Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

פרנסיס מיגס נתמך על ידי מלגת שסופקו על-ידי רשת בריאות הנשימה של קוויבק והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), תוכנית הכשרה לריאות של המכון הימי, מסעדת FRSQ ו-"משלוח של המוני המוני". . הפוסטדואלס, אוניברסיטת מונטריאול עבודה זו נתמכת על ידי כיסא הגוסליס-למררה במחקר קליני והמוסדות הקנדים לחקר הבריאות [במגב-79544].

כל ההליכים בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול המוסדי בעלי חיים של מרכז המחקר של מרכז אשפוז באוניברסיטת מונטריאול (CRCHUM).
1. עיצוב והדור של התגובה הפלבמיד לבטא את גן העניין (הארה)
<ol><li>השתמש וקטור inducible טטרציקלין-off, כגון p...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

שיעור הגידול הנמוך של מכתשי תאים אפיתל בתרבות העיקרית כבר מגבלה רצינית לשימוש מערכת ט-Off כדי להעריך את יציבות mRNA בתאים אלה. עם זאת, מגבלה זו היתה להתגבר על ידי הפיפטה אלקטרופורציה, המאפשר 25-30% יעילות הזיהום (איור 1 ואיור 3)26.
המדידה ?...

מספר טכניקות פותחו כדי לקבוע את מחצית החיים של mRNAs. טכניקת ריקבון הדופק מרדף, אשר משתמשת mRNAs, מאפשר הערכה סימולטני של בריכה גדולה של mRNAs עם הפרעה תאית מינימלית. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת הערכה ישירה של מחצית החיים של תעתיק גן יחיד ולא ניתן ליישם כדי ללמוד את אפנון הפוסטסקריפט של מערכת הגירוי הבאה של mRNA עם גורמי גדילה, ROS, מדאיג, או דלקת1.
השימוש במעכבי תעתיק, כגון אקטינומיצין D ו-α-אמטין, היא שיטה פשוטה יחסית למדידת קינטיקה של השפלה mRNA לאורך זמן. אחד היתרונות העיקריים של גישה זו על זה של טכניקות קודמות, (כלומר, דופק-מרדף) מסתמך על היכולת להעריך במישרין את מחצית החיים של תעתיק נתון ולהשוות איך טיפולים שונים יכול להשפיע על הקינטיקה השפלה שלה. עם זאת, ההשפעה המשמעותית משמעותית של מעכבי התעתיק על הפיזיולוגיה של התא מייצגת חיסרון משמעותי של הגישה2. אכן, עיכוב של התא כולו ההמרה עם תרופות אלה יש תופעת לוואי שלילית של perturbing את הסינתזה של אלמנטים מרכזיים המעורבים ביציבות mRNA, כגון microRNAs (miRNAs), כמו גם את הביטוי וסינתזה של חלבונים כריכת RNA, אשר חשובים עבור השפלה ויציבות mRNA. ההפרעות החמורות של תמלול הגנים על-ידי תרופות אלו עלולות לשנות את עקומות ההשפלה של התעתיקים.
מערכת אינדוקציה היזם מייצג גישה שלישית כדי למדוד את מחצית החיים של mRNA ספציפי. שיטה זו מודדת את ההשפלה של mRNA ספציפי באופן דומה לשיטות המשתמשות במעכבי תעתיק. שני סוגים של מערכות אינדוקציה משמשים לעתים קרובות: סרום המושרה c-fos אמרגן3 ואת מערכת inducible Off4. עם מערכת c-fos, השימוש מעכבי שעתוק כי יכול להיות רעיל לתא אין צורך. עם זאת, שיטה זו מחייבת סנכרון של מחזור התא, המונע את הערכת היציבות בפועל של תעתיק במהלך השלב הפנימי5. לעומת זאת, מערכת ט-Off מאפשרת ביטוי חזק של גן העניין (הארה) תחת השליטה של מקדם מוסדר טטרציקלין מוסדרים. מערכת זו מחייבת נוכחות של שני רכיבים שחייבים להיות מזוהמים בתא כדי להיות פונקציונלי. באמצע הפלסטיק הראשון (pTet-Off) מבטא את החלבון הרגולטורי tTA-עו"ד, מקדם שעתוק סינתטי היברידית מורכב של prokaryotic מדיכוי TetR (מ Es, האננכיה coli) התמזגו שלושה תחומים ההפעלה הפעלה של חלבון ויראלי HSV VP16. הגוי משוכפל לתוך pTRE-צר באמצע תחת שליטה של מיזם סינתטי (Pהדוק), הכולל את הרצף המינימלי של cytomegalovirus (cmv) יזם התמזגו שבעה חוזר של רצף המפעיל teto. תמלול של הגן במורד של Pהדוק תלוי באינטראקציה של tetr עם tetr. בנוכחותו של טטרציקלין או הנגזרת שלה, דוקסיציקלין, מאבדת מחדש את הזיקה שלה למפעיל Tetr, המוביל להפסקת שעתוק4. המאפיינים של מערכת ט-Off להפוך אותו למודל אידיאלי למחקר של ביטוי mrna ספציפי בתאי איקריוטית תוך הימנעות השפעות pleiotropic פוטנציאלי משני העדר רצפים prokaryotic הרגולציה בתא איקריוטית6. בדרך כלל, שורות התאים היציבים כפליים (hek 293, הלה וPC12) משמשות עם מערכת זו כדי לשלב עותקים של הרגולטור והתגובה של פלמידים עבור גישה נוחה לביטוי גנטי בשליטה7,8,9.
מספר דגמים של תאים אפיתל מכתשיים בתרבות שימשו כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. במשך שנים, החוקרים מנוצל באופן נרחב בתאים אנושיים או מכרסמים הראשי10,11 , כמו גם קווים מונצח תאים כגון A549 אנושי או עכברוש rle-6tn תאים12,13. למרות שהם בדרך כלל פחות מתרבים וקשה יותר לתרבות לבין transfect, מכתשיים תאי האפיתל בתרבות הראשית להישאר בתקן הזהב למחקר של תפקוד ותפקוד של האפיתל מכתשי בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. אכן, שורות תא מונדמות כגון תאים A549 לא מציגים את המאפיינים המורכבים ופנוטיפים של תאים ראשוניים, ואילו מכתשיים תאי אפיתל בתרבות העיקרית לאחר מכן את המאפיינים העיקריים של האפיתל מכתשי, במיוחד את היכולת ליצור מחסום מקוטב והדוק14,15. למרבה הצער, תאים אלה עמידים מאוד טכניקות החצייה המקובלת, כגון אלה ניצול ליפוזומים, מה שהופך את השימוש של היזם המושרה מערכת כגון ט-Off מאוד קשה.
אפנון הפוסטסקריפט של mRNAs היא אחת השיטות האפקטיביות ביותר למודוללי במהירות את ביטוי הגנים של תעתיק16. אזור ה-mRNA 3 ' בלתי מתורגם ' (3 ' UTR) ממלא תפקיד חשוב במנגנון זה. זה הוכח כי, בניגוד ל 5 ' UTR, יש קורלציה אקספוננציאלית בין אורך של 3 ' UTR ואת המורכבות הסלולר ו מורפולוגית של אורגניזם. מתאם זה מרמז כי 3 ' UTR, כמו אזורי קידוד mRNA, כבר נתון בחירה טבעית כדי לאפשר אפנון מורכב יותר ויותר של הפוסטסקריפט במהלך האבולוציה17. 3 ' UTR מכיל מספר אתרים מחייבים עבור חלבונים ו miRNAs המשפיעים על היציבות והתרגום של התעתיק.
בעבודה הנוכחית, פיתחנו כלי כדי לחקור את התפקיד של תחומים שמרו במידה רבה ב-3 ' UTR של הגוי על שליטה של התעתיק. התמקדנו בערוץ נתרן האפיתל, יחידת יחידת (αENaC), אשר ממלאת תפקיד מפתח בבית מכתשי הפיזיולוגיה האפיתל18. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית היו בהצלחה משני הצדדים עם שני המרכיבים של מערכת ט-Off, אשר מאפשר ללמוד את התפקיד של 3 ' UTR ביציבות mRNA עם מערכת כי המינימלי משפיע הפיזיולוגיה של התא ואת חילוף החומרים בהשוואה לשימוש של מעכבי שעתוק עם פרוטוקולים אחרים. אסטרטגיית שיבוט פותחה כדי להבדיל את הביטוי של הגוי מתוך הגן האנדוסוגגני באמצעות אפירופה בלתי מפותח (V5). התגובה והפלמידים של התקנות הועברו לאחר מכן לתוך מכתשיים תאי האפיתל באמצעות טכניקת פיפורציה חשמלית. לאחר מכן, הביטוי של התעתיק נמדד על-ידי דגירה של התאים עם דוקסיציקלין במרווחי זמן שונים. מחצית החיים של התמליל הוערך על-ידי RT-qPCR עם שיטת Cq ששונתה באמצעות מוצר העברה של טה-אד mRNA לנורמליזציה. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה ללימוד האפנון הפוסט-ממדי של תעתיק בתנאים שונים והגדרת המעורבות של האזורים הבלתי מתורגמים ביתר פירוט.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

לימוד הרגולציה הפוסט-טראומטית הוא יסוד להבנת האפנון של שליח מסוים RNA (mRNA) והשפעתה על הומאוסטזיס התאים וחילוף החומרים. ואכן, תנודות הביטוי בתעתיק יכולות לשנות את יעילות התרגום ולבסוף את הפעילות התאית של תעתיק. כמה גישות ניסיוני פותחו כדי לחקור את מחצית החיים של mRNA למרות חלק מהשיטות הללו יש מגבלות המונעות את המחקר הנכון של אפנון הפוסטסקריפט. מערכת השראה היזם יכול לבטא גן של עניין תחת השליטה של מיזם סינתטי מוסדר טטרציקלין. שיטה זו מאפשרת שערוך מחצית חיים של mRNA נתון תחת כל מצב ניסיוני ללא מטריד הומאוסטזיס התא. חיסרון משמעותי אחד של שיטה זו הוא הצורך בתאי העברה, אשר מגביל את השימוש בטכניקה זו בתאים ראשוניים מבודדים העמידים מאוד בפני טכניקות העברה קונבנציונליות. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית שימשו בהרחבה כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. המאפיינים הייחודיים והפנוטיפים של תאי הכתשיים הראשוניים הופכים אותו לחיוני לחקר מודולרופהפוסט של גנים המעניינים בתאים אלה. לכן, המטרה שלנו הייתה לפתח כלי הרומן כדי לחקור את מודולונות הפוסט של mRNAs של עניין בתאי האפיתל מכתשיים בתרבות הראשית. עיצבנו פרוטוקול מהיר ויעיל של הזיהום החולף כדי להכניס מערכת הבעה מבוקרת בשיטת פלססקריפט לתאי האפיתל הראשוניים. אסטרטגיית שיבוט זו, המשתמשת באפירופה ויראלית כדי לתייג את המבנה, מאפשרת את האפליה הקלה של בניית הביטוי מתוך זה של mRNAs האנדוגניים. באמצעות מחזור ΔΔ שונה (Cq) שיטה, ביטוי התמליל יכול להיות כימות במרווחי זמן שונים כדי למדוד את מחצית החיים שלו. הנתונים שלנו להפגין את היעילות של הגישה הרומן הזה בחקר הרגולציה הפוסט בתנאים שונים פתופסולוגית בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.

פרוטוקול זה נעשה שימוש בהצלחה כדי ליצור מערכת הבעה מבוקרת מבחינה מבצעית באמצעות פלסטלינה כדי להעריך את החשיבות של חלקים שונים של αENaC 3 ' UTR באפנון של יציבות תעתיק בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.
הצעד הראשון ביישום של מערכת זו היה ליצור טכניקת ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

כאן, אנו מציגים כלי שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את אפנון posttranscript של תעתיק בתאי אפיתל הראשי מכתשיים באמצעות מערכת ביטוי inducible בשילוב טכניקה אלקטרופורציה פיפטה.

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

אז המודל שלנו מאפשר מחקר של אפנון שלאחר שעתוק של תעתיק מסוים בתאי אפיתל מכתשי בתרבות הראשונית ואת התנאים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים שלהם. אז ההידור חולף של תאי אפיתל מכתשי ראשי יש השפעה מינימלית על פיזיולוגיה של התא ומטבוליזם, אשר מהווה יתרון ברור על פני פרוטוקולים קלאסיים באמצעות מעכבי שעתוק. עבור הדור של פלסמיד תגובה המבטא גן של עניין, רצף של הגן, ואתרי שיבוט מרובים של וקטור בלתי ניתן לעיכול יש לנתח כדי לזהות את רצפי הזיהוי באתרי שיבוט מרובים כי אינם נוכחים באופן פנימי בגן.באמצעות פולימראז taq נאמנות גבוהה וטכניקות PCR חפיפה סטנדרטיות, לאגף את הגן של עניין עם שני אתרי זיהוי אנזים הגבלה נבחרים באמצעות פריימרים מעצב. רצף בקידוד אפיטופ ה- V5 במעלה הזרם של גן העניין חייב להיכלל כדי להבחין בין הביטוי של הגן המומר לבין ביטוי אנדוגני. מוטנטים יכולים להיווצר על ידי מחיקה רציפה כדי לחקור את ההשפעות של שלושה אזורים שונים שאינם תרגום על היציבות של mRNA של הגן באמצעות פריימרים הפוכים קידוד אתר polyadenylation כי בהדרגה מוחק את הקצה העיקרי של האזור לא מתורגם.בסופו של דבר, הכנסת הגן של עניין יכול להיות מאושר על ידי ניתוח הגבלה. האוריינטציה הגנטית והיעדר מוטציות שעלולות להיות מוצגות במהלך rtPCR ניתן לאשר על ידי רצף. עבור transfection של סוג ריאה עכברוש ראשי שני תאי אפיתל מכתשית, לזרוע את התאים ב 1 פעמים 10 לתאים השישי לס"מ מרובע ב 100 מילימטר צלחות פטרי בנוכחות מדיום חיוני מינימלי מלא.תרבות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני עם לחות. למחרת, להוסיף 500 microliters של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה לכל באר של צלחת חדשה 12 גם לחמם מראש את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה הזו, הוסיפו מיקרוגרם אחד של פלסמיד התגובה ומיקרוגרם אחד של וקטור רגולטורי לצינור אחד של 1.5 מיליליטר ל באר.לשטוף את תאי האפיתל מכתב עם 10 מיליליטר ל הבאר של 37 מעלות צלזיוס PBS ללא סידן או מגנזיום ולטפל בתאים עם חמישה מיליליטר ל הבאר של 37 מעלות צלזיוס 0.05% טריפסין במשך שתיים עד ארבע דקות באינקובטור תרבות התא. כאשר התאים התנתקו, לנטרל את טריפסין עם 10 מיליליטר לתוך באר של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה ולאסוף את התאים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. לשטוף את המנה עם ארבעה מיליליטר של מדיום טרי כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ולשסות את התאים על ידי צנטריפוגה.תן שוב את גלולת במיליליטר אחד של PBS לספירה וצנטריפוגה של התאים שוב. תוסיפו את גלולת הכדור בצפיפות של ארבע כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר של מאגר ההתמשלות מחדש ותוסיפו ארבע כפול 10 לתאים החמישיים לכל צינור של פלסמיד וקטור עם ערבוב עדין. מניחים צינור אחד בהתקן האלקטרופוזיה וממלאים את הצינור ב-3.5 מיליליטר של חיץ אלקטרוליטי.יש לדכא לחלוטין את הבוכנה כדי להכניס קצה אלקטרודה מצופה זהב לתוך פיפטה ולערבב בעדינות את תכולת הצינור. בזהירות שאפו את התאים עם פיפטה והכניסו את הפיפט לתחנת האלקטרופולציה עד שנשמע צליל נקישה. בחר את פרוטוקול האלקטרופורציה המתאים עבור תאי אפיתל מכתב ולחץ על התחל במסך המגע.מיד לאחר transfection, להסיר את פיפטה ולהעביר את התאים לתוך באר אחת של צלחת 12 היטב מחומם מראש. כאשר כל התאים כבר electroporated וציפה, מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא, החלפת supernatant בכל באר עם מדיום שלם עם אנטיביוטיקה לאחר יומיים. ההצלחה של transfection יכול להיות מאושר על ידי הביטוי של EGFP כפי שנצפה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי או ציטומטריה זרימה באמצעות וקטור בקרה.כדי לעכב את שעתוק של הגן של עניין, 72 שעות לאחר transfection להחליף את supernatant עם מיליליטר אחד לכל באר של מדיום שלם בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של adoxycycline מוכן טרי. כדי להעריך את זמן מחצית החיים mRNA של הגן של עניין, להחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא מ 15 דקות עד שש שעות. שטיפת באר אחת עם מיליליטר אחד של קרח קר PBS לפני lysing התאים עם 500 microliters של חיץ תזה מערכת מיצוי RNA פנול כלורופורם זמין מסחרית ורעידות עדינות בכל נקודת זמן ניסיונית.לאחר מכן, לבודד את RNA על פי הוראות קיט ולקבוע את התשואה RNA וטוהר על ידי ספקטרופוטומטריה ב 230, 260, ו 280 ננומטר. כדי לקבוע את היציבות של RNA מבודד, ראשית לטפל מיקרוגרם אחד של RNA הכולל מכל מדגם עם RNase חינם DNase אחד כדי להסיר את כל עקבות DNA פלסמיד. השתמש בערכת סינתזת cDNA זמינה מסחרית עם תערובת של אוליגו dT פריימרים משושה אקראי כדי לשפר את יעילות שעתוק הפוך כדי להפוך לתמלל את ה- RNA הכולל מדולדל DNA לתוך cDNA על פי הוראות היצרן.הוסף 180 microliters של ביולוגיה מולקולרית כיתה מים 20 microliters של תערובת התגובה לדלל את תגובת cDNA בריכוז של חמישה ננוגרם למיקרוליטר מיד לדלל את תערובת cDNA עם ביולוגיה מולקולרית מולקולרית טרייה כיתה מים כדי להגיע 1.25 ננוגרם לריכוז microliter. שלב חמישה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר צבע ירוק סייבר עם 0.1 מיקרוליטר של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, 0.45 microliters של פריימר 7.5 מיקרומולרי קדימה, 0.45 microliters של 7.5 מיקרומולרים הפוך פריימר, וארבעה microliters של 1.25 ננוגרם למיקרוליטר של cDNA כדי לקבל תגובה כוללת של 10 מיקרוליטרים. מקם את הדגימות בתרמוציקלר qPCR והעצים את גן תג ה- V5 של עניין ו- tetrocycline transactivator מראש אמפליקונים באמצעות תנאי qPCR כפי שצוין וליצור עקומת התכה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך את טמפרטורות ההיתוך הספציפיות של האמפליקונים הרצויים ולהבטיח היעדר פסגות אמפליקון רעש.טכניקת אלקטרופוזיה זו מאפשרת קצב יעילות של 25 עד 30%transfection כפי שנצפה על ידי היחסים של תאי EGFP שזוהו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה. הטיפול בתאי אפיתל מכתב עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין אין השפעה משמעותית על הביטוי של אלפא ENaC mRNA אנדוגני בכל נקודת זמן במהלך תקופת הטיפול. באמצעות מערכת ביטוי פלסמיד מבוקרת שעתוק כפי שהודגם, אות V5 אלפא ENaC יכול להיות מנורמל על פי הטרציקלין transactivator אות מתקדם כדי לקבוע את היעילות של transfection באמצעות שיטת מחזור כימות דלתא כפולה.זמן מחצית החיים של אלפא ENaC mRNA הוא עד שבע פעמים קצר יותר בנוכחות טטרציקלין מחוץ למערכת מאשר בנוכחות actinomycin D, המאשר כי actinomycin D מוביל לייצוב mRNA אלפא ENaC חפץ. כמו כן, cyclohexamide וגידול נמק גורם אלפא טיפול ירד באופן משמעותי את היציבות של התמליל בעוד lipopolysaccharides לא. שינויים משמעותיים באפנן של יציבות MRNA אלפא ENaC V5 יכול להיות המושרה בהתאם לאזורים שנמחקו וכללו של שלושת האזורים לא תרגום הממשלה.בנוסף, ביטוי יתר של חלבונים קשירה RNA ספציפי מקטין את היציבות של 5-אלפא ENaC mRNA לעומת transfection עם pcDNA ריק שלוש פלסמיד. כלי זה יהיה שימושי עבור שאילתת תובנות חדשניות לתוך הרגולציה שלאחר שעתוק של גנים מרכזיים המעורבים לתוך הפונקציה של אפיתל מכתשי ואת התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים שלהם.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...