Name: identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00
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이 작품은 문부과학성의 보조금 지원으로 지원되었으며, 일본 스포츠, 과학 기술, 일본 (#19H03430 및 #17K09405 M.O., 그리고 K.S.에 #19J11829), 혁신적인 분야에 대한 과학 연구를위한 보조금에 의해 (#18H05024 M.O.), 일본 의학 연구 개발 기관에서 간염에 대한 연구 프로그램에 의해, AMED (M.O., #JP19fk021005), 혁신적인 개발 및 B에 대한 신약의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), 암 간염에 대한 새로운 약물의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), AB에 의해 #JP19fk0310102 일본 응용지질학재단과 고바야시 암연구재단(M.O.), GSK 재팬 연구보조금 2018(K.S.) 및 미야카와 기념연구재단(K.S.)의 보조금으로 지원.

참고: 분할 루시퍼라아제 분석법의 개략적 표현은 도 1A에나와 있으며, 분석 과정은 도 1B에설명되어 있습니다. 상호작용 역학은 세포 라해없이 실시간으로 측정될 수 있다.
1. 세포 준비
<ol><li>덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 배양된 HEK293T 세포를 10% v/v 태아 소 혈청(FBS),37°C에서 1x 페니...

<ol>
	<li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hepatitis+B+infection:+a+review.">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+pathogenesis:+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA.">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li><li>Slagle, B. L., Bouchard, M. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+Methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).</li><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening.">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li><li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+as+drug+targets.">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li><li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., Andr&#233;, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomics:+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery.">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115 (2014).</li><li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens.">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li></ol>

우리는 HBx-DDB1 결합 억제제를 찾기 위해 분할 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 편리한 스크리닝 방법을 개발했습니다. 상호작용 역학은 세포 용해없이 살아있는 세포에서 실시간으로 검출될 수 있다. HBx-DDB1 상호 작용의 억제는 Smc5/6의 복원으로 이어지며, 이는 바이러스 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래한다7. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HBV 치?...

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제이며, 연간 2억 4천만 명이 HBV에 만성 감염되고 간경변및 간세포암(HCC)을 포함한 감염합병증으로인한 90,000명의 사망자가 발생한다. 현재 항-HBV 치료제인 뉴클레오스(t)ide 유사체는 바이러스 역 전사를 충분히 억제하지만, 장기적인 임상 목표인 바이러스 성 단백질의 제거를 거의 달성하지 못한다. 바이러스 성 단백질 제거에 대한 그들의 나쁜 효과는 간세포핵2에서에피솜 바이러스 성 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA) 미니 염색체에서 바이러스 전사에 대한 직접적인 영향의 부족으로 인한 것입니다.
HBV 전사는 HBV 조절 X (HBx) 단백질3에의해 활성화됩니다. 최근 연구에 따르면 HBx는 DDB1-CUL4-ROC1 E3 유비퀴틴 리가제 복합체4,5,6을납치하여 cccDNA에서 HBV 전사를 차단하는 숙주 제한 인자인 염색체 5/6(Smc5/6)의 구조적 유지를 저하시키는 것으로 나타났습니다. 따라서, cccDNA로부터의 바이러스 전사를 촉진하는 중요한 단계는 HBx-DDB1 상호작용으로 생각된다. HBx와 DDB1 사이의 결합을 억제할 수 있는 화합물은 바이러스 전사를 차단할 수 있으며, 실제로 니타옥산화물은 실험실에서 개발된 스크리닝 시스템을 통해 HBx-DDB1 상호작용의 억제제로 확인되었다7.
여기서, 우리는 분할 루시퍼라제 상보적분석7,8을활용하는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하는 데 사용되는 편리한 스크리닝 시스템을 제시한다. 분할 루시퍼라제 서브유닛은 HBx 및 DDB1에 융합되고, HBx-DDB1 상호작용은 소단위를 근접하게 하여 밝은 발광 신호를 생성하는 기능성 효소를 형성합니다. 소단위 간의 상호작용이 가역적이기 때문에, 이 시스템은 HBx-DDB1 단백질을 빠르게 해리시키는 것을 검출할 수있다(도 1). 이 시스템을 사용하여, 큰 화합물 라이브러리는 쉽게 스크리닝될 수 있으며, 이는 HBx-DDB1 상호작용을 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 화합물의 발견을 초래할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM</td>
			<td>Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene transfection reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301425</td>
			<td>Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>175012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 96 microplate luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBx&#8211;LgBit expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI starter systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2015</td>
			<td>Includes Nano-Glo Live Cell Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Described as &#34;buffered cell culture medium&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841</td>
			<td>Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate&#183;HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine&#183;HCl, micafungin, miconazole, midodrine&#183;HCl, miglitol, milnacipran&#183;HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril&#183;HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin&#183;Na, naftifine&#183;HCl, naratriptan&#183;HCl, natamycin, nebivolol&#183;HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&#183;HCl, olsalazine&#183;Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline&#183;HCl, paliperidone, palonosetron&#183;HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&#183;HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBit&#8211;DDB1 expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system

B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 대한 새로운 치료제에 대한 긴급한 필요성이 있다. 현재 유효한 핵 (t)ide 유사체는 바이러스 복제를 강력하게 억제하지만, 그들은 바이러스 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA)에서 전사 된 바이러스 성 단백질의 발현에 직접적인 영향을 미치지 않습니다. 높은 바이러스 항원 부하가 이 만성 및 HBV 관련 발암에 역할을 할 수 있기 때문에, HBV 처리의 목표는 바이러스 성 단백질을 근절하는 것입니다. HBV 조절 단백질 X (HBx)는 cccDNA에서 바이러스 전사의 활성화의 결과로 염색체 5/6 (Smc5/6)의 구조적 유지 보수를 저하시키기 위해 숙주 DNA 손상 결합 단백질 1 (DDB1) 단백질에 결합합니다. 여기서, 분할 루시퍼라제 보완 분석 시스템을 사용하여, 우리는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하기 위한 포괄적인 화합물 스크리닝 시스템을 제시한다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포 내에서 실시간으로 상호 작용 역학의 쉬운 검출을 가능하게합니다. 이 기술은 HBV 감염의 처리를 위한 새로운 치료제를 발견하는 중요한 분석사가 될 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용한 다음의 대표적인 결과는 그림 2A, B에나와 있습니다. 신호 대 배경 비율이 80보다 크고 Z'factor9 (고처리량 스크리닝을위한 금 표준 품질 지수)가 0.5보다 높았으며,이 분석 시스템은 높은 처리량 스크리닝에 허용되었음을 나타냅니다. 대조군(DMSO 만)에 비해 >40% 억제로 설정된 임계값으로, 우리는 니타...

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Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

여기서, 우리는 분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호작용을 억제하는 항-B형 간염 바이러스 성 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. 이 시스템은 단백질-단백질 상호 작용의 쉬운 검출을 허용하고 그 같은 상호 작용의 억제제를 확인하기 위해 적당합니다.

분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제 식별

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

HBX-DDB1 상호 작용은 cccDNA에서 HPV 전사를 촉진하기위한 중요한 단계이므로이 프로토콜은 HPV 기능적 치료법을위한 새로운 치료제를 발견하는 핵심 자산이 될 수 있습니다. 우리의 절차는 간단하고 화면으로 짧은 시간이 필요합니다. 내가 혼합하는 상호 작용은 세포 용해를 필요로하지 않고 실시간으로 검출 될 수있다.또한, 높은 Z 프라임 점수로 스크리닝 품질이 만족스럽습니다. HBX-DDB1 상호 작용의 억제는 HPV 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래하는 Smc5/6의 복원으로 이어집니다. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HPV 치료의 부적수를 극복할 수 있습니다.단백질 단백질 상호 작용은 약물 표적의 중요한 클래스입니다. 여기에 설명된 분할 루시파라제 계산은 바이러스성 과 hasS 단백질 사이의 상호 작용을 표적으로 하고, 그밖 전염병을 위한 치료를 개발하기 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 간단하고 이해하기 쉽지만, 일부 단계는 시각적 데모없이 재현하기 어려울 수 있습니다.따라서 시각적 데모는 프로토콜을 이해하는 데 큰 도움이 될 것입니다. 5회 HEK293T 셀을 5번 10밀리리터의 DMEM10밀리리터로 100mm 접시에 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤을 배양하는 것으로 시작합니다. 다음 날, 총 300마이크로리터에 대한 DNA 플라스미드 및 DNA 응축 버퍼를 발현하는 HBx-LgBit 및 SmBit-DDB1의 각각 1마이크로그램을 희석시한다.증강용 액액 16마이크로리터를 추가하고 1초 동안 소용돌이를 통해 튜브를 섞습니다. 실온에서 3분간 샘플을 배양한 다음 60마이크로리터의 트랜스페트 시약을 추가합니다. 튜브를 10초 동안 소용돌이시키고 샘플을 8분 동안 배양합니다.한편, 세포와 접시에서 매체를 흡인하고 PVS의 다섯 밀리리터로 씻어. PVS를 흡인하고 DMEM의 7 밀리리터를 추가합니다. 분리 복합체를 사용하여 튜브에 DMEM의 3 밀리리터를 추가하고, 파이펫을 위아래로 혼합하고, 혼합물을 세포에 추가합니다.그런 다음 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 소비된 배양 배지를 제거하고, PVS의 5밀리리터로 세포를 세척한다. 0.25%의 트립신 EDTA의 1 밀리리터에서 PVS를 제거하고 세포를 섭씨 37도에서 배양하여 분리합니다.다음으로, DMEM의 4밀리리터를 추가하고, 세포 층의 표면을 여러 번 배관하여 배지를 분산시키고, 현탁액을 튜브로 이송한다. 5 분 동안 500 회 G에서 세포를 원심 분리 한 다음 상체를 버리고 PVS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 신약화를 반복하고 상체를 폐기합니다.이어서, 밀리리터당 100만 개의 세포밀도로 10%FBS로 보충된 완충된 세포 배양 배지로 세포 펠릿을 다시 중단한다. 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 파이펫 50 마이크로리터, 10 시간 동안 37섭씨 인큐베이터로 세포를 반환합니다. 세포가 배양하는 동안, 스크리닝 화합물과 용매를 13.5 X 농도로 희석한다.각 우물에 발광 기판12.5 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 플레이트를 배양합니다. 발광계로 기준선 발광을 측정하고, 화합물의 5마이크로리터를 추가하고 제어된 DMSO를 각 웰에 즉시 추가합니다. 2시간 동안 30분마다 발광을 측정한 다음 DMSO 처리와 비교하여 화합물의 억제 효과를 계산합니다.기준발광 신호를 측정하고 신호 대 배경 비율이 80보다 큰 것으로 계산되었다. Z 프라임은 0.5보다 컸으며, 이는 이 분석 시스템이 고처리량 스크리닝에 허용된다는 것을 나타냅니다. DMSO 전용 대조군에 비해 임계값을 40% 이상으로 설정함으로써, 니타조산이드는 후보약물로 확인되었다.우리는 이전에 이 방법을 사용하여 반응성 소규모 화합물 라이브러리를 선별하여 HBX-DDB1 상호작용의 억제제로서 nitazoxanide를 확인했습니다. nitazoxanide를 사용 하 여, 우리는 HBX-DDB1 상호 작용의 억제, 바이러스 전사의 감소, 그리고 후속 바이러스 성 제품 수준을 확인 합니다. 표적 단백질에 융합된 분할 루시파아제의 최적 부분은 사전에 결정되어야 한다.이 경우 HPX는 DDB1의 마지막 종착지에서 스몰 비트에 융합된 HPX와 DDB1의 C 종착기에서 큰 비트에 융합되어 최상의 결과를 제공했습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

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인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

연구

의학

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

인간 신경근육학 시스템을 공부하기 Transcranial 자기 자극을 활용

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

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