Name: identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00
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この作品は、文部科学省の助成金によって支えられ、 スポーツ・サイエンス・テクノロジー,#19J11829 #19H03430 日本のスポーツ・科学・#17K09405,・#17K09405,革新的分野科学研究助成(#18H05024~M.O.)による日本医学 #JP19fk021005研究開発機構の肝炎研究プログラムによる、B型肝炎の革新的開発と新薬の応用に関するプログラムによる革新的開発・新薬の応用に関するプログラムによる革新的な開発・#JP19fk0310102国際交流基金、小林がん研究財団(M.O.)、GSKジャパン研究助成2018(株式会社)、宮川記念研究財団(代表)の助成を受けています。

注: 分割ルシフェラーゼアッセイの概略図を図1Aに示し、アッセイプロセスを図1Bに概説する。相互作用ダイナミクスは、細胞リシスなしでリアルタイムで測定することができます。
1. 細胞調製
<ol><li>ドゥルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で培養HEK293T細胞を維持し、10%v/v胎児ウシ血清(FBS)...

<ol>
	<li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hepatitis+B+infection:+a+review.">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+pathogenesis:+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA.">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li><li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression.">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).</li><li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5/6+to+Enhance+HBV+Replication.">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li><li>Decorsi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5/6+complex+as+a+host+restriction+factor.">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li><li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Smc5/6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection.">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648 (2017).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction.">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li><li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+Methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).</li><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening.">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li><li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+as+drug+targets.">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li><li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., Andr&#233;, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomics:+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery.">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115 (2014).</li><li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens.">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li></ol>

HBx-DDB1結合阻害剤を見つけるためにスプリットルシフェラーゼアッセイを用いた便利なスクリーニング方法を開発した。相互作用ダイナミクスは、細胞リシスを必要とせずに生細胞内でリアルタイムに検出することができる。HBx-DDB1相互作用の阻害は、Smc5/6の回復をもたらし、ウイルス転写、タンパク質発現、およびcccDNA産生の抑制をもたらす7。抗ウイルス作用のこの新し?...

B型肝炎ウイルス(HBV)感染は世界的に大きな公衆衛生上の懸念事項であり、年間推定では2億4,000万人がHBVに慢性的に感染し、肝硬変や肝細胞癌(HCC)1を含む感染症による合併症による死亡が9万人にのぼります。現在の抗HBV治療薬である核(t)ideアナログは、ウイルス逆転写を十分に阻害するが、長期的な臨床目標であるウイルスタンパク質の排除を達成することはめったにない。ウイルスタンパク質除去に対する彼らの悪い効果は、肝細胞核2におけるエピソームウイルス共有閉環DNA(cccDNA)ミニクロモソームからのウイルス転写に対する直接的な影響の欠如によるものである。
HBV転写は、HBV調節X(HBx)タンパク質3によって活性化される。最近の研究では、HBxがDDB1-CUL4-ROC1 E3ユビキチンリガーゼ複合体4、5、6をハイジャックすることによって、cccDNAからのHBV転写をブロックする宿主制限因子である染色体5/6(Smc5/6)の構造維持を低下させることが明らかになった。したがって、cccDNAからのウイルス転写を促進する上で重要なステップは、HBx-DDB1相互作用であると考えられている。HBxとDDB1との結合を阻害し得る化合物は、ウイルス転写を遮断し得るが、実際にニタゾキサニドは、当研究室7で開発されたスクリーニングシステムを介したHBx-DDB1相互作用の阻害剤として同定された。
ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイ7、8を利用したHBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定するために用いられる便利なスクリーニングシステムを提示する。スプリットルシフェラーゼサブユニットはHBxおよびDDB1に融合され、HBx-DDB1相互作用はサブユニットを近接させ、明るい発光シグナルを生成する機能的酵素を形成します。サブユニット間の相互作用は可逆的であるため、このシステムはHBx-DDB1タンパク質の急速な解離を検出することができます(図1)。このシステムを使用すると、大きな化合物ライブラリーを容易にスクリーニングすることができ、HBx-DDB1相互作用を効率的に阻害し得る新規化合物の発見をもたらす可能性がある。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM</td>
			<td>Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene transfection reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301425</td>
			<td>Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>175012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 96 microplate luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBx&#8211;LgBit expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI starter systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2015</td>
			<td>Includes Nano-Glo Live Cell Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Described as &#34;buffered cell culture medium&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841</td>
			<td>Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate&#183;HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine&#183;HCl, micafungin, miconazole, midodrine&#183;HCl, miglitol, milnacipran&#183;HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril&#183;HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin&#183;Na, naftifine&#183;HCl, naratriptan&#183;HCl, natamycin, nebivolol&#183;HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&#183;HCl, olsalazine&#183;Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline&#183;HCl, paliperidone, palonosetron&#183;HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&#183;HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBit&#8211;DDB1 expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system

B型肝炎ウイルス(HBV)感染に対する新しい治療薬が緊急に必要である。現在利用可能なnucleos(t)ideアナログはウイルス複製を強力に阻害しますが、ウイルス共有閉じた円形DNA(cccDNA)から転写されたウイルスタンパク質の発現に直接影響はありません。高いウイルス抗原負荷は、この慢性およびHBV関連発癌の役割を果たし得るとして、HBV治療の目的は、ウイルスタンパク質を根絶することである。HBV調節タンパク質X(HBx)は、クロムソーム5/6(Smc5/6)の構造維持を分解するために宿主DNA損傷結合タンパク質1(DDB1)タンパク質に結合し、cccDNAからのウイルス転写の活性化をもたらす。ここでは、スプリットルシフェラーゼ補体アッセイシステムを用いて、HBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定する包括的な化合物スクリーニングシステムを提示する。当社のプロトコルは、生細胞内の相互作用ダイナミクスをリアルタイムで簡単に検出できるようにします。この技術は、HBV感染の治療のための新しい治療薬を発見するための重要なアッセイとなり得る。

このプロトコルの使用に続く代表的な結果を図 2A,Bに示します。信号対バックグラウンド比は80より大きく、Z'ファクター9(ハイスループットスクリーニングのゴールドスタンダード品質指数)は0.5より大きく、このアッセイシステムがハイスループットスクリーニングに許容されたことを示しています。閾値を対照?...

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Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

ここでは、スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いてHBx-DDB1相互作用を阻害する抗肝炎ウイルス剤をスクリーニングする方法を提示する。このシステムはタンパク質間相互作用の容易な検出を可能にし、そのような相互作用の阻害剤を同定するのに適している。

スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いたHBx-DDB1相互作用の同定阻害剤

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

HBX-DDB1相互作用はcccDNAからのHPV転写を促進するための重要なステップであるため、このプロトコルはHPV機能治癒のための新しい治療薬を発見するための重要な資産になる可能性があります。私たちの手順は簡単で、画面に短い時間を必要とします。私が混ぜ合わせる相互作用は、細胞のライシスを必要とせずにリアルタイムで検出することができます。また、スクリーニング品質はZ素数が高いと満足できる。HBX-DDB1相互作用の阻害は、HPV転写、タンパク質発現およびcccDNA産生の抑制をもたらすSmc5/6の回復をもたらす。抗ウイルス作用のこの新しいメカニズムは、現在のHPV療法の不十分さを克服することができる。タンパク質とタンパク質の相互作用は、薬物標的の重要なクラスです。ウイルスとhasSタンパク質の相互作用を対象とする、ここで説明する分割ルシファーゼベースの酸は、他の感染症の治療法を開発するための新しい戦略を提供するかもしれない。プロトコルはシンプルで理解しやすいものですが、視覚的なデモンストレーションを行わなければ再現が難しい手順もあります。したがって、視覚的なデモンストレーションは、私たちのプロトコルを理解するのに大きな助けになります。5回10〜5番目のHEK293T細胞を100ミリメートル皿に100ミリメートルのDMEMで播種し、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、300マイクロリットルの総容量に対して、DNAプラスミドとDNA凝縮バッファーを発現するHBx-LgBitとSmBit-DDB1のそれぞれ1マイクログラムを希釈します。16マイクロリットルのエンハンサー溶液を加え、1秒間ボルテックスでチューブを混合します。試料を室温で3分間インキュベートし、60マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加える。チューブを10秒間ボルテックスし、サンプルをさらに8分間インキュベートする。一方、細胞と皿から培地を吸引し、5ミリリットルのPVSで洗浄する。PVSを吸引し、7ミリリットルのDMEMを加えます。トランスフェクション複合体でチューブに3ミリリットルのDMEMを加え、ピペットを上下に混ぜ合わせ、混合物を細胞に加えます。その後、セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で10時間インキュベートします。インキュベーション後、使用済み培養培地を取り出し、5ミリリットルのPVSで細胞を洗浄する。0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルでPVSを取り出し、37°Cで細胞をインキュベートして取り外します。次に、4ミリリットルのDMEMを加え、それを細胞層の表面にピペット化して培地を数回分散させ、懸濁液をチューブに移した。500倍Gで細胞を5分間遠心し、その上清を捨て、PVSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。セチフィケーションを繰り返し、上清を捨てます。次いで、1ミリリットル当たり100万個の細胞の播種密度に10%FBSを添加した緩衝細胞培養培地で細胞ペレットを再懸濁する。ピペット50マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、細胞を37°Cインキュベーターに10時間戻す。細胞がインキュベートしている間、スクリーニング化合物と溶媒を13.5倍の濃度に希釈する。各ウェルに12.5マイクロリットルの発光基板を加え、室温で5分間プレートをインキュベートします。ルミノメーターでベースラインルミネッセンスを測定し、5マイクロリットルの化合物を加え、DMSOを制御した直後に各ウェルに加えます。30分毎に2時間発光を測定し、次いでDMSO処理と比較して化合物の阻害効果を計算する。ベースライン発光信号を測定し、信号対バックグラウンド比を80以上と計算した。Z素数が0.5より大きかったことは、このアッセイシステムがハイスループットスクリーニングに許容されることを示す。DMSOのみのコントロールと比較して40%以上の阻害に閾値を設定することにより、ニタゾキサニドが候補薬物として同定された。我々は、この方法で反応性小規模化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより、HBX-DDB1相互作用の阻害剤としてニタゾキサニドを同定した。ニタゾキサニドを用いて、HBX-DDB1相互作用の阻害、ウイルス転写の減少、およびその後のウイルス産物レベルを確認する。標的タンパク質に融合した分割ルシファーゼの最適部分は、あらかじめ決定する必要があります。この場合、HPXはHpXのC末端で大ビットに融合し、DDB1の終末でスモールビットに融合して最良の結果を得た。

Research

JoVE Journal

Medicine

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The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

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側頭葉てんかんと脳波監視テレメーター システムを使用してマウスのピロカルピン モデル

Temporal lobe epilepsy (TLE) is a common neurological disorder in adulthood. For translational studies of chronic epilepsy, pilocarpine-induced status ...