Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Francis Migneault werd ondersteund door een beurs die werd verstrekt door het Quebec Respiratory Health Network en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) longtraining, een studentenschip van FRSQ en een studentenschip van de Faculté des Études Supérieures et Postdoctoraal, Université de Montréal. Dit werk werd ondersteund door de Gosselin-Lamarre Leerstoel klinisch onderzoek en de Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging van het Onderzoekscentrum van Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Ontwerp en generatie van de respons plasmid uitdrukken van het gen van belang (IGoI)
<ol><li>Gebruik een inducible tetracycline-off vector, zoals pTRE-Tight.</li>
	<li>Analyseer de volgorde van de GoI en de meervoudige kloonsite (...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

De lage transfection rate van alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur is een ernstige beperking voor het gebruik van het Tet-Off systeem om de mRNA stabiliteit in deze cellen te beoordelen. Deze beperking werd echter overwonnen door pipetelektroporatie, waardoor een transfection-efficiëntie van 25-30% mogelijk was (figuur 1 en figuur 3)26.
De meting van transcript stabiliteit is fundamenteel voor het be...

Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om de halflevensduur van mRNAs te bepalen. De pulse-chase verval techniek, die gebruik maakt van gelabelde mRNAs, zorgt voor de gelijktijdige evaluatie van een grote pool van mRNAs met minimale cellulaire verstoring. Deze benadering staat echter geen directe schatting toe van de halfringstijd van één enkel gentranscript en kan niet worden uitgevoerd om de posttranscriptional modulatie van een mRNA te bestuderen na stimulatie met groeifactoren, ROS, alarminen ofontsteking1.
Het gebruik van transcriptieremmers, zoals actinomycine D en α-amanitine, is een relatief eenvoudige methode voor het meten van mRNA afbraakkinetiek in de tijd. Een belangrijk voordeel van deze aanpak ten opzichte van die van eerdere technieken(d.w.z. pulse-chase) is afhankelijk van de mogelijkheid om de halfduur van een bepaald transcript direct in te schatten en te vergelijken hoe verschillende behandelingen de afbraakkinetiek kunnen beïnvloeden. De aanzienlijke schadelijke impact van transcriptieremmers op de celfysiologie vormt echter een groot nadeel van de aanpak2. Inderdaad, de remming van de hele cel transcriptome met deze geneesmiddelen heeft de negatieve bijwerking van verstoren de synthese van belangrijke elementen die betrokken zijn bij mRNA stabiliteit, zoals microRNAs (miRNAs), evenals de expressie en synthese van RNA-bindende eiwitten, die belangrijk zijn voor mRNA afbraak en stabiliteit. De ernstige verstoring van gentranscriptie door deze geneesmiddelen zou daarom de degradatiekrommen van transcripties artefactually kunnen wijzigen.
Het promotorinductiesysteem vertegenwoordigt een derde benadering om de halfduur van een specifiek mRNA te meten. Deze methode meet de afbraak van een specifiek mRNA op een vergelijkbare manier als methoden die transcriptieremmers gebruiken. Er worden vaak twee soorten inductiesystemen gebruikt: de door serum geïnduceerde c-fos promotor3 en het Tet-Off onducible systeem4. Met het c-fos-systeem is het gebruik van transcriptieremmers die giftig kunnen zijn voor de cel niet nodig. Deze methode vereist echter synchronisatie van de celcyclus, waardoor de evaluatie van de werkelijke stabiliteit van een transcript tijdens interfase5wordt voorkomen. Het Tet-Off-systeem maakt daarentegen de sterke expressie van het gen of interest (GoI) mogelijk onder controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Dit systeem vereist de aanwezigheid van twee elementen die moeten worden gecotransfected in de cel functioneel te zijn. De eerste plasmid (pTet-Off) drukt het regelgevende eiwit tTA-Adv uit, een hybride synthetische transcriptiefactor bestaande uit de prokaryotische repressor TetR (van Escherichia coli) versmolten tot drie transcriptietransactivatiedomeinen van het virale eiwit HSV VP16. De Ingoi wordt gekloond in de pTRE-Tight plasmid onder controle van een synthetische promotor (PTight),bestaande uit de minimale volgorde van het cytomegalovirus (CMV) promotor gesmolten tot zeven herhalingen van de tetO operator sequentie. De transcriptie van het gen stroomafwaarts van PTight is afhankelijk van de interactie van TetR met tetO. In aanwezigheid van tetracycline of zijn afgeleide, doxycycline, verliest de TetR-onderdrukker zijn affiniteit met de tetO-operator, wat leidt tot een stopzetting van de transcriptie4. De kenmerken van het Tet-Off-systeem maken het een ideaal model voor de studie van specifieke mRNA-expressie in eukaryotische cellen, terwijl potentiële pleiotropische effecten worden vermeden die ondergeschikt zijn aan de afwezigheid van prokaryotische regulerende sequenties in eukaryotische cel6. Meestal worden dubbel stabiele Tet-Off-cellijnen (HEK 293, HeLa en PC12) met dit systeem gebruikt om kopieën van de regulator en responsplasmids te integreren voor gemakkelijke toegang tot controleerbare genexpressie7,8,9.
Verschillende modellen van alveolar epitheelcellen in de cultuur zijn gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. Jarenlang hebben onderzoekers op grote schaal gebruik gemaakt van menselijke of knaagdier primaire cellen10,11 evenals vereeuwigde cellijnen zoals de menselijke A549 of rat RLE-6TN cellen12,13. Hoewel ze over het algemeen minder proliferative en moeilijker te kweken en transfect, alveolar epitheel cellen in de primaire cultuur blijven de gouden standaard voor de studie van de functie en disfunctie van de alveolar epitheel in fysiologische en pathologische omstandigheden. Inderdaad, vereeuwigde cellijnen zoals A549 cellen vertonen niet de complexe kenmerken en fenotypen van primaire cellen, terwijl alveolar epitheliale cellen in de primaire cultuur de belangrijkste eigenschappen van het alveolaire epitheel samenvatten, met name het vermogen om een gepolariseerde en strakke barrière te vormen14,15. Helaas zijn deze cellen zeer resistent tegen conventionele transfection technieken, zoals die gebruik te maken van liposomen, waardoor het gebruik van een promotor-geïnduceerde systeem zoals Tet-Off zeer moeilijk.
De posttranscriptional modulatie van mRNAs is een van de meest effectieve methoden voor het snel moduleren van de genexpressie van een transcript16. De onvertaalde regio mRNA 3 (3' UTR) speelt een belangrijke rol in dit mechanisme. Het is aangetoond dat, in tegenstelling tot de 5' UTR, er een exponentiële correlatie is tussen de lengte van de 3' UTR en de cellulaire en morfologische complexiteitvan een organisme. Deze correlatie suggereert dat de 3' UTR, net als de mRNA-coderingsgebieden, is onderworpen aan natuurlijke selectie om in evolutie17steeds complexere posttranscriptiemogelijk te maken. De 3' UTR bevat verschillende bindende sites voor eiwitten en miRNAs die de stabiliteit en vertaling van het transcript beïnvloeden.
In het huidige werk ontwikkelden we een tool om de rol van sterk bewaarde domeinen in de 3' UTR van een InI voor de controle van de stabiliteit van het transcript te onderzoeken. We richtten ons op het epitheliale natriumkanaal, alfa subunit (αENaC), die een belangrijke rol speelt in alveolar epitheelfysiologie18. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur werden met succes tijdelijk transfected met de twee componenten van het Tet-Off-systeem, dat het mogelijk maakt voor de studie van de rol van de 3' UTR in mRNA stabiliteit met een systeem dat minimaal van invloed op de celfysiologie en metabolisme in vergelijking met het gebruik van transcriptieremmers met andere protocollen. Een kloonstrategie werd ontwikkeld om de expressie van de Ini te onderscheiden van die van het endogene gen met behulp van een nonendogene uitgedrukte epitope (V5). De respons en regelgevende plasmiden werden vervolgens overgebracht naar alveolar epitheel cellen met behulp van een pipet elektroporatie techniek. Vervolgens werd de expressie van het transcript gemeten door de cellen met doxycycline op verschillende tijdstippen uit te broeden. De halfwaardetijd van het transcript werd geëvalueerd door RT-qPCR met een aangepaste Cq-methode met behulp van het transfected tTA-Ad mRNA product voor normalisatie. Door middel van ons protocol bieden we een handige manier om de posttranscriptional modulatie van een transcript onder verschillende voorwaarden te bestuderen en de betrokkenheid van de onvertaalde regio's in meer detail te definiëren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

Het bestuderen van posttranscriptional regulatie is fundamenteel voor het begrijpen van de modulatie van een bepaalde boodschapper RNA (mRNA) en de impact ervan op cel homeostase en metabolisme. Inderdaad, schommelingen in transcript expressie zou kunnen wijzigen van de vertaling efficiëntie en uiteindelijk de cellulaire activiteit van een transcript. Verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om de half-life van mRNA te onderzoeken, hoewel sommige van deze methoden beperkingen hebben die de juiste studie van posttranscriptional modulatie voorkomen. Een promotor inductiesysteem kan een gen van belang uitdrukken onder de controle van een synthetische tetracycline-gereguleerde promotor. Deze methode maakt de half-life schatting van een bepaalde mRNA onder een experimentele aandoening zonder storende cel homeostase. Een groot nadeel van deze methode is de noodzaak om cellen transfect, die het gebruik van deze techniek in geïsoleerde primaire cellen die zeer resistent zijn tegen conventionele transfection technieken beperkt. Alveolar epitheelcellen in de primaire cultuur zijn uitgebreid gebruikt om de cellulaire en moleculaire biologie van het alveolar epitheel te bestuderen. De unieke kenmerken en fenotype van primaire alveolarcellen maken het essentieel om de posttranscriptionalmodulaties van genen van belang in deze cellen te bestuderen. Daarom was ons doel om een nieuw instrument te ontwikkelen om de posttranscriptional modulaties van mRNAs van belang in alveolar epitheelcellen in primaire cultuur te onderzoeken. We ontwierpen een snel en efficiënt transieel transfection protocol om een transcriptiegestuurd plasmidexpressiesysteem in primaire alveolar epitheelcellen te plaatsen. Deze kloonstrategie, met behulp van een virale epitope om de constructie te taggen, zorgt voor de gemakkelijke discriminatie van constructexpressie uit die van endogene mRNAs. Met behulp van een gewijzigde ΔΔ kwantificeringscyclus (Cq) methode, kan de expressie van het transcript vervolgens worden gekwantificeerd op verschillende tijdstippen om de halfwaardetijd te meten. Onze gegevens tonen de efficiëntie van deze nieuwe aanpak bij het bestuderen van posttranscriptional regulatie in verschillende pathofysiologische omstandigheden in primaire alveolar epitheelcellen.

Dit protocol werd met succes gebruikt om een Tet-Off transcriptiesysteem te genereren dat plasmaleexpressiesysteem bevat om het belang van verschillende delen van de αENaC 3' UTR in de modulatie van transcriptiestabiliteit in primaire alveolar epitheelcellen te evalueren.
De eerste stap in de implementatie van dit systeem was het vaststellen van een snelle, eenvoudige en efficiënte transfection techniek voor alveolar epitheelc...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Hier presenteren we een tool die kan worden gebruikt om de posttranscriptional modulatie van een transcript in primaire alveolar epitheelcellen te bestuderen met behulp van een induceerbaar expressiesysteem gekoppeld aan een pipet elektroporatietechniek.

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Dus ons model maakt studie van de post-transcriptional modulatie van een specifieke transcriptie in alveolaire epitheliale cellen in de primaire cultuur en hun fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Dus de voorbijgaande transfectie van primaire alveolaire epitheelcellen heeft een minimaal effect op de celfysiologie en metabolisme, wat een duidelijk voordeel vormt ten opzichte van klassieke protocollen met transcriptieremmers. Voor het genereren van een responsplasmid die een gen van belang uitdrukt, moeten de sequentie van het gen en de meervoudige kloonplaatsen van de inducible vector worden geanalyseerd om de herkenningssequenties in de meervoudige kloonplaatsen te identificeren die intern niet in het gen aanwezig zijn.Met behulp van high fidelity taq polymerase en standaard overlap PCR technieken, flankeren het gen van belang met twee geselecteerde beperking enzym herkenning sites met behulp van designer primers. Een sequentie bij het coderen van de V5 epitoop van het gen van belang moet worden opgenomen om de expressie van het transfected gen te onderscheiden van endogene expressie. Mutanten kunnen worden gegenereerd door sequentiële verwijdering om de effecten van verschillende drie eerste onvertaalde gebieden op de stabiliteit van het mRNA van het gen te bestuderen met behulp van omgekeerde primers die een polyadenylation-site coderen die geleidelijk het drieste uiteinde van het onvertaalde gebied verwijdert.Uiteindelijk kan de invoeging van het gen van belang worden bevestigd door beperkingsanalyse. De genoriëntatie en de afwezigheid van mutaties die mogelijk tijdens de RTPCR worden geïntroduceerd, kunnen worden bevestigd door sequencing. Voor de transfectie van primaire rattenlong type twee alveolaire epitheelcellen, zaad de cellen op een een keer 10 tot de zesde cellen per vierkante centimeter in 100 millimeter Petri gerechten in aanwezigheid van volledige minimale essentiële medium.Cultuur voor 24 uur bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide met vochtigheid. De volgende dag, voeg 500 microliter van volledig medium zonder antibioticum aan elke put van een nieuwe 12 put plaat en pre-warm de plaat op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voeg tijdens deze incubatie één microgram van de responsplasmik en één microgram regulerende vector toe aan één buis van 1,5 milliliter per put.Was de epitheelcellen van de alveolaire met 10 milliliter per put van 37 graden Celsius PBS zonder calcium of magnesium en behandel de cellen met vijf milliliter per put van 37 graden Celsius 0,05%trypsine gedurende twee tot vier minuten in de celkweek incubator. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, neutraliseren de trypsine met 10 milliliter per put van compleet medium zonder antibioticum en het verzamelen van de cellen in een nieuwe 50 milliliter buis. Was de schotel met vier milliliter vers medium om de resterende cellen te verzamelen en sediment de cellen door centrifugatie.Resuspend de pellet in een milliliter PBS voor het tellen en centrifugeren van de cellen weer. Resuspend de pellet bij een dichtheid van vier keer 10 tot de zevende cellen per milliliter resuspensie buffer en voeg vier keer 10 aan de vijfde cellen aan elke buis van plasmid en vector met zachte menging. Plaats één buis in het elektroporatieapparaat en vul de buis met 3,5 milliliter elektrolytische buffer.Druk de zuiger volledig onder om een vergulde elektrodepunt in een pipet te plaatsen en meng voorzichtig de buisinhoud. Voorzichtig aanzuigen van de cellen met een pipet en steek de pipet in de elektroporatie station totdat een klikkend geluid is gehoord. Selecteer het juiste elektroporatieprotocol voor epitheelcellen van alveolaire cellen en druk op Start op het touchscreen.Onmiddellijk na de transfectie, verwijder de pipet en breng de cellen in een put van de voorverwarmde 12 put plaat. Wanneer alle cellen zijn geëlektrooeerd en verguld, plaats de plaat in de celcultuur incubator, ter vervanging van de supernatant in elke put met compleet medium met antibiotica na twee dagen. Het succes van de transfectie kan worden bevestigd door de expressie van EGFP zoals waargenomen door fluorescentiemicroscopie of stroomcytometrie met behulp van een controlevector.Om de transcriptie van het gen van belang te remmen, 72 uur na de transfectie vervang de supernatant met een milliliter per goed van compleet medium aangevuld met een microgram per milliliter vers bereide adoxycycline. Om de halvetijd van het mRNA-halfleven van het belang gen te beoordelen, keert u de plaat terug naar de celkweek incubator van 15 minuten tot zes uur. Was een put met een milliliter ijskoude PBS voordat lysing de cellen met 500 microliters van lyse buffer van een commercieel verkrijgbaar fenol chloroform RNA extractie kit en zacht schudden op elk experimenteel tijdstip.Isoleer vervolgens het RNA volgens kitinstructies en bepaal de RNA-opbrengst en -zuiverheid met spectrofotometrie op 230, 260 en 280 nanometer. Om de stabiliteit van het geïsoleerde RNA te bepalen, behandel u eerst één microgram van het totale RNA van elk monster met RNase-vrije DNase om eventuele plasmide DNA-sporen te verwijderen. Gebruik een commercieel verkrijgbaar cDNA synthese kit met een mix van oligo dT en willekeurige hexomer primers om de omgekeerde transcriptie-efficiëntie te verbeteren om het DNA uitgeput totaal RNA om te keren in cDNA volgens de instructies van de fabrikant.Voeg 180 microliter moleculaire biologie kwaliteit water toe aan de 20 microliters van het reactiemengsel om de cDNA-reactie te verdunnen met een concentratie van vijf nanogram per microliter en verdun onmiddellijk de cDNA-mix met vers moleculair biologiewater om een 1,25 nanogram per microliterconcentratie te bereiken. Combineer vijf microliter van cyber groene kleurstof master mix met 0,1 microliter van moleculaire biologie grade water, 0,45 microliters van 7,5 micromolar forward primer, 0,45 microliter van 7,5 micromolar reverse primer, en vier microliter van 1,25 nanogram per microliter van cDNA om een totaal reactievolume van 10 microliter te verkrijgen. Plaats de monsters in een qPCR thermocycler en versterk het V5-taggen van belang en de tetrocycline transactivator voorschotampyl met behulp van de qPCR-omstandigheden zoals aangegeven en genereer een smeltcurve met hoge resolutie om de specifieke smelttemperaturen van de gewenste amplicons te beoordelen en om de afwezigheid van ruisamplylpieken te garanderen.Deze pipet elektroporatie techniek vergemakkelijkt een 25 tot 30% transfectie efficiëntie tarief zoals waargenomen door de verhoudingen van EGFP cellen gedetecteerd door fluorescentie microscopie en flow cytometrie. De behandeling van alveolaire epitheelcellen met één microgram per milliliter doxycycline heeft op geen enkel moment tijdens de behandelingsperiode significante invloed op de expressie van endogene alfa ENaC mRNA. Met behulp van een transcriptie gecontroleerd plasmide expressiesysteem zoals aangetoond, V5 alpha ENaC signaal kan worden genormaliseerd volgens de tetracycline transactivator geavanceerde signaal om de efficiëntie van transfectie te bepalen met behulp van de dubbele delta kwantificering cyclus methode.De halfwaardetijd van alfa ENaC mRNA is tot zeven keer korter in aanwezigheid van het tetracycline off systeem dan in aanwezigheid van actinomycine D, wat bevestigt dat actinomycine D leidt tot een artefactuele alpha ENaC mRNA stabilisatie. Verder, cyclohexamide en tumor necrose factor alpha behandeling aanzienlijk verminderd de stabiliteit van het transcript, terwijl lipopolysaccharides niet. Belangrijke veranderingen in de modulatie van V5 alpha ENaC mRNA stabiliteit kunnen worden veroorzaakt, afhankelijk van de verwijderde en opgenomen regio's van de drie eerste onvertaalde regio.Bovendien vermindert de overexpressie van specifieke RNA-bindende eiwitten de stabiliteit van 5-alfa ENaC mRNA in vergelijking met transfectie met een lege pcDNA drie plasmide. Deze tool zal nuttig zijn voor het opvragen van nieuwe inzichten in de post-transcriptie regulatie van belangrijke genen die betrokken zijn bij de functie van alveololaire epitheel en hun fysiologische of pathologische omstandigheden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Zuivering van Low-overvloedig cellen in het visuele systeem van Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...