Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Francis Migneault wurde durch ein Stipendium des Quebec Respiratory Health Network und des Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Lungentrainingsprogramms, ein Studium der FRSQ und ein Studentenwerk der Faculté des études Supérieures et unterstützt. Postdoktoranden, Université de Montréal. Diese Arbeit wurde vom Gosselin-Lamarre-Lehrstuhl für klinische Forschung und den Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544] unterstützt.

Alle tierischen Eingriffe wurden nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und vom Institutional Animal Care Committee des Research Center of Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) genehmigt.
1. Entwurf und Generierung des Antwortplasmids, das das Gen von Interesse ausdrückt (GOI)
<ol><li>Verwenden Sie einen induzierbaren Tetracyclin-Off-Vektor, z. B. pTRE-Tight.</li>
	<li>Analysieren Sie die Reihenfolge der GOI und der Multiple-Klon-Site (MCS...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. 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E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

Die niedrige Transfektionsrate von Alveolarenepithelzellen in der Primärkultur war eine ernsthafte Einschränkung für die Verwendung des Tet-Off-Systems zur Beurteilung der mRNA-Stabilität in diesen Zellen. Diese Einschränkung wurde jedoch durch die Pipettenelektroporation überwunden, die eine Transfektionseffizienz von 25-30 % ermöglichte (Abbildung 1 und Abbildung 3)26.
Die Messung der Transkriptstabili...

Mehrere Techniken wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNAs zu bestimmen. Die Puls-Chase-Zerfallstechnik, die markierte mRNAs verwendet, ermöglicht die gleichzeitige Auswertung eines großen Pools von mRNAs mit minimaler zellulärer Störung. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine direkte Schätzung der Halbwertszeit eines einzelnen Gentranskripts und kann nicht implementiert werden, um die posttranskriptionelle Modulation einer mRNA nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren, ROS, Alarminen oder Entzündungen zu untersuchen1.
Die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, wie Actinomycin D und Amanitin, ist eine relativ einfache Methode zur Messung der mRNA-Abbaukinetik im Laufe der Zeit. Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber früheren Techniken (d. h. Pulse-Chase) beruht auf der Fähigkeit, die Halbwertszeit eines bestimmten Transkripts direkt abzuschätzen und zu vergleichen, wie verschiedene Behandlungen seine Abbaukinetik beeinflussen könnten. Die signifikante schädliche Wirkung von Transkriptionsinhibitoren auf die Zellphysiologie stellt jedoch einen großen Nachteil des Ansatzes2dar. Tatsächlich hat die Hemmung des gesamten Zelltranskriptoms mit diesen Medikamenten die negative Nebenwirkung, die Synthese von Schlüsselelementen, die an der mRNA-Stabilität beteiligt sind, wie z. B. microRNAs (miRNAs), sowie die Expression und Synthese von RNA-bindenden Proteinen, die für den mRNA-Abbau und die Stabilität wichtig sind, zu stören. Die starke Störung der Gentranskription durch diese Medikamente könnte daher die Abbaukurven von Transkripten arteffakt verändern.
Das Promotor-Induktionssystem stellt einen dritten Ansatz zur Messung der Halbwertszeit einer bestimmten mRNA dar. Diese Methode misst den Abbau einer spezifischen mRNA in ähnlicher Weise wie Methoden, die Transkriptionsinhibitoren verwenden. Häufig kommen zwei Arten von Induktionssystemen zum Einsatz: der seruminduzierte c-fos-Promoter3 und das Tet-Off Induzierbare System4. Mit dem c-fos-System ist die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, die toxisch für die Zelle sein können, nicht erforderlich. Diese Methode erfordert jedoch eine Zellzyklussynchronisierung, die die Auswertung der tatsächlichen Stabilität eines Transkripts während der Interphase5verhindert. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Tet-Off-System die starke Expression des Gens von Interesse (GOI) unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors. Dieses System erfordert das Vorhandensein von zwei Elementen, die in die Zelle kotransfiziert werden müssen, um funktionsfähig zu sein. Das erste Plasmid (pTet-Off) drückt das regulatorische Protein tTA-Adv aus, einen hybriden synthetischen Transkriptionsfaktor, der aus dem prokaryotischen Repressor TetR (aus Escherichia coli) besteht, das zu drei Transkriptionstransaktivierungsdomänen aus dem viralen Protein HSV VP16 verschmolzen ist. Die GOI wird unter der Kontrolle eines synthetischen Promotors (PTight) in das pTRE-Tight-Plasmid geklont, das die minimale Sequenz des Cytomegalievirus-Promotors (CMV) umfasst, die zu sieben Wiederholungen der tetO-Operatorsequenz verschmolzen ist. Die Transkription des Gens flussabwärts von PTight ist abhängig von der Wechselwirkung von TetR mit tetO. In Gegenwart von Tetracyclin oder seinem Derivat Doxycyclin verliert der TetR-Repressor seine Affinität zum tetO-Operator, was zu einer Einstellung der Transkription4führt. Die Eigenschaften des Tet-Off-Systems machen es zu einem idealen Modell für die Untersuchung der spezifischen mRNA-Expression in eukaryotischen Zellen unter Vermeidung potenzieller pleiottroper Effekte, die sekundär zum Fehlen prokaryotischer regulatorischer Sequenzen in der eukaryotischen Zelle6sind. Normalerweise werden doppelt stabile Tet-Off-Zelllinien (HEK 293, HeLa und PC12) mit diesem System verwendet, um Kopien des Reglers und Reaktionsplasmide für einen bequemen Zugriff auf die kontrollierbare Genexpression7,8,9zu integrieren.
Mehrere Modelle von Alveolar-Epithelzellen in der Kultur wurden verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolarenepithels zu untersuchen. Seit Jahren nutzen Forscher ausgiebig menschliche oder Nagetier-Primärzellen10,11 sowie verewigte Zelllinien wie menschliche A549- oder Ratten-RLE-6TN-Zellen12,13. Obwohl sie im Allgemeinen weniger proliferativ und schwieriger zu kultur- und transfektionsmittel sind, bleiben Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur der Goldstandard für die Untersuchung der Funktion und Dysfunktion des Alveolarers epithel unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Tatsächlich weisen verewigte Zelllinien wie A549-Zellen nicht die komplexen Eigenschaften und Phänotypen von Primärzellen auf, während alveolare Epithelzellen in der Primärkultur die Haupteigenschaften des Alveolarenepithels rekapitulieren, insbesondere die Fähigkeit, eine polarisierte und enge Barriere14,15zu bilden. Leider sind diese Zellen sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken, wie diejenigen, die Liposomen verwenden, was den Einsatz eines Promotor-induzierten Systems wie Tet-Off sehr schwierig macht.
Die posttranskriptionelle Modulation von mRNAs ist eine der effektivsten Methoden zur schnellen Modulation der Genexpression eines Transkripts16. Die mRNA 3' unübersetzte Region (3' UTR) spielt in diesem Mechanismus eine wichtige Rolle. Es hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zur 5' UTR eine exponentielle Korrelation zwischen der Länge der 3' UTR und den zellulären und morphologischen Komplexitäten eines Organismus besteht. Diese Korrelation legt nahe, dass die 3' UTR, wie die mRNA-Codierungsregionen, einer natürlichen Selektion unterzogen wurde, um eine immer komplexere posttranskriptive Modulation während der gesamten Evolution17zu ermöglichen. Die 3' UTR enthält mehrere Bindungsstellen für Proteine und miRNAs, die die Stabilität und Übersetzung des Transkripts beeinflussen.
In der vorliegenden Arbeit haben wir ein Werkzeug entwickelt, um die Rolle hochkonservierter Domänen in der 3' UTR einer GOI zur Kontrolle der Transkriptstabilität zu untersuchen. Wir konzentrierten uns auf den epithelialen Natriumkanal, die Alpha-Untereinheit (ENaC), die eine Schlüsselrolle in der alveolar epithelialen Physiologie18spielt. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden erfolgreich transfiziert mit den beiden Komponenten des Tet-Off-Systems transfiziert, was die Untersuchung der Rolle der 3' UTR in der mRNA-Stabilität mit einem System ermöglicht, das die Zellphysiologie und den Stoffwechsel im Vergleich zur Verwendung von Transkriptionsinhibitoren mit anderen Protokollen minimal beeinflusst. Es wurde eine Klonstrategie entwickelt, um die Expression der goI von der des endogenen Gens unter Verwendung eines nicht endogen exprimierten Epitops (V5) zu unterscheiden. Die Reaktions- und regulatorischen Plasmide wurden dann mit hilfe einer Pipettenelektroporationstechnik in Alveolar-Epithelzellen übertragen. Anschließend wurde die Expression des Transkripts durch Inkubation der Zellen mit Doxycyclin in unterschiedlichen Zeitintervallen gemessen. Die Halbwertszeit des Transkripts wurde von RT-qPCR mit einer modifizierten Cq-Methode unter Verwendung des transfizierten tTA-Ad mRNA-Produkts zur Normalisierung bewertet. Durch unser Protokoll bieten wir eine bequeme Möglichkeit, die posttranskriptionelle Modulation eines Transkripts unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen und die Einbeziehung der nicht übersetzten Regionen genauer zu definieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

Das Studium der posttranskriptionalen Regulation ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Modulation einer gegebenen Boten-RNA (mRNA) und ihrer Auswirkungen auf die Zellhomöostase und den Stoffwechsel. Tatsächlich könnten Schwankungen des Transkriptsausdrucks die Übersetzungseffizienz und letztlich die zelluläre Aktivität eines Transkripts verändern. Mehrere experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNA zu untersuchen, obwohl einige dieser Methoden Einschränkungen haben, die die ordnungsgemäße Untersuchung der posttranskriptiellen Modulation verhindern. Ein Promotor-Induktionssystem kann ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors ausdrücken. Diese Methode ermöglicht die Halbwertszeitschätzung einer gegebenen mRNA unter jeder experimentellen Bedingung ohne störende Zellhomöostase. Ein großer Nachteil dieser Methode ist die Notwendigkeit, Zellen zu transfekten, was den Einsatz dieser Technik in isolierten Primärzellen einschränkt, die sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken sind. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden ausgiebig verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolar-Epithels zu untersuchen. Die einzigartigen Eigenschaften und der Phänotyp der primären Alveolarzellen machen es wichtig, die posttranskriptionalen Modulationen von Genen zu untersuchen, die für diese Zellen von Interesse sind. Daher war es unser Ziel, ein neuartiges Werkzeug zu entwickeln, um die posttranskriptionischen Modulationen von mRNAs von Interesse in alveolar epitheliaalen Zellen in der Primärkultur zu untersuchen. Wir haben ein schnelles und effizientes transientes Transfektionsprotokoll entwickelt, um ein transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem in primäre Alveolar-Epithelzellen einzufügen. Diese Klonstrategie, die ein virales Epitop verwendet, um das Konstrukt zu markieren, ermöglicht die einfache Diskriminierung des Konstruktausdrucks von der von endogenen mRNAs. Mit der modifizierten Methode des Quantifizierungszyklus (Cq) kann die Expression des Transkripts dann in verschiedenen Zeitintervallen quantifiziert werden, um seine Halbwertszeit zu messen. Unsere Daten zeigen die Effizienz dieses neuartigen Ansatzes bei der Untersuchung der posttranskriptionalen Regulation unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen in primären Alveolarepithelzellen.

Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um ein Tet-Off-Transkriptions-Expressionssystem zu generieren, um die Bedeutung verschiedener Teile des UTR von ENaC 3 für die Modulation der Transkriptstabilität in primären Alveolar-Epithelzellen zu bewerten.
Der erste Schritt bei der Implementierung dieses Systems bestand darin, eine schnelle, einfache und effiziente Transfektionstechnik für alveolare Epithelzellen in der Prim...

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Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Hier stellen wir ein Werkzeug vor, mit dem die posttranskriptionische Modulation eines Transkripts in primären Alveolarepithelzellen mithilfe eines induzierbaren Expressionssystems, das an eine Pipettenelektroporationstechnik gekoppelt ist, untersucht werden kann.

Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

So ermöglicht unser Modell die Untersuchung der post-transkriptionellen Modulation eines bestimmten Transkripts in alveolar epitheliale Zellen in der Primärkultur und ihre physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Die transiente Transfektion von primären alveolären Epithelzellen hat also nur minimale Auswirkungen auf die Zellphysiologie und den Stoffwechsel, was einen klaren Vorteil gegenüber klassischen Protokollen mit Transkriptionsinhibitoren darstellt. Für die Erzeugung eines Antwortplasmids, das ein Gen von Interesse ausdrückt, müssen die Sequenz des Gens und die mehrfachen Klonstellen des induzierbaren Vektors analysiert werden, um die Erkennungssequenzen in den mehreren Klonstellen zu identifizieren, die intern im Gen nicht vorhanden sind.Mit High-Fidelity-Taq-Polymerase und Standard-ÜberlappungPCR-Techniken, flankieren Sie das Gen von Interesse mit zwei ausgewählten Restriktions-Enzym-Erkennungsstellen mit Designer-Primern. Eine Sequenz bei der Codierung des V5-Epitops vor dem Gen von Interesse muss enthalten sein, um die Expression des transfizierten Gens von der endogenen Expression zu unterscheiden. Mutanten können durch sequenzielles Löschen erzeugt werden, um die Auswirkungen verschiedener drei erlesener Hauptregionen auf die Stabilität der mRNA des Gens mithilfe von Reverse Primern zu untersuchen, die eine Polyadenylierungsstelle kodieren, die nach und nach das drei Primendedes der nicht übersetzten Region löscht.Letztlich kann die Einfügung des Gens von Interesse durch Eine Restriktionsanalyse bestätigt werden. Die Genorientierung und das Fehlen von Mutationen, die möglicherweise während der rtPCR eingeführt werden, können durch Sequenzierung bestätigt werden. Für die Transfektion der primären Rattenlunge Typ zwei Alveolar Epithelzellen, Samen der Zellen bei einem mal 10 bis sechs Zentimeter pro Quadratzentimeter in 100 Millimeter Petrischalen in Gegenwart von vollständigen minimalen essentiellen Medium.Kultur für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Am nächsten Tag 500 Mikroliter komplettes Medium ohne Antibiotikum in jeden Brunnen einer neuen 12-Brunnenplatte geben und die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius vorwärmen. Während dieser Inkubation fügen Sie ein Mikrogramm des Reaktionsplasmids und ein Mikrogramm regulatorischen Vektors zu einem 1,5 Milliliter-Rohr pro Brunnen hinzu.Waschen Sie die Alveolar-Epithelzellen mit 10 Millilitern pro Brunnen von 37 Grad Celsius PBS ohne Kalzium oder Magnesium und behandeln Sie die Zellen mit fünf Millilitern pro Brunnen von 37 Grad Celsius 0,05%Trypsin für zwei bis vier Minuten im Zellkultur-Inkubator. Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern pro Brunnen des kompletten Mediums ohne Antibiotikum und sammeln Sie die Zellen in einer neuen 50-Milliliter-Röhre. Waschen Sie die Schale mit vier Milliliterfrischem Medium, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren.Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS für das Zählen und Zentrifugieren der Zellen wieder aus. Setzen Sie das Pellet mit einer Dichte von viermal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter Resuspensionspuffer aus und fügen Sie den fünften Zellen mit sanfter Mischung viermal 10 zu den fünften Zellen hinzu. Legen Sie ein Rohr in die Elektroporationsvorrichtung und füllen Sie das Rohr mit 3,5 Milliliter elektrolytischen Puffer.Drücken Sie den Kolben vollständig, um eine vergoldete Elektrodenspitze in eine Pipette einzufügen, und mischen Sie den Rohrinhalt vorsichtig. Die Zellen vorsichtig mit einer Pipette ansaugen und die Pipette in die Elektroporationsstation einlegen, bis ein Klickton ertönt. Wählen Sie das entsprechende Elektroporationsprotokoll für Alveolar-Epithelzellen aus und drücken Sie Start auf dem Touchscreen.Unmittelbar nach der Transfektion die Pipette entfernen und die Zellen in einen Brunnen der vorgewärmten 12 Brunnenplatte übertragen. Wenn alle Zellen elektropoiert und plattiert wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen durch ein komplettes Medium mit Antibiotika nach zwei Tagen. Der Erfolg der Transfektion kann durch die Expression von EGFP bestätigt werden, wie sie durch Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie mit einem Kontrollvektor beobachtet wird.Um die Transkription des Gens von Interesse zu hemmen, ersetzen 72 Stunden nach der Transfektion den Überstand durch einen Milliliter pro Brunnen des kompletten Mediums, ergänzt durch ein Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetes Addoxycyclin. Um die mRNA-Halbwertszeit des gens von Interesse zu bewerten, geben Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator von 15 Minuten bis sechs Stunden zurück. Waschen Sie einen gut mit einem Milliliter eiskaltes PBS, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikroliter Lysepuffer aus einem handelsüblichen Phenolchlorform-RNA-Extraktionskit und sanftem Schütteln zu jedem experimentellen Zeitpunkt lysieren.Isolieren Sie dann die RNA gemäß den Kit-Anweisungen und bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 Nanometern. Um die Stabilität der isolierten RNA zu bestimmen, behandeln Sie zunächst ein Mikrogramm der gesamten RNA aus jeder Probe mit RNase freier DNase, um alle Plasmid-DNA-Spuren zu entfernen. Verwenden Sie ein handelsübliches cDNA-Synthesekit mit einer Mischung aus Oligo dT und zufälligen Hexomer-Primern, um die Reverse-Transkriptionseffizienz zu verbessern, um die DNA-erschöpfte Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA umzuschreiben.Fügen Sie 180 Mikroliter molekularbiologisches Wasser zu den 20 Mikrolitern des Reaktionsmixes hinzu, um die cDNA-Reaktion bei einer Konzentration von fünf Nanogramm pro Mikroliter zu verdünnen und sofort den cDNA-Mix mit frischem molekularbiologischem Wasser zu verdünnen, um eine Konzentration von 1,25 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Kombinieren Sie fünf Mikroliter Cyber-Grünfarbstoff-Master-Mix mit 0,1 Mikroliter molekularbiologischem Wasser, 0,45 Mikroliter 7,5 Mikromolchen-Vorwärtsgrundierung, 0,45 Mikroliter 7,5 Mikromol-Reverse-Primer und vier Mikroliter 1,25 Nanogramm pro Mikroliter cDNA, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 Mikrolitern zu erhalten. Legen Sie die Proben in einen qPCR-Thermocycler und verstärken Sie das V5-Tag-Gen von Interesse und Tetrocyclin-Transaktivator-Advance-Amplicons unter Verwendung der angegebenen qPCR-Bedingungen und erzeugen Sie eine hochauflösende Schmelzkurve, um die spezifischen Schmelztemperaturen der gewünschten Amplicons zu bewerten und das Fehlen von Rauschamplikonspitzen zu gewährleisten.Diese Pipettenelektroporationstechnik ermöglicht eine Transfektionseffizienz rate von 25 bis 30%, wie sie anhand der durch Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesenen Verhältnisse von EGFP-Zellen beobachtet wird. Die Behandlung von Alveolar-Epithelzellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin hat keinen signifikanten Einfluss auf die Expression endogener Alpha-ENaC-mRNA zu irgendeinem Zeitpunkt während des Behandlungszeitraums. Mit Hilfe eines transkriptionsgesteuerten Plasmidexpressionssystems, wie gezeigt, konnte das V5 alpha ENaC-Signal gemäß dem fortgeschrittenen Tetracyclin-Transaktivator normalisiert werden, um die Effizienz der Transfektion mit der Methode des doppelten Delta-Quantifizierungszyklus zu bestimmen.Die Halbwertszeit von alpha ENaC mRNA ist in Gegenwart des Tetracyclin-Off-Systems bis zu siebenmal kürzer als in Gegenwart von Actinomycin D, was bestätigt, dass Actinomycin D zu einer artefaktischen Alpha-ENaC-mRNA-Stabilisierung führt. Darüber hinaus verringerte die Cyclohexamid- und Tumornekrosefaktor-Alpha-Behandlung die Stabilität des Transkripts signifikant, während Lipopolysaccharide dies nicht tun. Signifikante Veränderungen in der Modulation der V5 alpha ENaC mRNA-Stabilität können in Abhängigkeit von den gelöschten und eingeschlossenen Regionen der drei wichtigsten unübersetzten Regionen induziert werden.Darüber hinaus verringert die Überexpression spezifischer RNA-bindender Proteine die Stabilität von 5-alpha ENaC mRNA im Vergleich zur Transfektion mit einem leeren pcDNA-Drei-Plasmid. Dieses Tool wird nützlich sein, um neue Erkenntnisse über die posttranskriptionelle Regulation von Schlüsselgenen, die in die Funktion des Alveolarepithels und deren physiologische oder pathologische Bedingungen involviert sind, zu hinterfragen.

Research

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JoVE Core

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Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

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Genetik

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Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

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Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

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