Name: identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por Subvenções em Ajuda do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, Japão (#19H03430 e #17K09405 para M.O., e #19J11829 para a K.S.), por um Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#18H05024 a M.O.), pelo Programa de Pesquisa sobre Hepatite da Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, AMED (para M.O., #JP19fk021005), por programa sobre o Desenvolvimento Inovador e a Aplicação de Novos Medicamentos para hepatite B #JP19fk0310102 (a K.K.) da AMED, por subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de a Fundação Japonesa para Enzimologia Aplicada e da Kobayashi Foundation for Cancer Research (para M.O.), da GSK Japan Research Grant 2018 (para a K.S.), e por uma doação da Miyakawa Memorial Research Foundation (para a K.S.).

NOTA:Uma representação esquemática do ensaio luciferase dividido é mostrada na Figura 1A,e o processo de ensaio é descrito na Figura 1B. A dinâmica de interação pode ser medida em tempo real sem lyse celular.
1. Preparação celular
<ol><li>Mantenha as células HEK293T cultivadas no meio modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco complementadas com 10% v/v soro bovino fetal (FB...

<ol>
	<li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hepatitis+B+infection:+a+review.">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+pathogenesis:+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA.">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li><li>Slagle, B. L., Bouchard, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5/6+to+Enhance+HBV+Replication.">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li><li>Decorsi&#232;re, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5/6+complex+as+a+host+restriction+factor.">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li><li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Smc5/6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection.">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648 (2017).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction.">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li><li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. 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Desenvolvemos um método de triagem conveniente usando um ensaio lúciferase dividido para encontrar inibidores de ligação HBx-DDB1. A dinâmica de interação pode ser detectada em tempo real em células vivas sem a necessidade de lyse celular. A inibição da interação HBx-DDB1 leva à restauração do Smc5/6, o que resulta na supressão da transcrição viral, expressão proteica e produção de cccDNA7. Este novo mecanismo de ação antiviral pode superar as inadequações das terapias atu...

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma grande preocupação de saúde pública em todo o mundo, com estimativas anuais de 240 milhões de pessoas cronicamente infectadas com HBV e 90.000 mortes devido a complicações da infecção, incluindo cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC)1. Embora os atuais agentes terapêuticos anti-HBV, análogos nucleos (t)ide, inibem suficientemente a transcrição reversa viral, eles raramente conseguem a eliminação de proteínas virais, que é o objetivo clínico de longo prazo. Seu efeito pobre na eliminação viral da proteína é devido a sua falta do efeito direto na transcrição viral dos minicromossomos circulares covalently fechados do ADN (cccDNA) do episóros no núcleo do hepatocyte2.
A transcrição do HBV é ativada pela proteína X (HBx) reguladora do HBV3. Estudos recentes revelaram que o HBx degrada a manutenção estrutural dos cromossomos 5/6 (Smc5/6), um fator de restrição de hospedeiro que bloqueia a transcrição do HBV do cccDNA, através do sequestro de um complexo de onipresença DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Portanto, um passo crucial na promoção da transcrição viral do cccDNA é pensado para ser a interação HBx-DDB1. Compostos capazes de inibir a ligação entre HBx e DDB1 podem bloquear a transcrição viral, e de fato o nitazoxanida foi identificado como um inibidor da interação HBx-DDB1 através de um sistema de triagem desenvolvido em nosso laboratório7.
Aqui, apresentamos nosso conveniente sistema de triagem usado para identificar inibidores da interação HBx-DDB1, que utiliza um ensaio complementar lúciferase dividido7,8. As subunidades luciferase divididas são fundidas ao HBx e ao DDB1, e a interação HBx-DDB1 traz as subunidades para perto para formar uma enzima funcional que gera um sinal luminescente brilhante. Como a interação entre as subunidades é reversível, este sistema pode detectar proteínas HBx-DDB1 ràpida dissociando (Figura 1). Usando este sistema, uma grande biblioteca composta pode ser facilmente rastreada, o que pode resultar na descoberta de novos compostos capazes de inibir eficientemente a interação HBx-DDB1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM</td>
			<td>Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene transfection reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301425</td>
			<td>Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>175012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 96 microplate luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBx&#8211;LgBit expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI starter systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2015</td>
			<td>Includes Nano-Glo Live Cell Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Described as &#34;buffered cell culture medium&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841</td>
			<td>Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate&#183;HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine&#183;HCl, micafungin, miconazole, midodrine&#183;HCl, miglitol, milnacipran&#183;HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril&#183;HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin&#183;Na, naftifine&#183;HCl, naratriptan&#183;HCl, natamycin, nebivolol&#183;HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&#183;HCl, olsalazine&#183;Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline&#183;HCl, paliperidone, palonosetron&#183;HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&#183;HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBit&#8211;DDB1 expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system

Há uma necessidade urgente de novos agentes terapêuticos para a infecção pelo vírus da hepatite B (HBV). Embora os análogos de nucleos (t)ide atualmente disponíveis inibem potentemente a replicação viral, eles não têm efeito direto na expressão de proteínas virais transcritas de um DNA circular covalmente fechado viral (cccDNA). Como a alta carga de antígenos virais pode desempenhar um papel nessa carcinogênese crônica e relacionada ao HBV, o objetivo do tratamento com HBV é erradicar as proteínas virais. A proteína reguladora X (HBx) do HBV liga-se à proteína de ligação ao dano ao DNA do hospedeiro 1 (DDB1) proteína para degradar a manutenção estrutural dos cromossomos 5/6 (Smc5/6), resultando na ativação da transcrição viral do cccDNA. Aqui, usando um sistema de ensaio de complementação lúciferase dividido, apresentamos um sistema abrangente de triagem composta para identificar inibidores da interação HBx-DDB1. Nosso protocolo permite a fácil detecção da dinâmica de interação em tempo real dentro das células vivas. Esta técnica pode tornar-se um ensaio fundamental para descobrir novos agentes terapêuticos para o tratamento da infecção por HBV.

Os resultados representativos após o uso deste protocolo são mostrados na Figura 2A,B. A relação sinal/fundo foi superior a 80 e o fatorZ 9 (o índice de qualidade padrão-ouro para triagem de alta taxa de produção) foi superior a 0,5, indicando que esse sistema de ensaio era aceitável para triagem de alta taxa de produção. Com o limiar definido para >40% inibição em comparação com o controle (DMSO apenas)...

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Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Aqui, apresentamos um método para triagem de agentes virais anti-hepatite B que inibem a interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio lúciferase dividido. Este sistema permite a fácil detecção de interações proteína-proteína e é adequado para identificar inibidores de tais interações.

Identificação de inibidores da interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio luciferase dividido

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

A interação HBX-DDB1 é um passo crucial para promover a transcrição do HPV a partir do CCCDNA, de modo que este protocolo pode se tornar um ativo fundamental para descobrir novos agentes terapêuticos para a cura funcional do HPV. Nosso procedimento é simples e requer apenas um curto período de tempo para tela. A interação que misturo pode ser detectada em tempo real sem precisar de lise celular.Além disso, a qualidade de triagem é satisfatória com uma pontuação máxima Z. A inibição da interação HBX-DDB1 leva à restauração do Smc5/6, que resulta em supressão da transcrição do HPV, expressão proteica e produção de CCCDNA. Este novo mecanismo de ação antiviral pode superar as inadequações das terapias atuais do HPV.Interações proteína-proteína são importantes alvos de drogas. O ácido à base de luciferase dividido descrito aqui, que tem como alvo as interações entre proteínas virais e hass, pode fornecer uma nova estratégia para desenvolver curas para outras doenças infecciosas. Embora nosso protocolo seja simples e fácil de entender, alguns passos podem ser difíceis de reproduzir sem a demonstração visual.Assim, a demonstração visual será uma grande ajuda para entender nosso protocolo. Comece semeando cinco vezes 10 para as células HEK293T em um prato de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM, e incubando-as durante a noite a 37 graus celsius. No dia seguinte, diluir um micrograma cada um de HBx-LgBit e SmBit-DDB1 expressando plasmídeos de DNA e tampão de condensação de DNA para um volume total de 300 microliters.Adicione 16 microliters de solução melhoradora e misture os tubos por vórtice por um segundo. Incubar a amostra à temperatura ambiente por três minutos e, em seguida, adicionar 60 microliters de reagente de transfecção. Vórtice do tubo por 10 segundos, e incubar a amostra por mais oito minutos.Enquanto isso, aspire o meio do prato com as células e lave-os com cinco mililitros de PVS. Aspire o PVS e adicione sete mililitros de DMEM. Adicione três mililitros de DMEM ao tubo com os complexos de transfecção, pipeta para cima e para baixo para misturar, e adicione a mistura às células.Em seguida, incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 horas. Após a incubação, remova o meio de cultura gasto e lave as células com cinco mililitros de PVS. Remova o PVS a um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA, e incuba as células a 37 graus celsius para desligá-las.Em seguida, adicione quatro mililitros de DMEM e disperse o meio ao escoria-lo sobre a superfície da camada celular várias vezes, e transfira a suspensão para um tubo. Centrifugar as células a 500 vezes G por cinco minutos, depois descartar o supernasce, e suspender novamente a pelota celular em um mililitro de PVS. Repita a cetrifugação e descarte o supernatante.Em seguida, suspenda novamente a pelota celular com meio de cultura celular tamponada complementada com 10% de FBS a uma densidade de semeadura de um milhão de células por mililitro. Pipeta 50 microliters da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços, e retornar as células para a incubadora de 37 graus celsius por 10 horas. Enquanto as células estão incubando, dilui os compostos de triagem e solvente para concentração de 13,5 X.Adicione 12,5 microliters de substrato luminescente a cada poço e incubar a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Meça a luminescência da linha de base com um luminômetro e adicione cinco microliters dos compostos e DMSO controlados a cada poço imediatamente depois. Meça a luminescência a cada 30 minutos durante duas horas e, em seguida, calcule os efeitos inibitórios dos compostos em comparação com o tratamento DMSO.Os sinais de luminescência da linha de base foram medidos, e a relação sinal-fundo foi calculada para ser superior a 80. O z prime foi superior a 0,5, indicando que este sistema de ensaio é aceitável para a triagem de alto rendimento. Ao definir o limiar para maior inibição de 40% em comparação com o controle somente do DMSO, o nitazoxanide foi identificado como uma droga candidata.Identificamos anteriormente o nitazoxanida como um inibidor da interação HBX-DDB1, rastreando uma biblioteca composta de pequena escala de reatividade com este método. Usando nitazoxanida, confirmamos essa inibição da interação HBX-DDB1, essa redução da transcrição viral e os níveis subsequentes do produto viral. A porção ideal da luciferase dividida fundida a uma proteína alvo deve ser determinada de antemão.Neste caso, o HPX fundido ao Large Bit no cupins C do HPX e DDB1 fundido ao Small Bit no final do DDB1 proporcionou os melhores resultados.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Utilizando Estimulação Magnética Transcraniana para o Estudo do sistema neuromuscular humano

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

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Intraoperatória Detecção de Endometriose Sutil: um novo paradigma para a detecção e tratamento de dor pélvica associada com a perda de integridade Peritoneal

Endometriosis is a  common disease affecting 40 to 70% of reproductive-aged women with chronic  pelvic pain (CPP) and/or infertility. The purpose of this ...

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Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

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Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

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O modelo de pilocarpina de epilepsia do lobo Temporal e EEG monitoramento usando sistema de radiotelemetria em ratos

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