Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

تلقى فرانسيس Migneault الدعم من زمالة قدمتها شبكة الصحة التنفسية في كيبيك والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) برنامج تدريب الرئة ، ومنحة طلابية من FRSQ ومنحة طلابية من كلية الدراسات العليا وغيرها ما بعد الدكتوراه، جامعة مونتريال. وقد دعم هذا العمل كرسي جوسلين لاماري في البحوث السريرية والمعاهد الكندية للبحوث الصحية [YBMOP-79544].

وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوانات ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات التابعة لمركز البحوث التابع لمركز مستشفى جامعة مونتريال.
1. تصميم وتوليد plasmid الاستجابة التعبير عن الجين من الفائدة (GOI)
<ol><li>استخدام ناقل ?...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

كان انخفاض معدل الترانسفيكال للخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية قيدًا خطيرًا على استخدام نظام Tet-Off لتقييم استقرار مرنا في هذه الخلايا. ومع ذلك ، تم التغلب على هذا القيد عن طريق الكهربية ماصة ، مما يسمح بكفاءة نقل 25-30 ٪(الشكل 1 والشكل 3)26.</sup...

وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتحديد نصف عمر mRNAs. تسمح تقنية الاضمحلال التي تطارد النبض ، والتي تستخدم mRNAs المسمى ، بإجراء تقييم متزامن لمجموعة كبيرة من الحمض النووي الريبي مع الحد الأدنى من الاضطراب الخلوي. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يسمح بتقدير مباشر لنصف عمر نسخة جينية واحدة ولا يمكن تنفيذه لدراسة التشكيل بعد النسخ من مرنا بعد التحفيز مع عوامل النمو ، ROS ، alarmins ، أو الالتهاب1.
استخدام مثبطات النسخ، مثل actinomycin D و α-amanitin، هو طريقة بسيطة نسبيا لقياس حركية تدهور مرنا مع مرور الوقت. وتعتمد إحدى المزايا الرئيسية لهذا النهج على التقنيات السابقة (أي مطاردة النبض) على القدرة على تقدير نصف عمر نسخة معينة مباشرة ومقارنة الكيفية التي يمكن أن تؤثر بها العلاجات المختلفة على حركية تدهورها. ومع ذلك ، فإن التأثير الضار الكبير لمثبطات النسخ على فسيولوجيا الخلايا يمثل عيبًا رئيسيًا للنهج2. في الواقع ، فإن تثبيط النسخ الخلوي كله مع هذه الأدوية له آثار جانبية سلبية من اضطراب تخليق العناصر الرئيسية المشاركة في استقرار مرنا ، مثل microRNAs (miRNAs) ، وكذلك التعبير وتوليف البروتينات الملزمة للحمض النووي الريبي ، والتي تعتبر مهمة لتدهور وثبات مرنا. وبالتالي فإن الاضطرابات الشديدة للنسخ الجيني من قبل هذه الأدوية يمكن أن تعدل في الواقع منحنيات تدهور النصوص.
يمثل نظام التعريفي المروج نهجًا ثالثًا لقياس نصف عمر مرنا محددة. يقيس هذا الأسلوب تدهور مرنا محددة بطريقة مماثلة للطرق التي تستخدم مثبطات النسخ. وكثيرا ما تستخدم نوعين من نظم التعريفي: المصل الناجم عن c-fos المروج3 ونظام Tt-Off inducible4. مع نظام c-fos ، لا توجد حاجة إلى استخدام مثبطات النسخ التي يمكن أن تكون سامة للخلية. ومع ذلك، تتطلب هذه الطريقة مزامنة دورة الخلية، مما يمنع تقييم الاستقرار الفعلي للنص أثناء المرحلةالبينية 5. وعلى النقيض من ذلك، يسمح نظام Tet-Off بالتعبير القوي عن جين الاهتمام (GOI) تحت سيطرة مروج اصطناعي منظم من التتراسيكلين. يتطلب هذا النظام وجود عنصرين يجب أن يتم إصابة cotransفي الخلية لتكون وظيفية. أول plasmid (pTet-Off) يعبر عن البروتين التنظيمي tTA-Adv، وهو عامل النسخ الاصطناعية الهجينة تتألف من المثبط prokaryotic TetR (من إتشيريشيا كولاي) تنصهر إلى ثلاثة مجالات تحويل النسخ من البروتين الفيروسي HSV VP16. يتم استنساخ GOI في البلازميد pTRE-Tight تحت سيطرة مروج اصطناعي (PTight)، والذي يتألف من الحد الأدنى من التسلسل للمروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) المنصهر إلى سبعة تكرارات لتسلسل مشغل tetO. النسخ من الجين المصب من فضيق يعتمد على تفاعل TetR مع tetO. في وجود التتراسيكلين أو مشتقها ، دوكسيسيكلين ، يفقد المكتم TtR تقاربه لمشغل tetO ، مما يؤدي إلى وقف النسخ4. خصائص نظام تيت حالا جعله نموذجا مثاليا لدراسة التعبير مرنا محددة في الخلايا eukaryotic مع تجنب الآثار التجنبية المحتملة التي هي ثانوية لعدم وجود تسلسل التنظيمية prokaryotic في الخلية eukaryotic6. عادة، يتم استخدام خطوط خلية Tet-Off المستقرة بشكل مضاعف (HEK 293 و HeLa و PC12) مع هذا النظام لدمج نسخ من بلازميدات المنظم والاستجابة للوصول المريح إلى التعبير الجيني القابل للتحكم7و8و9.
وقد استخدمت عدة نماذج من الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة لدراسة البيولوجيا الخلوية والجزيئية للظهارة السنخية. لسنوات، وقد استخدم الباحثون على نطاق واسع الإنسان أو القوارض الخلايا الأولية10،11 وكذلك خطوط الخلايا الخالدة مثل A549 الإنسان أو الفئران RLE-6TN الخلايا12،13. على الرغم من أنها عموما أقل تكاثرية وأكثر صعوبة للثقافة وtransfect، الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية لا تزال المعيار الذهبي لدراسة وظيفة وخلل وظيفي من ظهارة السنخية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. في الواقع ، لا تظهر خطوط الخلايا الخالدة مثل خلايا A549 الخصائص المعقدة والأنماط الظاهرية للخلايا الأولية ، في حين أن الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية تلخص الخصائص الرئيسية للظهارة السنخية ، ولا سيما القدرة على تشكيل حاجز مستقطب وضيق14،15. لسوء الحظ ، فإن هذه الخلايا مقاومة للغاية لتقنيات الترانزفيشن التقليدية ، مثل تلك التي تستخدم الليبوزومات ، مما يجعل استخدام نظام مستحث ًا للمروج مثل Tet-Off أمرًا صعبًا للغاية.
التشكيل posttranscriptional من mRNAs هي واحدة من أكثر الطرق فعالية لتعديل سريع التعبير الجيني للنص16. وتلعب المنطقة غير المترجمة من قبل مرنا 3 '(3' UTR) دوراً هاماً في هذه الآلية. وقد ثبت أنه، على عكس 5 'UTR، هناك ارتباط أسي بين طول UTR 3 'والتعقيدات الخلوية والمورفولوجية للكائن الحي. هذا الارتباط يشير إلى أن UTR 3 ' ، مثل مناطق ترميز مرنا ، قد تعرضت للاختيار الطبيعي للسماح لتعديل ما بعد النسخ معقدة على نحو متزايد في جميع أنحاء تطور17. يحتوي UTR 3 'على العديد من المواقع الملزمة للبروتينات وmiRNAs التي تؤثر على استقرار وترجمة النص.
في هذا العمل ، وضعنا أداة للتحقيق في دور المجالات المحفوظة للغاية في UTR 3 ' من GOI للسيطرة على استقرار النص. ركزنا على قناة الصوديوم الظهارية ، وحدة ألفا الفرعية (αENaC) ، والتي تلعب دورًا رئيسيًا في فسيولوجيا الظفية الظهارية18. تم نقل الخلايا الظهارية الألفية في الثقافة الأولية بنجاح بشكل عابر مع المكونين من نظام Tet-Off ، والذي يسمح بدراسة دور UTR 3 'في استقرار مرنا مع نظام يؤثر بشكل أدنى على فسيولوجيا الخلايا والتمثيل الغذائي بالمقارنة مع استخدام مثبطات النسخ مع بروتوكولات أخرى. ووُضعت استراتيجية للاستنساخ للتمييز بين تعبير الـ GOI والتعبير عن الجين الذاتي باستخدام نسخة غير منسّبة (V5). ثم تم نقل الاستجابة والبلازميدات التنظيمية إلى الخلايا الظهارية السنخية باستخدام تقنية الكهربية ماصة. وفي وقت لاحق، تم قياس التعبير عن النص من خلال احتضان الخلايا مع الدوكسيسيكلين على فترات زمنية مختلفة. تم تقييم نصف عمر النص من قبل RT-qPCR باستخدام طريقة CQ معدلة باستخدام منتج tTA-Ad مرنا عبر العدوى للتطبيع. من خلال بروتوكولنا، نقدم طريقة مريحة لدراسة التشكيل اللاحق للنسخة من نسخة في ظل ظروف مختلفة وتحديد مشاركة المناطق غير المترجمة بمزيد من التفصيل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

دراسة التنظيم بعد النسخ أمر أساسي لفهم تعديل الحمض النووي الريبي رسول معين (مرنا) وتأثيره على التوازن الخلية والتمثيل الغذائي. في الواقع ، يمكن للتقلبات في التعبير عن النص تعديل كفاءة الترجمة وفي نهاية المطاف النشاط الخلوي للنص. وقد وضعت عدة نهج تجريبية للتحقيق في نصف عمر مرنا على الرغم من أن بعض هذه الأساليب لديها قيود تمنع الدراسة السليمة للتشكيل بعد النسخ. يمكن لنظام التعريفي المروج التعبير عن جين ذات أهمية تحت سيطرة مروج الاصطناعية التتراسيكلين المنظمة. تسمح هذه الطريقة بتقدير نصف العمر لـ مرنا معين تحت أي حالة تجريبية دون التوازن الخلوي المزعج. عيب رئيسي واحد من هذه الطريقة هو ضرورة الخلايا transfect، مما يحد من استخدام هذه التقنية في الخلايا الأولية المعزولة التي هي مقاومة للغاية لتقنيات الترانزفيشن التقليدية. وقد استخدمت الخلايا الظهارية الألفية في الثقافة الأولية على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا الخلوية والجزيئية للظهارة السنخية. الخصائص الفريدة والنمط الظاهري للخلايا السنخية الأولية تجعل من الضروري دراسة التشكيلات الما بعد النسخ من الجينات ذات الأهمية في هذه الخلايا. لذلك ، كان هدفنا هو تطوير أداة جديدة للتحقيق في التشكيلات المابعد النسخية من mRNAs ذات الاهتمام في الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية. قمنا بتصميم بروتوكول نقل عابر سريع وفعال لإدراج نظام تعبير البلازميد الذي يتم التحكم فيه بشكل نصي في الخلايا الظهارية السنخية الأولية. هذه الاستراتيجية الاستنساخ، وذلك باستخدام epitope الفيروسية لوضع علامة على بناء، يسمح للتمييز السهل من بناء التعبير من ذلك من mRNAs الذاتية. باستخدام طريقة تعديل دورة القياس الكمي (Cq) ، يمكن بعد ذلك قياس التعبير عن النص في فترات زمنية مختلفة لقياس نصف عمره. توضح بياناتنا كفاءة هذا النهج الجديد في دراسة التنظيم بعد النسخ في مختلف الظروف الفسيولوجية المرضية في الخلايا الظهارية السنخية الأولية.

وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لتوليد نظام التعبير بلازميد Tt-Off التي تسيطر عليها لتقييم أهمية أجزاء مختلفة من utR αENaC 3 'في تعديل استقرار النص في الخلايا الظهارية السنخية الأولية.
كانت الخطوة الأولى في تنفيذ هذا النظام هي إنشاء تقنية نقل س?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

هنا ، نقدم أداة يمكن استخدامها لدراسة التشكيل ما بعد النسخ من نسخة في الخلايا الظهارية السنخية الأولية باستخدام نظام تعبير غير قابل للاختزال إلى جانب تقنية الكهربية ماصة.

كفاءة النسخ التي تسيطر عليها نظام التعبير Plasmid للتحقيق في استقرار نصوص مرنا في الخلايا الظهارية الألفيولار الابتدائية

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

لذا فإن نموذجنا يسمح بدراسة التشكيل اللاحق للنسخي لنسخة محددة في الخلايا الظهارية السنخية في الثقافة الأولية وظروفها الفسيولوجية والفيزيولوجية. وبالتالي فإن transfection عابرة من الخلايا الظهارية السنخية الأولية لديها تأثير ضئيل على فسيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي، والذي يشكل ميزة واضحة على البروتوكولات الكلاسيكية باستخدام مثبطات النسخ. لتوليد استجابة plasmid التعبير عن جين من الاهتمام ، وتسلسل الجين ، ومواقع استنساخ متعددة من ناقلات غير قابل للاندهار يجب تحليلها لتحديد تسلسل التعرف في مواقع الاستنساخ المتعددة التي لا توجد داخليا في الجين.باستخدام عالية الدقة طق البوليميراز والمعايير تداخل تقنيات PCR، يحيط جين من الفائدة مع اثنين من مواقع التعرف على إنزيم تقييد مختارة باستخدام التمهيديات مصمم. يجب تضمين تسلسل في ترميز الـ V5 في المنبع من جينة الاهتمام لتمييز التعبير عن الجين المُصاب بالعدوى عن التعبير الداخلي. يمكن توليد المسوخ عن طريق الحذف المتسلسل لدراسة آثار المناطق الثلاث غير المترجمة الرئيسية المختلفة على استقرار مرنا الجينات باستخدام الأحرف التمهيدية العكسية التي تقوم بترميز موقع تعدد الأمهات الذي يحذف تدريجياً النهاية الرئيسية الثلاثة للمنطقة غير المترجمة.في نهاية المطاف، يمكن تأكيد إدراج جين الفائدة من خلال تحليل القيود. ويمكن تأكيد التوجه الجيني وعدم وجود طفرات يحتمل أن يتم إدخالها أثناء rtPCR عن طريق التسلسل. بالنسبة لtransfection من نوع الرئة الفئران الأولية اثنين من الخلايا الظهارية السنخية، بذور الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل سنتيمتر مربع في 100 ملليمتر أطباق بيتري في وجود كامل الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية.ثقافة ل 24 ساعات في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. في اليوم التالي، إضافة 500 ميكرولترات من المتوسط الكامل دون مضاد حيوي إلى كل بئر من لوحة جديدة 12 جيدا وقبل الدافئة لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الحضانة، إضافة ميكروغرام واحد من بلازميد استجابة وميكر واحد من ناقلات التنظيمية إلى أنبوب واحد 1.5 ملليلتر في البئر.اغسل الخلايا الظهارية السنخية بـ 10 ملليلترات في البئر من 37 درجة مئوية PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم وتعامل الخلايا بخمس ملليلترات في البئر من 37 درجة مئوية 0.05٪ التربسين لمدة 2-4 دقائق في حاضنة ثقافة الخلية. عندما تكون الخلايا قد فصلت، تحييد التربسين مع 10 ملليلتر في بئر من المتوسط الكامل دون مضاد حيوي وجمع الخلايا في أنبوب جديد 50 ملليلتر. غسل الطبق مع أربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة لجمع أي الخلايا المتبقية ورواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لحساب والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. Resuspend بيليه في كثافة أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من العازلة resuspension وإضافة أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة إلى كل أنبوب من البلازميد والمتجه مع خلط لطيف. ضع أنبوبًا واحدًا في جهاز الكهربة وملأ الأنبوب بـ 3.5 ملليلتر من العازلة الكهالكية.اجبس المكبس تمامًا لإدراج طرف قطب مطلي بالذهب في ماصة ويخلط محتويات الأنبوب بلطف. استلهم الخلايا بعناية باستخدام ماصة وأدخل الماصات في محطة الكهرباء حتى يتم سماع صوت النقر. حدد بروتوكول الإلكتروبور المناسب للخلايا الظهارية السنخية واضغط على Start على شاشة اللمس.مباشرة بعد transfection، وإزالة ماصة ونقل الخلايا في بئر واحد من قبل 12 لوحة جيدا. عندما تكون جميع الخلايا الكهربية ومطلية ، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية ، واستبدال المافق في كل بئر بوسيلة كاملة بالمضادات الحيوية بعد يومين. ويمكن تأكيد نجاح transfection من خلال التعبير عن EGFP كما لوحظ من قبل المجهر الفلوريسنس أو تدفق قياس الاستئصال باستخدام ناقل مكافحة.لمنع النسخ الجينية من الفائدة، 72 ساعة بعد transfection استبدال نابيرت مع مليلتر واحد في بئر من المتوسط الكامل تكمل مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من adoxycycline الطازجة. لتقييم نصف عمر مرنا من الجين من الفائدة، والعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية من 15 دقيقة إلى ست ساعات. غسل واحد جيدا مع ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS قبل lysing الخلايا مع 500 microliters من عازلة تحلل من طقم استخراج الكلوروفورم الكلوروفورم الفينول المتاحة تجاريا واهتزاز لطيف في كل نقطة زمنية تجريبية.ثم، عزل الجيش الملكي النيبالي وفقا لتعليمات عدة وتحديد العائد RNA والنقاء بواسطة القياس الطيفي في 230، 260، و 280 نانومتر. لتحديد استقرار الحمض النووي الريبي المعزول، أول علاج ميكروغرام واحد من مجموع الحمض النووي الريبي من كل عينة مع RNase مجاناً DNase واحدة لإزالة أي آثار الحمض النووي plasmid. استخدام طقم التوليف cDNA المتاحة تجاريا مع مزيج من oligo dT والاعتياءات سداسية عشوائية لتحسين كفاءة النسخ العكسي لعكس نسخ الحمض النووي المستنفدة RNA مجموع في cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.إضافة 180 ميكرولترات من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية إلى 20 ميكرولترات من مزيج التفاعل لتخفيف رد فعل cDNA في خمسة نانوغرام لكل تركيز ميكرولتر وتمييع على الفور مزيج cDNA مع الأحياء الجزيئية العذبة الصف المياه للوصول إلى 1.25 نانوغرام لكل تركيز ميكرولتر. الجمع بين خمسة microliters من الانترنت الأخضر ماجستير مزيج مع 0.1 ميكرولتر من المياه الصف البيولوجيا الجزيئية، 0.45 ميكرولترات من 7.5 micromolar إلى الأمام التمهيدي، 0.45 ميكرولترات من 7.5 micromolar عكس التمهيدي، وأربعة ميكرولترات من 1.25 نانوغرام لكل ميكروليلتر من cDNA للحصول على حجم رد فعل إجمالي من 10 ميكرولتر. ضع العينات في ثيرسيكلر qPCR وتضخيم جين علامة V5 من الفائدة وtetrocycline transactivator upactivons باستخدام شروط qPCR كما هو مبين وتوليد منحنى ذوبان عالية الدقة لتقييم درجات حرارة ذوبان محددة من amplicons المطلوبة وضمان عدم وجود قمم اكبريكون الضوضاء.هذه التقنية electroporation الماصات يسهل 25 إلى 30٪ معدل كفاءة transfection كما لوحظ من قبل نسب من الخلايا EGFP الكشف عن طريق المجهر الفلوريسنس والتدفق استئصال الخلايا. علاج الخلايا الظهارية السنخية مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الدوكسيسيكلين ليس له تأثير كبير على التعبير عن الحمض الداخلي ألفا ENaC مرنا في أي وقت خلال فترة العلاج. باستخدام نظام التعبير المتحكم به بشكل نسخي كما هو موضح، V5 ألفا ENaC إشارة يمكن تطبيع وفقا لاتتراسيكلين transactivator إشارة متقدمة لتحديد كفاءة transfection باستخدام طريقة دورة القياس الكمي دلتا مزدوجة.نصف عمر ألفا ENaC مرنا أقصر سبع مرات في وجود نظام التتراسيكلين قبالة مما كانت عليه في وجود actinomycin D, مؤكدا أن actinomycin D يؤدي إلى تحقيق الاستقرار في الرنا ألفا أثرية. وعلاوة على ذلك، cyclohexamide والورم معامل ألفا عامل انخفض بشكل ملحوظ في استقرار النص في حين lipopolysaccharides لا. يمكن إحداث تغييرات كبيرة في تعديل V5 ألفا ENaC استقرار مرنا اعتمادا على المناطق المحذوفة وشملت من ثلاثة الرئيسي المنطقة غير مترجمة.وبالإضافة إلى ذلك، فإن أكثر من التعبير عن بروتينات ملزمة RNA محددة يقلل من استقرار 5-ألفا ENaC مرنا مقارنة مع transfection مع pcdna فارغة ثلاثة plasmid. هذه الأداة ستكون مفيدة للاستعلام عن رؤى جديدة في التنظيم ما بعد النسخ من الجينات الرئيسية المعنية في وظيفة ظهارة السنخية وظروفهم الفسيولوجية أو المرضية.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

التحقيق استنادا التدخل-RNA من وظيفة من حرارة صدمة بروتين 27 خلال شفاء القرنية طلائي الجرح

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

في المختبر فحص الإضاءة الحيوية تميز إيقاع سيركاديان في الخلايا الظهارية الثديية

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

تعبير عابر "للجينات الأجنبية" في "خلايا الحشرات" (sf9) "البروتين المقايسة الوظيفية"

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

تنقية الخلايا منخفض وفيرة في النظام المرئي المورفولوجية

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...