Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Francis Migneault è stato sostenuto da una borsa di studio fornita dal Quebec Respiratory Health Network e dal programma di formazione polmonare del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), da uno studente del FRSQ e da una borsa di studio della Faculté des'tudes Supérieures et Post-dottorato, Université de Montréal. Questo lavoro è stato sostenuto dalla cattedra Gosselin-Lamarre nella ricerca clinica e dai Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali del Centro di ricerca del Centro di Ricerca del Centro Ospedaliero de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Progettazione e generazione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI)
<ol><li>Utilizzare un vettore inducibile di tetraciclina, ad esempio pTRE-Tight.</li>
	<li>Analizzare la s...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

Il basso tasso di trasfezione delle cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria è stata una grave limitazione per l'uso del sistema Tet-Off per valutare la stabilità dell'mRNA in queste cellule. Tuttavia, questa limitazione è stata superata dall'elettroporazione delle pipette, consentendo un'efficienza di trasfezione del 25-30%(Figura 1 e Figura 3)26.
La misurazione della stabilità della trascrizion...

Sono state sviluppate diverse tecniche per determinare l'emivita degli mRNA. La tecnica di decadimento dell'impulso-chase, che utilizza mRNA etichettati, consente la valutazione simultanea di un grande pool di mRNA con disturbo cellulare minimo. Tuttavia, questo approccio non consente una stima diretta dell'emivita di una singola trascrizione genica e non può essere implementato per studiare la modulazione post-trascrizione di un mRNA in seguito alla stimolazione con fattori di crescita, ROS, alarmins o infiammazione1.
L'uso di inibitori della trascrizione, come l'actinomycin D e la z-amanitina, è un metodo relativamente semplice per misurare la cinetica da degradazione dell'mRNA nel tempo. Uno dei principali vantaggi di questo approccio rispetto a quello delle tecniche precedenti (cioè l'inseguimento a impulsi) si basa sulla capacità di stimare direttamente l'emivita di una determinata trascrizione e di confrontare il modo in cui i diversi trattamenti potrebbero influenzare la sua cinetica degradante. Tuttavia, il significativo impatto deleterio degli inibitori della trascrizione sulla fisiologia cellulare rappresenta un grave inconveniente dell'approccio2. Infatti, l'inibizione dell'intero trascrittoma cellulare con questi farmaci ha l'effetto collaterale negativo di perturare la sintesi di elementi chiave coinvolti nella stabilità dell'mRNA, come i microRNA (miRNA), nonché l'espressione e la sintesi delle proteine che legano l'RNA, che sono importanti per la degradazione e la stabilità dell'RNA. La grave perturbazione della trascrizione genica da parte di questi farmaci potrebbe quindi modificare artefatto le curve di degradazione delle trascrizioni.
Il sistema di induzione del promotore rappresenta un terzo approccio per misurare l'emivita di un mRNA specifico. Questo metodo misura la degradazione di un mRNA specifico in modo simile ai metodi che utilizzano inibitori della trascrizione. Vengono spesso utilizzati due tipi di sistemi di induzione: ilpromotore c-fos 3 indotto dal siero e il sistema inducibile Tet-Off4. Con il sistema c-fos, l'uso di inibitori della trascrizione che possono essere tossici per la cellula non è necessario. Tuttavia, questo metodo richiede la sincronizzazione del ciclo cellulare, che impedisce la valutazione della stabilità effettiva di una trascrizione durante l'interfase5. Al contrario, il sistema Tet-Off consente la forte espressione del gene di interesse (GOI) sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo sistema richiede la presenza di due elementi che devono essere cotrastati nella cellula per essere funzionale. Il primo plasmide (pTet-Off) esprime la proteina regolatrice tTA-Adv, un fattore di trascrizione sintetica ibrido composto dal repressore procatotico TetR (da Escherichia coli) fuso a tre domini di trasattivazione della trascrizione dalla proteina virale HSV VP16. Il GOI è clonato nel plasmidp pTRE-Tight sotto il controllo di un promotore sintetico (PTight), che comprende la sequenza minima del promotore di citomegalovirus (CMV) fuso a sette ripetizioni della sequenza dell'operatore tetO. La trascrizione del gene a valle di PTight dipende dall'interazione di TetR con il tetO. In presenza di tetraciclina o della sua derivata, doxycycline, il repressore TetR perde la sua affinità per l'operatore tetO, portando ad una cessazione della trascrizione4. Le caratteristiche del sistema Tet-Off lo rendono un modello ideale per lo studio dell'espressione specifica dell'mRNA nelle cellule eucariotiche, evitando potenziali effetti pleiotropici che sono secondari all'assenza di sequenze regolatorie procariotiche nella cellula eucastica6. Di solito, doppiamente stabile Tet-Off linee cellulari (HEK 293, HeLa, e PC12) sono utilizzati con questo sistema per integrare copie del regolatore e plasmidi di risposta per un comodo accesso all'espressione genica controllabile7,8,9.
Diversi modelli di cellule epiteliali alveolare in coltura sono stati utilizzati per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Per anni, i ricercatori hanno ampiamente utilizzato cellule primarie umane o roditori10,11 così come immortalato linee cellulari come a549 umano o ratto RLE-6TN cellule12,13. Anche se sono generalmente meno proliferale e più difficili da coltura e da transfettare, le cellule epiteliali alveolare nella coltura primaria rimangono il gold standard per lo studio della funzione e della disfunzione dell'epitelio alveolare in condizioni fisiologiche e patologiche. Infatti, le linee cellulari immortalate come le cellule A549 non presentano le caratteristiche complesse e i fenotipi delle cellule primarie, mentre le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria riassumono le principali proprietà dell'epitelio alveolare, in particolare la capacità di formare una barriera polarizzata e stretta14,15. Sfortunatamente, queste cellule sono molto resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali, come quelle che utilizzano liposomi, rendendo molto difficile l'uso di un sistema indotto dal promotore come il Tet-Off.
La modulazione posttranziale dei mRNA è uno dei metodi più efficaci per modulare rapidamente l'espressione genica di una trascrizione16. La regione non tradotta di mRNA 3' (3' UTR) svolge un ruolo importante in questo meccanismo. È stato dimostrato che, a differenza dell'UTR 5', esiste una correlazione esponenziale tra la lunghezza dell'UTR 3' e le complessità cellulari e morfologiche di un organismo. Questa correlazione suggerisce che l'UTR 3', come le regioni di codifica dell'mRNA, è stato sottoposto a selezione naturale per consentire una modulazione posttranscrittivale sempre più complessa nel corso dell'evoluzione17. L'UTR 3' contiene diversi siti di legame per proteine e miRNA che influenzano la stabilità e la traduzione della trascrizione.
Nel lavoro attuale, abbiamo sviluppato uno strumento per studiare il ruolo dei domini altamente conservati nell'UTR 3' di un GOI per il controllo della stabilità della trascrizione. Ci siamo concentrati sul canale epiteliale di sodio, sottounità alfa ( , che svolge un ruolo chiave nella fisiologia epiteliale alveolare18. Le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria sono state trascate con successo con i due componenti del sistema Tet-Off, il che consente di studiare il ruolo del 3' UTR nella stabilità dell'mRNA con un sistema che influisce minimamente sulla fisiologia cellulare e sul metabolismo rispetto all'uso di inibitori della trascrizione con altri protocolli. È stata sviluppata una strategia di clonazione per differenziare l'espressione del GOI da quella del gene endogeno utilizzando un epitopo non endogenamente espresso (V5). La risposta e i plasmidi normativi sono stati poi trasferiti nelle cellule epiteliali alveolare utilizzando una tecnica di elettroporazione pipetta. Successivamente, l'espressione della trascrizione è stata misurata incubando le cellule con doxycyclina a diversi intervalli di tempo. L'emivita della trascrizione è stata valutata da RT-qPCR con un metodo Cq modificato utilizzando il prodotto transfetto tTA-Ad mRNA per la normalizzazione. Attraverso il nostro protocollo, offriamo un modo conveniente per studiare la modulazione posttrancrionale di una trascrizione in diverse condizioni e definire il coinvolgimento delle regioni non tradotte in modo più dettagliato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

Studiare la regolazione posttranscrittivale è fondamentale per comprendere la modulazione di un dato RNA messaggero (mRNA) e il suo impatto sull'omeostasi cellulare e sul metabolismo. Infatti, le fluttuazioni nell'espressione della trascrizione potrebbero modificare l'efficienza della traduzione e, in ultima analisi, l'attività cellulare di una trascrizione. Sono stati sviluppati diversi approcci sperimentali per studiare l'emivita dell'mRNA, anche se alcuni di questi metodi hanno limitazioni che impediscono il corretto studio della modulazione posttranziale. Un sistema di induzione promotore può esprimere un gene di interesse sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo metodo consente la stima dell'emivita di un dato mRNA in qualsiasi condizione sperimentale senza disturbare l'omeostasi cellulare. Uno dei principali inconvenienti di questo metodo è la necessità di traffecare le cellule, che limita l'uso di questa tecnica in cellule primarie isolate che sono altamente resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali. Le cellule epiteliali alveolar nella coltura primaria sono state ampiamente utilizzate per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Le caratteristiche uniche e il fenotipo delle cellule alveolare primarie rendono essenziale studiare le modulazioni posttrantalionali dei geni di interesse in queste cellule. Pertanto, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo strumento per studiare le modulazioni posttranscriptionali degli mRNA di interesse per le cellule epiteliali alveolar nella cultura primaria. Abbiamo progettato un protocollo di trasfezione transitoria veloce ed efficiente per inserire un sistema di espressione plasmid a controllo transciriptionally nelle cellule epiteliali alveolare primarie. Questa strategia di clonazione, usando un epito virale per etichettare il costrutto, consente la facile discriminazione dell'espressione costruttiva da quella degli mRNA endogeni. Utilizzando un metodo modificato del ciclo di quantificazione (Cq), l'espressione della trascrizione può quindi essere quantificata a intervalli di tempo diversi per misurarne l'emivita. I nostri dati dimostrano l'efficienza di questo nuovo approccio nello studio della regolazione posttrancriale in varie condizioni patologiche nelle cellule epiteliali alveolari primarie.

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per generare un sistema di espressione plasmid etransriptionally controllata Tet-Off per valutare l'importanza di diverse porzioni dell'UTR di ENaC 3' nella modulazione della stabilità della trascrizione nelle cellule epiteliali alveolar primarie.
Il primo passo nell'implementazione di questo sistema è stato quello di stabilire una tecnica di trasfezione rapida, facile ed effi...

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Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Qui, presentiamo uno strumento che può essere utilizzato per studiare la modulazione posttranscriptionale di una trascrizione nelle cellule epiteliali alveolare primarie utilizzando un sistema di espressione inducibile accoppiato a una tecnica di elettroporazione pipetta.

Sistema di espressione plasmide controllato da Transcriopzionalmente per l'analisi della stabilità delle trascrizioni dell'mRNA nelle cellule epiteliali primarie

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Quindi il nostro modello permette lo studio della modulazione post-trascrizionale di una trascrizione specifica nelle cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria e nelle loro condizioni fisiologiche e fisiopatofiche. Quindi la transitoria transitoria delle cellule epiteliali alveolari primarie ha un effetto minimo sulla fisiologia cellulare e sul metabolismo, il che pone un chiaro vantaggio rispetto ai protocolli classici usando gli inibitori della trascrizione. Per la generazione di un plasmide di risposta che esprime un gene di interesse, la sequenza del gene e i siti di clonazione multipla del vettore inducibile devono essere analizzati per identificare le sequenze di riconoscimento nei siti di clonazione multipla che non sono presenti internamente nel gene.Utilizzando la taq polimerasi ad alta fedeltà e le tecniche PCR di sovrapposizione standard, affiancare il gene di interesse con due siti di riconoscimento enzimatico di restrizione selezionati utilizzando primer di progettazione. Una sequenza nella codifica dell'epitopo V5 a monte del gene di interesse deve essere inclusa per distinguere l'espressione del gene trasfetto dall'espressione endogena. I mutanti possono essere generati dalla cancellazione sequenziale per studiare gli effetti di diverse tre regioni prime non tradotte sulla stabilità dell'mRNA del gene usando primer inversi che codificano un sito di poliadenilazione che gradualmente elimina le tre estremità prime della regione non tradotta.In definitiva, l'inserimento del gene di interesse può essere confermato dall'analisi delle restrizioni. L'orientamento genico e l'assenza di mutazioni potenzialmente introdotte durante l'rtPCR possono essere confermati sequenziando. Per la trasfezione del polmone del ratto primario di tipo due cellule epiteliali alveolari, seminare le cellule a una volta 10 alla sesta cellule per centimetro quadrato in piastre di Petri di 100 millimetri in presenza di un mezzo essenziale minimo completo.Coltura per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con umidità. Il giorno dopo, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo senza antibiotico ad ogni pozzo di una nuova piastra da 12 porri e preripidare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante questa incubazione, aggiungere un microgrammo del plasmide di risposta e un microgrammo di vettore regolatore a un tubo da 1,5 millilitri per pozzo.Lavare le cellule epiteliali alveolari con 10 millilitri per pozzo di 37 gradi Celsius PBS senza calcio o magnesio e trattare le cellule con cinque millilitri per pozzo di 37 gradi Celsius 0,05% tripside per due o quattro minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripina con 10 millilitri per pozzo di mezzo completo senza antibiotico e raccogliere le cellule in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare il piatto con quattro millilitri di mezzo fresco per raccogliere eventuali cellule rimanenti e sedimentare le cellule mediante centrifugazione.Resuspend il pellet in un millilitro di PBS per contare e centrifugare nuovamente le cellule. Resuspend il pellet ad una densità di quattro volte 10 alla settima cellule per millilitro di tampone di resuspensione e aggiungere quattro volte 10 alla quinta colonna ad ogni tubo di plasmide e vettore con miscelazione delicata. Posizionare un tubo nel dispositivo di elettroporazione e riempire il tubo con 3,5 millilitri di tampone elettrolitico.Deprimere completamente il pistone per inserire una punta dell'elettrodo placcato oro in una pipetta e mescolare delicatamente il contenuto del tubo. Aspirare con cura le celle con una pipetta e inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non si sente un suono di clic. Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le cellule epiteliali alveolari e premere Start sul touchscreen.Immediatamente dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un unico pozzo della piastra pre-riscaldata di 12 pozza. Quando tutte le cellule sono state elettroporate e placcate, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare, sostituendo il supernatante in ogni pozzo con un mezzo completo con antibiotici dopo due giorni. Il successo della trasfezione può essere confermato dall'espressione di EGFP osservata dalla microscopia a fluorescenza o dalla citometria del flusso usando un vettore di controllo.Per inibire la trascrizione del gene di interesse, 72 ore dopo la trasfezione sostituiscono il supernatante con un millilitro per pozzo di mezzo completo integrato con un microgrammo per millilitro di adossiciclina appena preparata. Per valutare l'emidità dell'mRNA del gene di interesse, riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare da 15 minuti a sei ore. Lavaggio di un pozzo con un millilitro di PBS ghiacciato prima di lesinare le cellule con 500 microlitri di tampone di lysis da un kit di estrazione dell'RNA cloroformio fenolo disponibile in commercio e scuotimento delicato in ogni momento sperimentale.Quindi, isolare l'RNA secondo le istruzioni del kit e determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nanometri. Per determinare la stabilità dell'RNA isolato, trattare prima un microgrammo dell'RNA totale da ogni campione con DNasi libera da RNasi uno per rimuovere eventuali tracce di DNA plasmide. Utilizzare un kit di sintesi cDNA disponibile in commercio con una miscela di primer oligo dT ed esomeri casuali per migliorare l'efficienza di trascrizione inversa per invertire il trascrivere l'RNA totale impoverito del DNA in cDNA secondo le istruzioni del produttore.Aggiungere 180 microlitri di acqua di grado di biologia molecolare ai 20 microlitri del mix di reazione per diluire la reazione del cDNA a una concentrazione di cinque nanogrammi per microlitri e diluire immediatamente il mix di cDNA con acqua fresca di grado di biologia molecolare per raggiungere una concentrazione di 1,25 nanogrammi per microlitro. Combina cinque microlitri di mix principale di colorante verde cibernetico con 0,1 microlitri di acqua di grado di biologia molecolare, 0,45 microlitri di primer forward micromolare 7,5, 0,45 microlitri di primer inverso micromolare e quattro microlitri di 1,25 nanogrammi per microlitro di cDNA per ottenere un volume di reazione totale di 10 microlitri. Posizionare i campioni in un termociclometro qPCR e amplificare il gene di interesse del tag V5 e gli ampliconi anticipati del transattivo della tetrociclina utilizzando le condizioni qPCR come indicato e generare una curva di fusione ad alta risoluzione per valutare le temperature di fusione specifiche degli ampliconi desiderati e per garantire l'assenza di picchi di analcone acustico.Questa tecnica di elettroporazione delle pipette facilita un tasso di efficienza di trasfezione dal 25 al 30%, come osservato dai rapporti delle cellule EGFP rilevati dalla microscopia a fluorescenza e dalla citometria del flusso. Il trattamento delle cellule epiteliali alveolari con un microgrammo per millilitro di doxiciclina non ha alcun impatto significativo sull'espressione dell'mRNA endogeno alfa ENaC in qualsiasi momento durante il periodo di trattamento. Utilizzando un sistema di espressione plasmide controllato trascrizioni come dimostrato, il segnale V5 alpha ENaC potrebbe essere normalizzato secondo il segnale avanzato del transattiator tetraciclina per determinare l'efficienza della trasfezione usando il metodo del ciclo di quantificazione a doppio delta.L'emivita dell'mRNA alfa ENaC è fino a sette volte più breve in presenza del sistema di sconto tetraciclina rispetto alla presenza di actinomicina D, confermando che l'actinomicina D porta ad una stabilizzazione artefatto dell'mRNA alfa ENaC. Inoltre, il trattamento alfa del fattore di necrosi cicloesamide e tumorale ha diminuito significativamente la stabilità della trascrizione mentre i lipolisaccaridi no. Cambiamenti significativi nella modulazione della stabilità dell'mRNA V5 alpha ENaC possono essere indotti a seconda delle regioni cancellate e incluse delle tre regioni prime non tradotte.Inoltre, l'espressione sovraescrizione di specifiche proteine leganti l'RNA diminuisce la stabilità dell'mRNA ENaC 5-alfa rispetto alla trasfezione con un pcDNA vuoto tre plasmidi. Questo strumento sarà utile per interrogare nuove intuizioni sulla regolazione post-trascrizionale dei geni chiave coinvolti nella funzione dell'epitelio alveolare e sulle loro condizioni fisiologiche o patologiche.

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Indagine basata RNA interferenza della funzione di shock termico proteine ​​27 durante la guarigione della ferita corneale epiteliale

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

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