Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

프랜시스 미뉴올트는 퀘벡 호흡기 건강 네트워크와 캐나다 보건 연구소(CIHR) 폐 훈련 프로그램, FRSQ 학생, 그리고 학부 데 에투데스 수페리어(Faculté des Études Supérieures) 학생의 지원을 받았습니다. 박사 후, 몬트리올 대학교. 이 작품은 임상 연구에서 Gosselin-Lamarre 의자와 건강 연구의 캐나다 연구소 [YBMOP-79544]에 의해 지원되었다.

모든 동물 절차는 동물 관리에 대한 캐나다 위원회의 지침에 따라 수행되었으며 센터 병원 디 l'Université 드 몬트리올 (CRCHUM)의 연구 센터의 기관 동물 관리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 관심 있는 유전자를 발현하는 반응 플라스미드의 설계 및 생성(GOI)
<ol><li>pTRE-Tight와 같은 유도가능한 테트라사이클린 오프 벡터를 사용합니다.</li>
	<li>벡터의 GOI 및 다중 복제 부위(MCS)의 ?...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

1차 배양에서 폐포 상피 세포의 낮은 형질감염속도는 이들 세포에서 mRNA 안정성을 평가하기 위해 Tet-Off 시스템의 사용에 대한 심각한 제한이었다. 그러나, 이러한 한계는 파이펫 전기개공에 의해 극복되었고, 25-30% 형질감염 효율을 허용하였다(도1 및 도 3)26.
전사체 안정성의 측정은 주어진 mRNA의 변조와 세포 항상...

mRNA의 반감기를 결정하기 위하여 몇몇 기술이 개발되었습니다. 표지된 mRNAs를 이용하는 펄스 추적 붕괴 기술은, 최소한의 세포 소요를 가진 mRNAs의 큰 풀의 동시 평가를 허용합니다. 그러나, 이러한 접근법은 단일 유전자 전사체의 반감기에 대한 직접적인 추정을 허용하지 않으며 성장 인자, ROS, alarmins, 또는 염증1을가진 자극에 따른 mRNA의 사후 전사 변조를 연구하기 위해 구현될 수 없다.
actinomycin D 및 α-amanitin과 같은 전사 억제제의 사용은 시간이 지남에 따라 mRNA 분해 역학을 측정하는 비교적 간단한 방법입니다. 이전 기술에 비해이 방법의 한 가지 주요 장점, (즉, 펄스 추적) 직접 주어진된 성적 증명서의 반감기를 추정 하 고 다른 치료 그것의 저하 역학에 영향을 미칠 수 있는 방법을 비교 하는 능력에 의존. 그러나, 세포 생리학에 대한 전사 억제제의 유의한 해로운 영향은 접근법2의주요 단점을 나타낸다. 실제로, 이들 약물을 사용하는 전체 세포 전사체의 억제는 마이크로RNA(miRNA)와 같은 mRNA 안정성에 관여하는 주요 원소의 합성을 교란시키는 부정적인 부작용뿐만 아니라 MRNA 결합 단백질의 발현 및 합성뿐만 아니라 mRNA 분해 및 안정성에 중요한 영향을 미친다. 이 약에 의하여 유전자 전사의 가혹한 교란은 그러므로 실제로 전사체의 분해 곡선을 수정할 수 있었습니다.
프로모터 유도 시스템은 특정 mRNA의 반감기를 측정하는 제3 접근법을 나타낸다. 이 방법은 전사 억제제와 유사한 방식으로 특정 mRNA의 분해를 측정합니다. 유도 시스템의 2가지 유형이 자주 사용된다: 혈청 유도 c-fos 프로모터3 및 Tet-Off 유도시스템4. c-fos 시스템으로, 세포에 유독할 수 있는 전사 억제제의 사용은 필요하지 않습니다. 그러나, 이 방법은 세포 주기 동기화가 필요하며, 이는 상 간5동안 전사체의 실제 안정성의 평가를 방지한다. 대조적으로, Tet-Off 시스템은 합성 테트라사이클린 조절 프로모터의 제어 하에 관심 유전자(GOI)의 강력한 발현을 허용한다. 이 시스템은 작동하기 위하여 세포로 cotransfected되어야 하는 2개의 요소의 존재를 요구합니다. 제1 플라스미드(pTet-Off)는 바이러스 성 단백질 HSV VP16로부터 3개의 전사 트랜스활성화 도메인으로 융합된 원핵핵억제제 TetR(대장균으로부터)으로 구성된 혼종 합성 전사 인자인 tTA-Adv를 발현한다. 상기 GOI는 테토오 연산자 서열의 7회 반복으로 융합된 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 최소 서열을 포함하는 합성 프로모터(PTight)의제어 하에 pTRE-Tight 플라스미드내로 복제된다. P타이트의 유전자 하류의 전사는 tetO와 의 TetR의 상호작용에 의존한다. 테트라 사이클린 또는 그 유도체, 독시 사이클린이있는 경우, TetR 억압자는 tetO 연산자에 대한 친화력을 잃어 전사4의중단으로 이어진다. Tet-Off 시스템의 특성은 진핵 세포에서 의 핵경상 조절 서열의 부재에 이차적인 잠재적 인 pleiotropic 효과를 피하면서 진핵 세포에서 특정 mRNA 발현의 연구에 이상적인모델6. 일반적으로, 이중으로 안정적인 Tet-Off 세포주(HEK 293, HeLa 및 PC12)는 조절가능한 유전자발현에편리하게 접근할 수 있도록 조절기 및 반응 플라스미드의 사본을 통합하기 위해 이 시스템과 함께 사용된다7,8,9.
배양에서 폐포 상피 세포의 몇몇 모형은 폐포 상피의 세포 그리고 분자 생물학을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 수년 동안, 연구자들은 인간 또는 설치류1차 세포10,11뿐만 아니라 인간 A549 또는 쥐 RLE-6TN세포(12,13)와같은 불멸의 세포주를 광범위하게 활용하였다. 그들은 일반적으로 덜 증식 하 고 배양 하 고 transfect, 1 차 배양에서 폐포 상피 세포 기능 및 생리 및 병 리 조건에서 폐 포 상피의 기능 및 기능 장애의 연구에 대 한 골드 표준 남아. 실제로, A549 세포와 같은 불멸화된 세포주는 1차 세포의 복합적인 특성 및 표현형을 나타내지 않는 반면, 1차 배양에서 폐포 상피 세포는 폐포 상피의 주요 특성을 재구성하는 반면, 특히 편광 및 단단한장벽(14,15)을형성하는 능력이 있다. 불행히도, 이들 세포는 리포솜을 활용하는 것과 같은 종래의 형질감염 기술에 매우 내성이 있어 Tet-Off와 같은 프로모터 유도 시스템의 사용이 매우 어렵다.
mRNAs의 후전사 변조는전사체(16)의유전자 발현을 빠르게 조절하는 가장 효과적인 방법 중 하나이다. mRNA 3' 번역되지 않은 영역 (3' UTR)은 이 기계장치에 있는 중요한 역할을 합니다. 5' UTR과 달리 3' UTR의 길이와 유기체의 세포 및 형태학적 복잡성 사이에 기하급수적인 상관 관계가 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 상관관계는 mRNA 코딩 영역과 같은 3' UTR이 진화17전반에걸쳐 점점 더 복잡한 후전사 변조를 허용하도록 자연선택을 거쳤음을 시사한다. 3' UTR은 전사체의 안정성 및 번역에 영향을 미치는 단백질 및 miRNAs에 대한 여러 결합 부위를 포함합니다.
본 작품에서는 전사체 안정성을 제어하기 위한 GOI의 3' UTR에서 고도로 보존된 도메인의 역할을 조사하는 도구를 개발했습니다. 우리는 폐포 상피 생리학에 중요한 역할을 하는 상피 나트륨 채널, 알파 소단위(αENaC)에 초점을 맞췄습니다18. 1 차 적인 배양에서 폐포 상피 세포는 성공적으로 다른 프로토콜과 전사 억제제의 사용에 비해 세포 생리학 및 신진 대사에 최소한의 영향을 미치는 시스템으로 mRNA 안정성에서 3'UTR의 역할의 연구를 허용하는 Tet-Off 시스템의 두 가지 구성 요소로 과도하게 형질 감염되었다. 비내인성 발현 에피토프(V5)를 사용하여 내인성 유전자의 발현과 GOI의 발현을 분화하기 위한 복제 전략이 개발되었다. 반응 및 조절 플라스미드는 피펫 전기화 기술을 사용하여 폐포 상피 세포로 옮겨졌다. 이어서, 전사체의 발현은 상이한 시간 간격으로 독시사이클린으로 세포를 배양시킴으로써 측정하였다. 전사체의 반감기는 정규화를 위해 형질감염된 tTA-Ad mRNA 생성자를 사용하여 변형된 Cq 방법을 사용하여 RT-qPCR에 의해 평가되었다. 우리의 프로토콜을 통해, 우리는 다른 조건에서 성적 증명서의 사후 변조를 공부하고 더 자세히 번역되지 않은 영역의 참여를 정의하기위한 편리한 방법을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

사후 전사 조절을 연구하는 것은 주어진 메신저 RNA (mRNA)의 변조와 세포 항상성 및 대사에 미치는 영향을 이해하는 데 기본적입니다. 실제로, 전사체 발현의 변동은 번역 효율성과 궁극적으로 전사체의 세포 활성을 수정할 수 있다. 몇몇 실험적인 접근은 이 방법의 몇몇이 사후 전사 변조의 적당한 연구 결과 방지하는 한계가 있더라도 mRNA의 반감기를 조사하기 위하여 개발되었습니다. 프로모터 유도 시스템은 합성 테트라사이클린 조절 프로모터의 제어 하에 관심 있는 유전자를 발현할 수 있다. 이 방법은 세포 항상성을 방해하지 않고 임의의 실험 조건 하에서 주어진 mRNA의 반감기 추정을 허용한다. 이 방법의 한 가지 주요 단점은 기존의 형질 감염 기술에 매우 저항력이있는 고립 된 1 차 세포에서이 기술의 사용을 제한하는 트랜스 펙트 세포의 필요성입니다. 1 차적인 문화에서 폐포 상피 세포는 폐포 상피의 세포 및 분자 생물학을 공부하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 1 차적인 폐포 세포의 유일한 특성 그리고 표현형은 이 세포에 있는 관심 있는 유전자의 사후 전사 변조를 공부하는 것이 필수적입니다. 따라서, 우리의 목표는 1 차적인 배양에 있는 폐포 상피 세포에 있는 관심있는 mRNAs의 사후 전사 변조를 조사하기 위하여 새로운 공구를 개발하는 것이었습니다. 우리는 1 차적인 폐포 상피 세포로 전사로 통제된 plasmid 발현 시스템을 삽입하기 위하여 빠르고 능률적인 과도 형질 감염 프로토콜을 디자인했습니다. 이 복제 전략은 바이러스 성 에피토프를 사용하여 구문에 태그를 붙이면 내인성 mRNAs의 구성발식을 쉽게 차별할 수 있습니다. 수정된 ΔΔ 정량화 주기(Cq) 방법을 사용하여, 전사체의 발현은 그 반감기를 측정하기 위해 상이한 시간 간격으로 정량화될 수 있다. 우리의 데이터는 1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 각종 병리생리학 조건에 있는 사후 전사 적 조절을 공부에 있는 이 새로운 접근의 효율성을 보여줍니다.

이 프로토콜은 1차 폐포 상피 세포에서 전사성 안정성의 변조에서 αENaC 3' UTR의 상이한 부분의 중요성을 평가하기 위해 Tet-Off 전사적으로 제어된 플라스미드 발현 시스템을 생성하는 데 성공적으로 사용되었다.
이 시스템의 구현의 첫 번째 단계는 치포 상피 세포를 위한 빠르고 쉽고 효율적인 형질감염 기술을 확립하는 것이었...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

여기서, 우리는 파이펫 전기화 기술에 결합된 유도성 발현 시스템을 이용하여 1차 폐포 상피 세포에서 전사체의 전사체의 후전사 변조를 연구하는데 사용될 수 있는 도구를 제시한다.

1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

그래서 우리의 모형은 1 차적인 배양및 그들의 생리적 및 병리학 조건에 있는 폐포 상피 세포에 있는 특정 전사체의 전사 후 변조의 연구를 허용합니다. 따라서 1차 폐포 상피 세포의 일시적인 전환은 세포 생리학 및 신진 대사에 최소한의 영향을 미치며, 이는 전사 억제제를 사용하여 고전적인 프로토콜에 비해 명확한 이점을 제공합니다. 관심 있는 유전자를 발현하는 응답 플라스미드의 생성을 위해, 유도성 벡터의 서열 및 다중 복제 부위를 분석하여 유전자내에 내부적으로 존재하지 않는 다중 복제 부위에서 인식 서열을 식별하도록 분석되어야 한다.높은 충실도 taq 폴리머라제 및 표준 중첩 PCR 기술을 사용하여 디자이너 프라이머를 사용하여 두 개의 선택된 제한 효소 인식 사이트와 관심 있는 유전자를 측면. 관심 있는 유전자의 V5 에피토프 상류를 코딩하는 서열은 내인성 발현으로부터 전감염된 유전자의 발현을 구별하기 위해 포함되어야 한다. 돌연변이는 번역되지 않은 영역의 3개의 주요 끝을 점진적으로 삭제하는 폴리아데닐레이션 부위를 코딩하는 역프라이머를 사용하여 유전자의 mRNA의 안정성에 대한 상이한 3개의 주요 번역되지 않은 영역의 효과를 연구하기 위해 순차적 결실에 의해 생성될 수 있다.궁극적으로, 관심 있는 유전자의 삽입은 제한 분석에 의해 확인될 수 있다. 유전자 방향 및 rtPCR 도중 잠재적으로 소개된 돌연변이의 부재는 시퀀싱에 의해 확인될 수 있습니다. 1차 쥐 폐 형 2형 폐피상피세포의 트랜스포핑을 위해, 완전한 최소 필수 배지가 있는 100밀리미터 페트리 접시에서 100밀리미터 페트리 접시에서 10~6세포로 세포를 1회 10회 10시에 종자한다.습도가 있는 이산화탄소 5%에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 새로운 12 웰 플레이트의 각 우물에 항생제없이 완전한 매체의 500 마이크로 리터를 추가하고 30 분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 미리 데워. 이 잠복식 동안, 응답 플라스미드의 마이크로그램 1개와 조절 벡터 1마이크로그램을 웰당 1.5 밀리리터 튜브에 추가한다.칼슘이나 마그네슘없이 37섭씨 PBS의 우물 당 10 밀리리터로 폐포 상피 세포를 세척하고 세포 배양 인큐베이터에서 2 ~4 분 동안 섭씨 37도 당 5 밀리리터로 세포를 치료하십시오. 세포가 분리되면 항생제없이 완전한 배지의 웰 당 10 밀리리터로 트립신을 중화시키고 새로운 50 밀리리터 튜브로 세포를 수집합니다. 신선한 배지의 4 밀리리터로 접시를 씻어 나머지 세포와 퇴적물을 원심분리에 의해 세포를 수집합니다.계산및 원심분리세포를 위해 PBS의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 재서스펜션 버퍼의 밀리리터 당 7번째 세포에 4회 10번의 밀도로 펠릿을 재중단하고 부드러운 혼합을 가진 플라스미드 및 벡터의 각 튜브에 제5 세포에 4회 10번을 추가한다. 전기 기화 장치에 하나의 튜브를 놓고 전해질 버퍼의 3.5 밀리리터로 튜브를 채웁니다.피스톤을 완전히 우울하게 하여 금도금 전극 팁을 파이펫에 삽입하고 튜브 내용기를 부드럽게 섞습니다. 조심스럽게 파이펫으로 세포를 흡인하고 클릭 소리가 들릴 때까지 전기 기공 스테이션에 파이펫을 삽입합니다. 폐포 상피 세포에 적합한 전기 기립 프로토콜을 선택하고 터치 스크린에서 시작을 누릅니다.배분 직후, 파이펫을 제거하고 세포를 미리 데운 12웰 플레이트의 우물로 옮킨다. 모든 세포가 전극 및 도금되었을 때, 2 일 후에 항생제로 완전한 배지로 각 우물의 상체를 대체하는 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 형광 현미경 또는 유동 세포측정에 의해 관찰된 EGFP의 발현에 의해 형광의 성공은 대조군 벡터를 이용하여 확인할 수 있다.관심 있는 유전자의 전사를 억제하기 위해, 72시간 후 형질전환은 새로 준비된 아옥시사이클린의 밀리리터 당 1마이크로그램으로 보충된 완전한 매체의 웰당 1밀리리터로 대체한다. 관심 있는 유전자의 mRNA 반감기를 평가하기 위하여는, 15 분에서 6 시간 까지 세포 배양 인큐베이터로 판을 반환합니다. 시판되는 페놀 클로로폼 RNA 추출 키트에서 500 마이크로리터의 용액 버퍼로 세포를 리싱하기 전에 얼음 차가운 PBS 1 밀리리터로 잘 세척하고 각 실험 시점에서 부드러운 흔들림을 제공합니다.이어서, 키트 지침에 따라 RNA를 분리하고 230, 260 및 280 나노미터에서 분광측법에 의한 RNA 수율 및 순도를 결정한다. 격리된 RNA의 안정성을 결정하기 위하여는, 먼저 어떤 플라스미드 DNA 흔적을 제거하기 위하여 RNase 무료 DNase를 가진 각 견본에서 총 RNA의 1개의 마이크로그램을 취급합니다. 제조 업체의 지시에 따라 DNA고갈기 총 RNA를 cDNA로 전사하는 역전사 효율을 향상시키기 위해 올리고 dT 및 임의의 hexomer 프라이머의 혼합과 함께 시판가능한 cDNA 합성 키트를 사용합니다.분자 생물학 등급 물 180마이크로리터를 반응 혼합물의 20마이크로리터에 첨가하여 마이크로리터 농도당 5나노그램으로 cDNA 반응을 희석시키고, 마이크로리터 농도당 1.25 나노그램에 도달하기 위해 신선한 분자 생물학 등급물과 cDNA 믹스를 즉시 희석시한다. 5개의 마이크로리터와 분자 생물학 급수0.1 마이크로리터, 7.5 마이크로몰러 포워드 프라이머의 0.45 마이크로리터, 7.5 마이크로몰러 역프라이머의 0.45 마이크로리터, cDNA의 마이크로리터 당 1.25 나노그램의 4개의 마이크로리터를 결합하여 총 10마이크로리터의 반응량을 얻을 수 있습니다. qPCR 써모사이클러에 샘플을 배치하고 QPCR 조건을 사용하여 관심 있는 V5 태그 유전자를 증폭시키고 고해상도 용융 곡선을 생성하여 원하는 앰플리콘의 특정 용융 온도를 평가하고 노이즈 앰플턴 피크의 부재를 보장한다.이 파이펫 전기 기화 기술은 형광 현미경 및 유동 세포측정에 의해 검출된 EGFP 세포의 비율에 의해 관찰된 바와 같이 25~ 30%의 경질 효율 속도를 용이하게 한다. 독시사이클린의 밀리리터당 1마이크로그램을 함유한 폐포 상피 세포의 치료는 치료 기간 동안 언제든지 내인성 알파 ENaC mRNA의 발현에 큰 영향을 미치지 않는다. 입증된 바와 같이 전사적으로 제어된 플라스미드 발현 시스템을 사용하여, V5 알파 ENaC 신호는 이중 델타 정량화 주기 방법을 사용하여 트랜스페션의 효율을 결정하기 위해 테트라사이클린 트랜스액티바이터 고급 신호에 따라 정규화될 수 있다.알파 ENaC mRNA의 반감기는 actinomycin D의 존재에 비해 테트라 사이클린 오프 시스템의 존재에서 최대 7 배 짧아, actinomycin D는 관절 알파 ENaC mRNA 안정화에 이르게 것을 확인. 또한, 사이클로헥사미드 및 종양 괴사 인자 알파 치료는 리포폴리사카라이드가 그렇지 않으면 서술체의 안정성을 현저히 감소시킨다. V5 알파 ENaC mRNA 안정성의 변조에 있어 유의한 변화는 3개의 주요 번역되지 않은 영역의 삭제 및 포함 된 영역에 따라 유도 될 수 있다.또한, 특정 RNA 결합 단백질의 과잉 발현은 빈 pcDNA 3플라스미드를 통한 트랜스포이션에 비해 5알파 ENaC mRNA의 안정성을 감소시킨다. 이 도구는 폐포 상피의 기능과 생리적 또는 병리학적 조건에 관여하는 주요 유전자의 전사 후 조절에 대한 새로운 통찰력을 쿼리하는 데 유용할 것입니다.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

각막 상피 ​​창상 치유 기간 동안 열 충격 단백질 27의 기능의 RNA 간섭 기반 조사

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

연구

유전학

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...