo.In questo caso, HPX fuso a Large Bit al capolinea C di HPX e DDB1 fuso a Small Bit al termine finale di DDB1 ha fornito i migliori risultati.

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