Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Francis Migneault a reçu une bourse du Réseau de santé respiratoire du Québec et du programme de formation pulmonaire des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), d’un programme d’études de la FRSQ et d’un poste d’étudiant de la Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Ces travaux ont été appuyés par la Chaire Gosselin-Lamarre en recherche clinique et les Instituts de recherche en santé du Canada [YBMOP-79544].

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien sur les soins aux animaux et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins aux animaux du Centre de recherche du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM).
1. Conception et génération du plasmide de réponse exprimant le gène d’intérêt (GOI)
<ol><li>Utilisez un vecteur inductible de tétracycline, comme pTRE-Tight.</li>
	<li>Analyser la séquence ...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

Le faible taux de transfection des cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire a été une limitation sérieuse pour l’utilisation du système Tet-Off pour évaluer la stabilité de l’ARNm dans ces cellules. Cependant, cette limitation a été surmontée par l’électroporation de pipette, permettant une efficacité de transfection de 25-30%(figure 1 et figure 3)26.
La mesure de la stabil...

Plusieurs techniques ont été développées pour déterminer la demi-vie des ARNm. La technique de désintégration de la chasse au pouls, qui utilise des ARNm étiquetés, permet l’évaluation simultanée d’un grand bassin d’ARNm avec une perturbation cellulaire minimale. Cependant, cette approche ne permet pas une estimation directe de la demi-vie d’une transcription génétique unique et ne peut pas être mise en œuvre pour étudier la modulation posttranscriptionnelle d’un ARNm suivant la stimulation avec des facteurs de croissance, ROS, alarmines, ou inflammation1.
L’utilisation d’inhibiteurs de transcription, tels que l’actinomycine D et l’amanitine, est une méthode relativement simple pour mesurer la cinétique de dégradation de l’ARNm au fil du temps. L’un des principaux avantages de cette approche par rapport à celui des techniques précédentes (c.-à-d. la chasse au pouls) repose sur la capacité d’estimer directement la demi-vie d’une transcription donnée et de comparer comment différents traitements pourraient affecter sa cinétique de dégradation. Cependant, l’impact délétère significatif des inhibiteurs de transcription sur la physiologie cellulaire représente un inconvénient majeur de l’approche2. En effet, l’inhibition de l’ensemble du transcriptome cellulaire avec ces médicaments a l’effet secondaire négatif de perturbing la synthèse des éléments clés impliqués dans la stabilité de l’ARNm, tels que les microARN (miRNAs), ainsi que l’expression et la synthèse des protéines liant l’ARN, qui sont importants pour la dégradation et la stabilité de l’ARNm. La perturbation sévère de la transcription de gène par ces drogues pourrait donc modifier artefactually les courbes de dégradation des transcriptions.
Le système d’induction du promoteur représente une troisième approche pour mesurer la demi-vie d’un ARNm spécifique. Cette méthode mesure la dégradation d’un ARNm spécifique de la même manière que les méthodes qui utilisent des inhibiteurs de transcription. Deux types de systèmes d’induction sont fréquemment utilisés : le promoteur c-fos induit par le sérum3 et le système inductible Tet-Off4. Avec le système c-fos, l’utilisation d’inhibiteurs de transcription qui peuvent être toxiques pour la cellule n’est pas nécessaire. Cependant, cette méthode nécessite la synchronisation du cycle cellulaire, ce qui empêche l’évaluation de la stabilité réelle d’une transcription pendant l’interphase5. En revanche, le système Tet-Off permet l’expression forte du gène d’intérêt (GOI) sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline réglementé. Ce système nécessite la présence de deux éléments qui doivent être cotransfectés dans la cellule pour être fonctionnel. Le premier plasmide (pTet-Off) exprime la protéine réglementaire tTA-Adv, un facteur hybride de transcription synthétique composé du répresseur procaryotique TetR (d’Escherichia coli) fusionné à trois domaines de transactivation de transcription de la protéine virale HSV VP16. Le GOI est cloné dans le plasmide pTRE-Tight sous le contrôle d’un promoteur synthétique (PTight), comprenant la séquence minimale du promoteur de cytomégalovirus (CMV) fusionné à sept répétitions de la séquence de l’opérateur tetO. La transcription du gène en aval de PTight dépend de l’interaction de TetR avec le tetO. En présence de tétracycline ou de son dérivé, doxycycline, le répresseur TetR perd son affinité pour l’opérateur tetO, conduisant à une cessation de la transcription4. Les caractéristiques du système Tet-Off en font un modèle idéal pour l’étude de l’expression spécifique de l’ARNm dans les cellules eucaryotes tout en évitant les effets pléiotropic potentiels qui sont secondaires à l’absence de séquences réglementaires procaryotes dans la cellule eucaryote6. Habituellement, les lignes cellulaires Tet-Off doublement stables (HEK 293, HeLa et PC12) sont utilisées avec ce système pour intégrer des copies des plasmides de régulateur et de réponse pour un accès pratique à l’expression génique contrôlable7,8,9.
Plusieurs modèles de cellules épithéliales alvéolaires en culture ont été utilisés pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Pendant des années, les chercheurs ont largement utilisé les cellules primaires humaines ou rongrices10,11 ainsi que des lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules humaines A549 ou rat RLE-6TN12,13. Bien qu’elles soient généralement moins prolifératives et plus difficiles à culture et à transfecter, les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire demeurent l’étalon-or pour l’étude de la fonction et du dysfonctionnement de l’épithélium alvéolaire dans des conditions physiologiques et pathologiques. En effet, les lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules A549 ne présentent pas les caractéristiques complexes et les phénotypes des cellules primaires, tandis que les cellules épithéliales alvéolaires de la culture primaire récapitulent les principales propriétés de l’épithélium alvéolaire, en particulier la capacité de former une barrière polarisée et serrée14,15. Malheureusement, ces cellules sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles, telles que celles utilisant des liposomes, ce qui rend très difficile l’utilisation d’un système induit par un promoteur comme le Tet-Off.
La modulation posttranscriptionnelle des ARNm est l’une des méthodes les plus efficaces pour moduler rapidement l’expression génique d’une transcription16. La région non traduite de l’ARNM 3 (3' UTR) joue un rôle important dans ce mécanisme. Il a été démontré que, contrairement à l’UTR de 5', il existe une corrélation exponentielle entre la longueur de l’UTR de 3' et les complexités cellulaires et morphologiques d’un organisme. Cette corrélation suggère que l’UTR 3', comme les régions de codage de l’ARNm, a été soumis à la sélection naturelle pour permettre une modulation posttranscriptionnelle de plus en plus complexe tout au long de l’évolution17. L’UTR 3' contient plusieurs sites de liaison pour les protéines et les miARN qui affectent la stabilité et la traduction de la transcription.
Dans le présent travail, nous avons développé un outil pour étudier le rôle des domaines hautement conservés dans les 3' UTR d’un GOI pour le contrôle de la stabilité des transcriptions. Nous nous sommes concentrés sur le canal épithélial de sodium, sous-unité alpha (ENaC), qui joue un rôle clé dans la physiologie épithéliale alvéolaire18. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été avec succès transitoirement transagères avec les deux composants du système Tet-Off, qui permet l’étude du rôle de l’UTR 3' dans la stabilité de l’ARNm avec un système qui affecte de façon minimale la physiologie cellulaire et le métabolisme par rapport à l’utilisation des inhibiteurs de transcription avec d’autres protocoles. Une stratégie de clonage a été développée pour différencier l’expression du GOI de celle du gène endogène à l’aide d’une épitope non endogènement exprimée (V5). La réponse et les plasmides régulateurs ont ensuite été transférés dans les cellules épithéliales alvéolaires utilisant une technique d’électroporation de pipette. Par la suite, l’expression de la transcription a été mesurée en incuber les cellules avec la doxycycline à différents intervalles de temps. La demi-vie de la transcription a été évaluée par RT-qPCR avec une méthode modifiée de Cq utilisant le produit transfected de tTA-Ad mRNA pour la normalisation. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique d’étudier plus en détail la modulation posttranscriptionnelle d’une transcription dans différentes conditions et de définir plus en détail l’implication des régions non traduites.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

L’étude de la réglementation posttranscriptionnelle est fondamentale pour comprendre la modulation d’un ARN messager donné (ARNM) et son impact sur l’homéostasie cellulaire et le métabolisme. En effet, les fluctuations de l’expression de transcription pourraient modifier l’efficacité de la traduction et, en fin de compte, l’activité cellulaire d’une transcription. Plusieurs approches expérimentales ont été développées pour étudier la demi-vie de l’ARNm bien que certaines de ces méthodes aient des limites qui empêchent l’étude appropriée de la modulation posttranscriptionale. Un système d’induction promoteur peut exprimer un gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline.regulated. Cette méthode permet l’estimation de demi-vie d’un ARNm donné dans n’importe quelle condition expérimentale sans troubler l’homéostasie cellulaire. Un inconvénient majeur de cette méthode est la nécessité de transfecter les cellules, ce qui limite l’utilisation de cette technique dans les cellules primaires isolées qui sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Les caractéristiques uniques et le phénotype des cellules alvéolaires primaires font qu’il est essentiel d’étudier les modulations posttranscriptionnelles des gènes d’intérêt dans ces cellules. Par conséquent, notre objectif était de développer un nouvel outil pour étudier les modulations posttranscriptionnelles des ARNm d’intérêt pour les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire. Nous avons conçu un protocole transitoire rapide et efficace de transfection pour insérer un système d’expression plasmide contrôlé par transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires. Cette stratégie de clonage, utilisant une épitope virale pour marquer la construction, permet la discrimination facile de l’expression de construction de celle des ARNm endogènes. À l’aide d’une méthode modifiée du cycle de quantification (Cq), l’expression de la transcription peut ensuite être quantifiée à différents intervalles de temps pour mesurer sa demi-vie. Nos données démontrent l’efficacité de cette nouvelle approche en étudiant la régulation posttranscriptionnelle dans diverses conditions pathophysiologiques dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.

Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer un système d’expression plasmide transcriptionnellement contrôlé Tet-Off pour évaluer l’importance de différentes parties de l’UTR de l’ENaC 3 dans la modulation de la stabilité de transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.
La première étape de la mise en œuvre de ce système a été d’établir une technique de transfection r...

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Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Ici, nous présentons un outil qui peut être employé pour étudier la modulation posttranscriptionale d’une transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires en utilisant un système inductible d’expression couplé à une technique d’électroporation de pipette.

Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Ainsi notre modèle permet l’étude de la modulation post-transcriptionnelle d’une transcription spécifique dans les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire et leurs conditions physiologiques et pathophysiologiques. Ainsi, la transfection transitoire des cellules épithéliales alvéolaires primaires a un effet minimal sur la physiologie cellulaire et le métabolisme, ce qui pose un avantage évident sur les protocoles classiques utilisant des inhibiteurs de transcription. Pour la génération d’un plasmide de réponse exprimant un gène d’intérêt, la séquence du gène et les multiples sites de clonage du vecteur inductible doivent être analysés pour identifier les séquences de reconnaissance dans les multiples sites de clonage qui ne sont pas présents à l’intérieur du gène.Utilisant la polymése de taq de haute fidélité et les techniques standard de PCR de chevauchement, flanquent le gène d’intérêt avec deux emplacements choisis de reconnaissance d’enzyme de restriction utilisant des amorces de concepteur. Une séquence de codage de l’épitope V5 en amont du gène d’intérêt doit être incluse pour distinguer l’expression du gène transfecté de l’expression endogène. Les mutants peuvent être générés par suppression séquentielle pour étudier les effets de différentes trois régions premières non traduites sur la stabilité de l’ARNm du gène à l’aide d’amorces inversées codant un site de polyadenylation qui supprime progressivement les trois extrémités principales de la région non traduite.En fin de compte, l’insertion du gène d’intérêt peut être confirmée par l’analyse des restrictions. L’orientation génétique et l’absence de mutations potentiellement introduites pendant le rtPCR peuvent être confirmées par séquençage. Pour la transfection des cellules épithéliales alvéolaires primaires de poumon de rat deux, ensemencer les cellules à une fois 10 aux sixièmes cellules par centimètre carré dans les plats de Petri de 100 millimètres en présence du milieu essentiel minimum complet.Culture pendant 24 heures à 37 degrés Celsius en 5% de dioxyde de carbone avec humidité. Le lendemain, ajouter 500 microlitres de milieu complet sans antibiotique à chaque puits d’une nouvelle plaque de 12 puits et préchauffer la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Au cours de cette incubation, ajouter un microgramme du plasmide de réponse et un microgramme de vecteur réglementaire à un tube de 1,5 millilitre par puits.Lavez les cellules épithéliales alvéolaires avec 10 millilitres par puits de 37 degrés Celsius PBS sans calcium ni magnésium et traitez les cellules avec cinq millilitres par puits de 37 degrés Celsius 0,05% trypsine pendant deux à quatre minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules se sont détachées, neutraliser la trypsine avec 10 millilitres par puits de milieu complet sans antibiotique et de recueillir les cellules dans un nouveau tube de 50 millilitres. Laver le plat avec quatre millilitres de milieu frais pour recueillir les cellules restantes et sédimenter les cellules par centrifugation.Resuspendez la pastille dans un millilitre de PBS pour compter et centrifuger les cellules à nouveau. Resuspendez la pastille à une densité de quatre fois 10 à la septième cellule par millilitre de tampon de resuspension et ajoutez quatre fois 10 aux cinquièmes cellules à chaque tube de plasmide et de vecteur avec mélange doux. Placez un tube dans le dispositif d’électroporation et remplissez le tube de 3,5 millilitres de tampon électrolytique.Appuyez entièrement sur le piston pour insérer une pointe d’électrode plaquée or dans une pipette et mélanger délicatement le contenu du tube. Aspirez soigneusement les cellules avec une pipette et insérez la pipette dans la station d’électroporation jusqu’à ce qu’un bruit de cliquet soit entendu. Sélectionnez le protocole d’électroporation approprié pour les cellules épithéliales alvéolaires et appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile.Immédiatement après la transfection, retirer la pipette et transférer les cellules dans un puits de la plaque préchauffée de 12 puits. Lorsque toutes les cellules ont été électroporées et plaquées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, en remplaçant le supernatant dans chaque puits par un milieu complet avec des antibiotiques après deux jours. Le succès de la transfection peut être confirmé par l’expression de l’EGFP observée par microscopie de fluorescence ou cytométrie d’écoulement à l’aide d’un vecteur de contrôle.Pour inhiber la transcription du gène d’intérêt, 72 heures post-transfection remplacent le supernatant par un millilitre par puits de milieu complet complété par un microgramme par millilitre d’adoxycycline fraîchement préparée. Pour évaluer la demi-vie de l’ARNm du gène d’intérêt, retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire de 15 minutes à six heures. Laver un puits avec un millilitre de PBS glacé avant de lyser les cellules avec 500 microlitres de tampon de lyse à partir d’un kit d’extraction d’ARN chloroforme phénoforme disponible dans le commerce et secouant doucement à chaque point de temps expérimental.Ensuite, isolez l’ARN selon les instructions du kit et déterminez le rendement et la pureté de l’ARN par spectrophotométrie à 230, 260 et 280 nanomètres. Pour déterminer la stabilité de l’ARN isolé, traitez d’abord un microgramme de l’ARN total de chaque échantillon avec RNase libre DNase un pour enlever toutes les traces d’ADN plasmide. Utilisez un kit de synthèse cDNA disponible dans le commerce avec un mélange d’amorce oligo dT et d’amorce aléatoire d’hexomer pour améliorer l’efficacité de transcription inverse pour transcrire l’ARN total épuisé d’ADN en CDNA selon les instructions du fabricant.Ajouter 180 microlitres d’eau de qualité biologie moléculaire aux 20 microlitres du mélange de réaction pour diluer la réaction de l’ADNC à une concentration de cinq nanogrammes par microlitre et diluer immédiatement le mélange d’ADNC avec de l’eau de qualité biologie moléculaire fraîche pour atteindre une concentration de 1,25 nanogramme par microlitre. Combinez cinq microlitres de mélange maître de teinture cyber verte avec 0,1 microlitre d’eau de qualité biologie moléculaire, 0,45 microlitres de 7,5 micromolaires d’amorce avant, 0,45 microlitres de 7,5 micromolaires d’amorce inverse, et quatre microlitres de 1,25 nanogramme par microlitre de cDNA pour obtenir un volume de réaction total de 10 microlitres. Placez les échantillons dans un thermocycleur qPCR et amplifiez le gène d’intérêt de l’étiquette V5 et les amplicons d’avance de transactivateur de tetrocycline utilisant les conditions qPCR comme indiqué et générez une courbe de fusion à haute résolution pour évaluer les températures de fusion spécifiques des amplicons désirés et pour assurer l’absence de pics amplicons sonores.Cette technique d’électroporation pipette facilite un taux d’efficacité de transfection de 25 à 30 %, tel qu’observé par les ratios de cellules EGFP détectés par microscopie de fluorescence et cytométrie d’écoulement. Le traitement des cellules épithéliales alvéolaires avec un microgramme par millilitre de doxycycline n’a aucun impact significatif sur l’expression de l’ARNm alpha endogène d’ENaC à n’importe quel moment pendant la période de traitement. À l’aide d’un système d’expression plasmide contrôlé transcriptionnellement tel que démontré, le signal V5 alpha ENaC pourrait être normalisé selon le signal avancé du transactivateur tétracycline pour déterminer l’efficacité de la transfection à l’aide de la méthode du cycle de quantification du double delta.La demi-vie de l’ARNm alpha ENaC est jusqu’à sept fois plus courte en présence de la tétracycline hors système qu’en présence d’actinomycine D, confirmant que l’actinomycine D conduit à une stabilisation de l’ARN mnaC alpha artefactual. En outre, le cyclohexamide et le traitement alpha de facteur de nécrose de tumeur ont sensiblement diminué la stabilité de la transcription tandis que les lipopolysaccharides ne font pas. Des changements significatifs dans la modulation de la stabilité de l’ARNm V5 alpha ENaC peuvent être induits en fonction des régions supprimées et incluses des trois principales régions non traduites.En outre, la surexction de protéines liant l’ARN spécifique diminue la stabilité de l’ARNm 5-alpha ENaC par rapport à la transfection avec un plasmide vide pcDNA trois. Cet outil sera utile pour interroger de nouvelles idées sur la régulation post-transcriptionnelle des gènes clés impliqués dans la fonction de l’épithélium alvéolaire et leurs conditions physiologiques ou pathologiques.

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