Name: identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por Grants-in-Aid del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, Japón (#19H03430 y #17K09405 a M.O., y #19J11829 a K.S.), por una Subvención en Ayuda para la Investigación Científica en Áreas Innovadoras (#18H05024 a M.O.), por el Programa de Investigación sobre Hepatitis de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico, AMED (a M.O., #JP19fk021005), por programa sobre el Desarrollo Innovador y la Aplicación de Nuevos Medicamentos para la Hepatitis B (#JP19fk0310102 a K.K.) la Fundación Japonesa para la Enzimología Aplicada y de la Fundación Kobayashi para la Investigación del Cáncer (a M.O.), por GSK Japan Research Grant 2018 (a K.S.), y por una subvención de la Miyakawa Memorial Research Foundation (a K.S.).

NOTA: En la Figura 1Ase muestra una representación esquemática del ensayo de luciferasa dividida , y el proceso de ensayo se describe en la Figura 1B. La dinámica de interacción se puede medir en tiempo real sin lisis celular.
1. Preparación celular
<ol><li>Mantener las células HEK293T cultivadas en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementada con suero bovi...

<ol>
	<li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hepatitis+B+infection:+a+review.">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li><li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+pathogenesis:+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA.">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li><li>Slagle, B. L., Bouchard, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li><li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+detection:+Methods+and+analysis.">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).</li><li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening.">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li><li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+as+drug+targets.">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li><li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., Andr&#233;, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-host+interactomics:+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery.">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115 (2014).</li><li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-Host+Interactions:+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens.">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li></ol>

Desarrollamos un método de cribado conveniente utilizando un ensayo de luciferasa dividida para encontrar inhibidores de unión HBx-DDB1. La dinámica de interacción se puede detectar en tiempo real en células vivas sin necesidad de lisis celular. La inhibición de la interacción HBx-DDB1 conduce a la restauración de Smc5/6, lo que resulta en la supresión de la transcripción viral, la expresión de proteínas y la producción de ADNcccc7. Este novedoso mecanismo de acción antiviral puede s...

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un importante problema de salud pública en todo el mundo, con estimaciones anuales de 240 millones de personas infectadas crónicamente con vhVH y 90.000 muertes por complicaciones de la infección, como cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC)1. Aunque los agentes terapéuticos anti-HBV actuales, análogos de nucleos(t)ide, inhiben suficientemente la transcripción inversa viral, rara vez logran la eliminación de proteínas virales, que es el objetivo clínico a largo plazo. Su pobre efecto sobre la eliminación de proteínas virales se debe a su falta de efecto directo en la transcripción viral de los minicromosomas de ADN circular covalentemente cerrado (cccDNA) episómico en el núcleo de hepatocitos2.
La transcripción del VHB se activa mediante la proteína X reguladora del VHB (HBx)3. Estudios recientes revelaron que HBx degrada el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), un factor de restricción del host que bloquea la transcripción del VHB de cccDNA, mediante el secuestro de un complejo de ligasa de ubiquitina DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Por lo tanto, se cree que un paso crucial en la promoción de la transcripción viral de cccDNA es la interacción HBx-DDB1. Los compuestos capaces de inhibir la unión entre HBx y DDB1 pueden bloquear la transcripción viral, y de hecho nitazoxanida fue identificado como un inhibidor de la interacción HBx-DDB1 a través de un sistema de cribado desarrollado en nuestro laboratorio7.
Aquí, presentamos nuestro conveniente sistema de cribado utilizado para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1, que utiliza un ensayo complementario de luciferasa dividida7,8. Las subunidades de luciferasa divididas se fusionan a HBx y DDB1, y la interacción HBx-DDB1 acerca a formar una enzima funcional que genera una señal luminiscente brillante. Como la interacción entre las subunidades es reversible, este sistema puede detectar proteínas HBx-DDB1 que se disocian rápidamente (Figura 1). Usando este sistema, una gran biblioteca de compuestos se puede examinar fácilmente, lo que puede resultar en el descubrimiento de nuevos compuestos capaces de inhibir eficientemente la interacción HBx-DDB1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM</td>
			<td>Greiner-Bio-One GmbH</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene transfection reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301425</td>
			<td>Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Nichirei</td>
			<td>175012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloMax 96 microplate luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBx&#8211;LgBit expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI starter systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2015</td>
			<td>Includes Nano-Glo Live Cell Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>Described as &#34;buffered cell culture medium&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841</td>
			<td>Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate&#183;HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine&#183;HCl, micafungin, miconazole, midodrine&#183;HCl, miglitol, milnacipran&#183;HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril&#183;HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin&#183;Na, naftifine&#183;HCl, naratriptan&#183;HCl, natamycin, nebivolol&#183;HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&#183;HCl, olsalazine&#183;Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline&#183;HCl, paliperidone, palonosetron&#183;HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&#183;HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBit&#8211;DDB1 expressing DNA plasmid</td>
			<td>Our laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying inhibitors of the hbx-ddb1 interaction using a split luciferase assay system

Existe una necesidad urgente de nuevos agentes terapéuticos para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB). Aunque los nucleos(t)ide análogos disponibles actualmente inhiben poderosamente la replicación viral, no tienen ningún efecto directo sobre la expresión de proteínas virales transcritas a partir de un ADN circular covalentemente cerrado viral (CCCDNA). Como la alta carga de antígenos virales puede desempeñar un papel en esta carcinogénesis crónica y relacionada con el VHB, el objetivo del tratamiento del VHB es erradicar las proteínas virales. La proteína reguladora del VHB X (HBx) se une a la proteína de unión al daño del ADN huésped 1 (DDB1) para degradar el mantenimiento estructural de los cromosomas 5/6 (Smc5/6), lo que resulta en la activación de la transcripción viral de cccDNA. Aquí, utilizando un sistema de ensayo de complementación de luciferasa dividida, presentamos un sistema de cribado compuesto integral para identificar inhibidores de la interacción HBx-DDB1. Nuestro protocolo permite una fácil detección de la dinámica de interacción en tiempo real dentro de las células vivas. Esta técnica puede convertirse en un ensayo clave para descubrir nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por VHB.

Los resultados representativos después del uso de este protocolo se muestran en la Figura 2A,B. La relación señal-fondo fue mayor que 80 y el factor Z9 (el índice de calidad estándar de oro para el cribado de alto rendimiento) fue mayor que 0,5, lo que indica que este sistema de ensayo era aceptable para el cribado de alto rendimiento. Con el umbral establecido en >40% de inhibición en comparación con el control...

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Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Aquí, presentamos un método para el cribado de agentes virales antihepatitis B que inhiben la interacción HBx-DDB1 utilizando un sistema de ensayo de luciferasa dividida. Este sistema permite una fácil detección de interacciones proteína-proteína y es adecuado para identificar inhibidores de dichas interacciones.

Identificación de inhibidores de la interacción HBx-DDB1 mediante un sistema de ensayo de Luciferase dividido

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

La interacción HBX-DDB1 es un paso crucial para promover la transcripción del VPH de cccDNA, por lo que este protocolo puede convertirse en un activo clave para descubrir nuevos agentes terapéuticos para la cura funcional del VPH. Nuestro procedimiento es simple y requiere sólo un corto tiempo para la pantalla. La interacción que mezclo se puede detectar en tiempo real sin necesidad delismos celulares.Además, la calidad de cribado es satisfactoria con una puntuación alta de Z prime. La inhibición de la interacción HBX-DDB1 conduce a la restauración de Smc5/6, lo que resulta en la supresión de la transcripción del VPH, la expresión de proteínas y la producción de cccDNA. Este nuevo mecanismo de acción antiviral puede superar las insuficiencias de las terapias actuales contra el VPH.Las interacciones proteína-proteína son una clase importante de dianas farmacológicas. El ácido a base de luciferasa dividida descrito aquí, que se dirige a las interacciones entre las proteínas virales y hasS, puede proporcionar una nueva estrategia para desarrollar curas para otras enfermedades infecciosas. Aunque nuestro protocolo es simple y fácil de entender, algunos pasos pueden ser difíciles de reproducir sin la demostración visual.Por lo tanto, la demostración visual será de gran ayuda para entender nuestro protocolo. Comience por sembrar cinco veces 10 a la 5a células HEK293T en un plato de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM, e incubarlos durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, diluya un microgramo cada uno de HBx-LgBit y SmBit-DDB1 expresando plásmidos de ADN y tampón de condensación de ADN para un volumen total de 300 microlitros.Añadir 16 microlitros de solución potenciadora, y mezclar los tubos por vórtice durante un segundo. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante tres minutos y luego añadir 60 microlitros de reactivo de transfección. Vórtice el tubo durante 10 segundos e incubar la muestra durante otros ocho minutos.Mientras tanto, aspirar el medio del plato con las células y lavarlos con cinco mililitros de PVS. Aspirar el PVS y añadir siete mililitros de DMEM. Añadir tres mililitros de DMEM al tubo con los complejos de transfección, pipeta arriba y abajo para mezclar, y añadir la mezcla a las células.Luego, incubar las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante 10 horas. Después de la incubación, retire el medio de cultivo gastado y lave las células con cinco mililitros de PVS. Retire el PVS a un mililitro de 0.25%trypsin EDTA, e incubar las células a 37 grados centígrados para separarlas.A continuación, agregue cuatro mililitros de DMEM, y disperse el medio pipetándolo sobre la superficie de la capa celular varias veces, y transfiera la suspensión a un tubo. Centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos, luego desechar el sobrenadante, y volver a suspender el pellet celular en un mililitro de PVS. Repita la cerifugación y deseche el sobrenadante.Luego, vuelva a suspender el pellet celular con un medio de cultivo celular amortiguado complementado con 10%FBS a una densidad de siembra de un millón de células por mililitro. Pipetear 50 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de una placa de 96 pozos, y devolver las células a la incubadora de 37 grados celsius durante 10 horas. Mientras las células están incubando, diluir los compuestos de cribado y el disolvente a 13,5 X concentración.Añadir 12,5 microlitros de sustrato luminiscente a cada pozo, e incubar la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mida la luminiscencia basal con un luminómetro y añada cinco microlitros de los compuestos y DMSO controlado a cada pozo inmediatamente después. Mida la luminiscencia cada 30 minutos durante dos horas y, a continuación, calcule los efectos inhibitorios de los compuestos en comparación con el tratamiento con DMSO.Se midieron las señales de luminiscencia basales y la relación señal-fondo se calculó para ser superior a 80. El primo Z era mayor que 0,5, lo que indica que este sistema de ensayo es aceptable para la detección de alto rendimiento. Al establecer el umbral en más de 40%inhibición en comparación con el control sólo DMSO, nitazoxanida se identificó como un medicamento candidato.Anteriormente identificamos nitazoxanida como un inhibidor de la interacción HBX-DDB1 mediante el cribado de una biblioteca compuesta a pequeña escala de reactividad con este método. Usando nitazoxanida, confirmamos que la inhibición de la interacción HBX-DDB1, esa reducción de la transcripción viral, y los niveles posteriores de productos virales. La porción óptima de la luciferasa dividida fusionada con una proteína diana debe determinarse de antemano.En este caso, HPX fusionado con Bit Grande en la terminal C de HPX y DDB1 fusionados a Bit Pequeño en la terminal final de DDB1 proporcionó los mejores resultados.

Research

JoVE Journal

Medicine

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