Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Francis Migneault ble støttet av et fellesskap levert av Quebec Respiratory Health Network og Canadian Institutes of Health Research (CIHR) lungetreningsprogram, et studentskap fra FRSQ og et studentskap fra Faculté des Études Supérieures et Postdoktor, Université de Montréal. Dette arbeidet ble støttet av Gosselin-Lamarre Chair i klinisk forskning og Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].

Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene fra Canadian Council on Animal Care og ble godkjent av Institutional Animal Care Committee of the Research Center of Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Design og generering av responsen plasmid uttrykker genet av interesse (GOI)
<ol><li>Bruk en indusibel tetracyklin-off vektor, for eksempel pTRE-Tight.</li>
	<li>Analyser sekvensen av GOI og flere kloning området (MCS) av vektoren for å identifisere beg...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

Den lave transfection rate av alveolære epitelceller i primærkulturen har vært en alvorlig begrensning for bruk av Tet-Off-systemet for å vurdere mRNA stabilitet i disse cellene. Denne begrensningen ble imidlertid overvunnet av pipetteelektroporasjon, slik at en 25-30% transfection effektivitet (Figur 1 og figur 3)26.
Målingen av transkripsjonstabilitet er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gi...

Flere teknikker er utviklet for å bestemme halveringstiden til mRNAs. Pulsjagende forfallsteknikk, som benytter merkede mRNAer, gjør det mulig å samtidig evaluering av et stort basseng av mRNAer med minimal cellulær forstyrrelse. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke en direkte estimering av halveringstiden til en enkelt gentranskripsjon og kan ikke implementeres for å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en mRNA etter stimulering med vekstfaktorer, ROS, alarmer eller betennelse1.
Bruk av transkripsjonshemmere, som actinomycin D og α-amanitin, er en relativt enkel metode for måling av mRNA nedbrytningskinetikk over tid. En stor fordel med denne tilnærmingen over tidligere teknikker, (dvs. pulsjakt) er avhengig av evnen til å direkte estimere halveringstiden til en gitt transkripsjon og sammenligne hvordan ulike behandlinger kan påvirke nedbrytningskinetikken. Den betydelige skadelige virkningen av transkripsjonshemmere på cellefysiologi representerer imidlertid en stor ulempe for tilnærmingen2. Faktisk har hemmingen av hele celletranskripsjonen med disse stoffene den negative bivirkningen av å perturbing syntesen av viktige elementer involvert i mRNA stabilitet, som microRNAs (miRNAs), samt uttrykk og syntese av RNA-bindende proteiner, som er viktige for mRNA nedbrytning og stabilitet. Den alvorlige perturbasjonen av gentranskripsjon av disse legemidlene kan derfor artefactually endre nedbrytningskurvene av transkripsjoner.
Arrangørens induksjonssystem representerer en tredje tilnærming for å måle halveringstiden til en bestemt mRNA. Denne metoden måler nedbrytningen av en bestemt mRNA på samme måte som metoder som bruker transkripsjonshemmere. To typer induksjonssystemer brukes ofte: serumindusert c-fos-promotor3 og Tet-Off induserbart system4. Med c-fos-systemet er bruk av transkripsjonshemmere som kan være giftige for cellen ikke nødvendig. Denne metoden krever imidlertid synkronisering av cellesyklus, som forhindrer evaluering av den faktiske stabiliteten til en transkripsjon under interfase5. I motsetning tillater Tet-Off-systemet det sterke uttrykket av genet av interesse (GOI) under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert arrangør. Dette systemet krever tilstedeværelse av to elementer som må være cotransfected inn i cellen for å være funksjonell. Den første plasmid (pTet-Off) uttrykker det regulatoriske proteinet tTA-Adv, en hybrid syntetisk transkripsjonsfaktor som består av den prokaryotiske undertrykkeren TetR (fra Escherichia coli) smeltet til tre transkripsjonstransaktiveringsdomener fra det virale proteinet HSV VP16. GOI er klonet inn i pTRE-Tight plasmid under kontroll av en syntetisk promotor (PTight),bestående av den minimale sekvensen av cytomegalovirus (CMV) arrangør smeltet til syv gjentakelser av tetO operatør sekvens. Transkripsjonen av genet nedstrøms av PTight er avhengig av samspillet mellom TetR med tetO. I nærvær av tetracyklin eller dets derivat, doxycyklin, mister TetR-undertrykkeren sin affinitet for tetO-operatøren, noe som fører til en opphør av transkripsjon4. Egenskapene til Tet-Off-systemet gjør det til en ideell modell for studiet av spesifikke mRNA-uttrykk i eukaryyotiske celler samtidig som det unngår potensielle pleiotropiske effekter som er sekundære til fraværet av prokaryotiske regulatoriske sekvenser i eukaryotisk celle6. Vanligvis brukes dobbelt stabile Tet-Off cellelinjer (HEK 293, HeLa og PC12) med dette systemet til å integrere kopier av regulatoren og responsplasmider for praktisk tilgang til kontrollerbart genuttrykk7,8,9.
Flere modeller av alveolære epitelceller i kulturen har blitt brukt til å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. I årevis har forskere i stor grad utnyttet menneskelige eller gnagerprimære celler10,11 samt udødelige cellelinjer som menneskelig A549 eller rotte RLE-6TN celler12,13. Selv om de generelt er mindre proliferative og vanskeligere å kultur og transfect, alveolære epitelceller i primærkulturen forblir gullstandarden for studiet av funksjonen og dysfunksjonen av alveolær epitel i fysiologiske og patologiske forhold. Faktisk viser udødeliggjortcellelinjer som A549-celler ikke de komplekse egenskapene og fenotypene til primærceller, mens alveorene epitelceller i primærkultur rekapitulerer hovedegenskapene til alveolærepitelet, spesielt evnen til å danne en polarisert og stram barriere14,15. Dessverre er disse cellene svært motstandsdyktige mot konvensjonelle transfection teknikker, for eksempel de som bruker liposomer, noe som gjør bruk av et promotor-indusert system som Tet-Off svært vanskelig.
Den posttranskripsjonelle moduleringen av mRNAs er en av de mest effektive metodene for raskt å modulere genuttrykket til en transkripsjon16. MRNA 3' uoversatte region (3' UTR) spiller en viktig rolle i denne mekanismen. Det har vist seg at det, i motsetning til 5' UTR, er en eksponentiell sammenheng mellom lengden på 3' UTR og de cellulære og morfologiske kompleksitetene til en organisme. Denne korrelasjonen antyder at 3' UTR, som mRNA-kodeområdene, har blitt utsatt for naturlig utvalg for å tillate stadig mer kompleks posttranskripsjonsmodulasjon gjennom evolusjon17. 3' UTR inneholder flere bindende steder for proteiner og miRNAer som påvirker stabiliteten og oversettelsen av transkripsjonen.
I det nåværende arbeidet utviklet vi et verktøy for å undersøke rollen som svært bevarte domener i 3' UTR av en GOI for kontroll av transkripsjonsstabilitet. Vi fokuserte på epitelnatriumkanalen, alfa-underenheten (αENaC), som spiller en nøkkelrolle i alveolær epitelfysiologi18. Alveolære epitelceller i primærkulturen ble vellykket transiently transfected med de to komponentene i Tet-Off-systemet, noe som gjør det mulig for studiet av rollen til 3 ' UTR i mRNA stabilitet med et system som minimalt påvirker cellefysiologi og metabolisme i forhold til bruk av transkripsjonshemmere med andre protokoller. En kloningstrategi ble utviklet for å skille uttrykket av GOI fra det endogene genet ved hjelp av en nonendogenously uttrykt epitop (V5). Responsen og regulatoriske plasmider ble deretter overført til alveolære epitelceller ved hjelp av en pipetteelektroporasjonsteknikk. Deretter ble uttrykket av transkripsjonen målt ved å inkubere cellene med doxycyklin med forskjellige tidsintervaller. Halveringstiden av transkripsjonen ble evaluert av RT-qPCR med en modifisert Cq-metode ved hjelp av det transinfiserte tTA-Ad mRNA-produktet for normalisering. Gjennom vår protokoll tilbyr vi en praktisk måte å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon under forskjellige forhold og definere involveringav de uoversatte regionene mer detaljert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

Å studere posttranskripsjonsregulering er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gitt budbringer RNA (mRNA) og dens innvirkning på cellehomeostase og metabolisme. Faktisk kan svingninger i transkripsjonsuttrykk endre oversettelseseffektiviteten og til slutt den cellulære aktiviteten til en transkripsjon. Flere eksperimentelle tilnærminger er utviklet for å undersøke halveringstiden til mRNA, selv om noen av disse metodene har begrensninger som forhindrer riktig studie av posttranskripsjonsmodulasjon. Et promotorinduksjonssystem kan uttrykke et gen av interesse under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert promotor. Denne metoden tillater halveringstidestimering av en gitt mRNA under enhver eksperimentell tilstand uten forstyrrende celle homeostase. En stor ulempe med denne metoden er nødvendigheten av transfect celler, som begrenser bruken av denne teknikken i isolerte primære celler som er svært motstandsdyktigmot konvensjonelle transfection teknikker. Alveolære epitelceller i primærkulturen har blitt brukt mye for å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. De unike egenskapene og fenotypen til primære alveolære celler gjør det viktig å studere posttranskripsjonsmodulasjonene av gener av interesse i disse cellene. Derfor var vårt mål å utvikle et nytt verktøy for å undersøke posttranskripsjonsmodulasjonene til mRNAs av interesse for alveoriske epitelceller i primærkulturen. Vi designet en rask og effektiv forbigående transfection protokoll for å sette inn et transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem i primære alveolære epitelceller. Denne kloningstrategi, ved hjelp av en viral epitope for å tagge konstruksjonen, gjør det mulig for enkel diskriminering av konstruere uttrykk fra endogene mRNAs. Ved hjelp av en modifisert ΔΔ quantification syklus (Cq) metode, kan uttrykket av transkripsjonen deretter kvantifiseres med forskjellige tidsintervaller for å måle halveringstiden. Våre data viser effektiviteten av denne nye tilnærmingen i å studere posttranskripsjonsregulering i ulike patofysiologiske forhold i primære alveolære epitelceller.

Denne protokollen ble vellykket brukt til å generere et Tet-Off transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem for å evaluere betydningen av ulike deler av αENaC 3 ' UTR i modulering av transkripsjonstabilitet i primære alveolære epitelceller.
Det første trinnet i gjennomføringen av dette systemet var å etablere en rask, enkel og effektiv transfection teknikk for alveolære epitelceller i primærkulturen, som er vanske...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Her presenterer vi et verktøy som kan brukes til å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon i primære alveolære epitelceller ved hjelp av et utilbørlig uttrykkssystem koblet til en pipetteelektroporasjonsteknikk.

Effektivt transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem for undersøkelse av stabiliteten av mRNA transkripsjoner i primær alveorisk epitelceller

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Så vår modell tillater studie av post-transkripsjonsmodulering av en bestemt transkripsjon i alveolære epitelceller i primærkulturen og deres fysiologiske og patofysiologiske forhold. Så den forbigående transfection av primære alveolr epitelceller har minimal effekt på cellefysiologi og metabolismer, noe som utgjør en klar fordel over klassiske protokoller ved hjelp av transkripsjonshemmere. For generering av et svar plasmid uttrykker et gen av interesse, sekvensen av genet, og flere kloning steder av den induknelige vektor må analyseres for å identifisere anerkjennelse sekvenser i flere kloning nettsteder som ikke er til stede internt i genet.Ved hjelp av high fidelity taq polymerase og standard overlapping PCR teknikker, flankere genet av interesse med to valgte begrensning enzym anerkjennelse nettsteder ved hjelp av designer primere. En sekvens i koding av V5 epitop oppstrøms av genet av interesse må inkluderes for å skille uttrykket av trans infisert genet fra endogene uttrykk. Mutanter kan genereres ved sekvensiell sletting for å studere effekten av forskjellige tre viktigste uoversettede regioner på stabiliteten til mRNA av genet ved hjelp av omvendte primere som koder et polyadenyleringssted som gradvis sletter den tre hovedenden av den uoversettede regionen.Til syvende og sist kan innsettingen av interessekonflikten bekreftes ved begrensningsanalyse. Genorienteringen og fraværet av mutasjoner som potensielt kan innføres under rtPCR kan bekreftes ved sekvensering. For transfection av primær rotte lunge type to alveolr epitelceller, frø cellene på en gang 10 til de sjette cellene per kvadratcentimeter i 100 millimeter Petri retter i nærvær av komplett minimum essensielle medium.Kultur i 24 timer ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid med fuktighet. Neste dag, tilsett 500 mikroliter komplett medium uten antibiotika til hver brønn av en ny 12 brønnplate og forvarm platen ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Under denne inkubasjonen, legg til ett mikrogram av responsen plasmid og ett mikrogram regulatorisk vektor til en 1,5 milliliter rør per brønn.Vask alveolerepitetelcellene med 10 milliliter per brønn på 37 grader Celsius PBS uten kalsium eller magnesium og behandle cellene med fem milliliter per brønn på 37 grader Celsius 0,05% trypsin i to til fire minutter i cellekulturinkubatoren. Når cellene har løsnet, nøytralisere trypsin med 10 milliliter per brønn av komplett medium uten antibiotika og samle cellene i en ny 50 milliliter tube. Vask parabolen med fire milliliter friskt medium for å samle eventuelle gjenværende celler og sediment cellene ved sentrifugering.Resuspend pellet i en milliliter PBS for telling og sentrifuge cellene igjen. Resuspend pellet med en tetthet på fire ganger 10 til de syvende cellene per milliliter av resuspension buffer og legge fire ganger 10 til femte celler til hvert rør av plasmid og vektor med mild blanding. Plasser ett rør i elektroporasjonsenheten og fyll røret med 3,5 milliliter elektrolytisk buffer.Trykk stempelet helt inn for å sette inn en gullbelagt elektrodespiss i en pipette og bland forsiktig rørinnholdet. Aspirer cellene forsiktig med en pipette og sett pipetten inn i elektroporasjonsstasjonen til en klikkelyd høres. Velg riktig elektroporasjonsprotokoll for alveolerepitelceller, og trykk Start på berøringsskjermen.Umiddelbart etter transfection, fjern pipetten og overfør cellene til en brønn av den forhåndsoppvarmede 12 brønnplaten. Når alle cellene har blitt elektroporert og belagt, plasser platen i cellekulturinkubatoren, og erstatter supernatanten i hver brønn med komplett medium med antibiotika etter to dager. Suksessen til transfection kan bekreftes av uttrykket av EGFP som observert av fluorescens mikroskopi eller flytcytometri ved hjelp av en kontroll vektor.For å hemme transkripsjonen av genet av interesse, erstatter 72 timer etter transfection supernatanten med en milliliter per brønn av komplett medium supplert med ett mikrogram per milliliter nylaget adoksycyklin. For å vurdere mRNA halveringstiden til genet av interesse, returner platen til cellekulturinkubatoren fra 15 minutter til seks timer. Vask en brønn med en milliliter iskald PBS før lysing cellene med 500 mikroliter lysis buffer fra en kommersielt tilgjengelig fenol kloroform RNA ekstraksjon kit og mild risting på hvert eksperimentelle tidspunkt.Deretter isolerer du RNA i henhold til kit instruksjoner og bestemme RNA utbytte og renhet ved spektrometri på 230, 260, og 280 nanometer. For å bestemme stabiliteten til den isolerte RNA, må du først behandle ett mikrogram av den totale RNA fra hver prøve med RNase gratis DNase en for å fjerne eventuelle plasmid DNA-spor. Bruk et kommersielt tilgjengelig cDNA-syntesesett med en blanding av oligo dT og tilfeldige hexomer primere for å forbedre reverstranskripsjonseffektiviteten for å reversere transkribering av DNA utarmet total RNA til cDNA i henhold til produsentens instruksjoner.Tilsett 180 mikroliter molekylærbiologigrad vann til de 20 mikroliter av reaksjonsblandingen for å fortynne cDNA-reaksjonen ved en fem nanogram per mikroliterkonsentrasjon og fortynne umiddelbart cDNA-blandingen med frisk molekylærbiologigradvann for å nå et 1,25 nanogram per mikroliterkonsentrasjon. Kombiner fem mikroliter av cybergrønn fargestoff master mix med 0,1 mikroliter molekylærbiologi grade vann, 0,45 mikroliter på 7,5 mikromos fremover primer, 0,45 mikroliter på 7,5 mikromolar omvendt primer, og fire mikroliter på 1,25 nanogram per mikroliter cDNA for å oppnå et totalt reaksjonsvolum på 10 mikroliter. Plasser prøvene i en qPCR termocycler og forsterke V5 tag genet av interesse og tetrocyklin transaktivator forhånd amplikloner ved hjelp av qPCR forhold som angitt og generere en høy oppløsning smeltekurve for å vurdere de spesifikke smeltetemperaturene i de ønskede amplicons og for å sikre fravær av støy amplicon topper.Denne pipetteelektroporasjonsteknikken forenkler en effektivitetshastighet på 25 til 30 % som observert av forholdet mellom EGFP-celler som oppdages av fluorescensmikroskopi og strømningscytometri. Behandlingen av alveolr epitelceller med ett mikrogram per milliliter doxycyklin har ingen signifikant innvirkning på uttrykket av endogene alfa ENaC mRNA når som helst i behandlingsperioden. Ved hjelp av et transkripsjonelt kontrollert plasmiduttrykkssystem som demonstrert, kan V5 alfa ENaC-signalet normaliseres i henhold til tetracyklintransaktivatoren avansert signal for å bestemme effektiviteten av transfection ved hjelp av dobbel delta kvantifisering syklus metoden.Halveringstiden til alfa ENaC mRNA er opptil syv ganger kortere i nærvær av tetracyklin av systemet enn i nærvær av actinomycin D, bekrefter at actinomycin D fører til en artefakt alfa ENaC mRNA stabilisering. Videre redusert cyklohexamid og tumornekrose faktor alfabehandling signifikant stabiliteten av transkripsjonen mens lipopolysakkarider ikke gjør det. Betydelige endringer i moduleringen av V5 alfa ENaC mRNA stabilitet kan induseres avhengig av de slettede og inkluderte områdene i de tre viktigste uoversettede regionen.I tillegg reduserer overuttrykket av spesifikke RNA-bindende proteiner stabiliteten til 5-alfa ENaC mRNA sammenlignet med transfection med en tom pcDNA tre plasmid. Dette verktøyet vil være nyttig for å spørre ny innsikt i post-transkripsjonsregulering av viktige gener involvert i funksjonen av alveolr epitel og deres fysiologiske eller patologiske forhold.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

RNA interferens-basert undersøkelse av funksjon av Heat Shock Protein 27 under hornhinneepitel Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Måling av biologiske klokke genekspresjon og hormon i Human primære cellekulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gjennom induserbar Transient Transfeksjon

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

In Vitro Bioluminescens analysen som karakteriserer døgnrytmen i Mammary epitelceller

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Forbigående uttrykk av utenlandske gener i insekt celler (sf9) for Protein funksjonelle analysen

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produksjon og identifikasjon av CRISPR/Cas9-generert Gene Knockouts i modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Rensing av lav-rikelig celler i Drosophila visuelle systemet

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...