Name: efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells a

Francis Migneault foi apoiado por uma bolsa da Rede de Saúde Respiratória de Quebec e do programa de treinamento pulmonar do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR), um estudante da FRSQ e um aluno da Faculdade des Études Supérieures et Pós-doutorado, Université de Montréal. Este trabalho foi apoiado pela Cátedra Gosselin-Lamarre em pesquisa clínica e pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde [YBMOP-79544].

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Com Animais e aprovados pelo Comitê de Cuidados Institucionais com Animais do Centro de Pesquisa do Centro Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Projeto e geração do plasmídeo de resposta expressando o gene de interesse (GOI)
<ol><li>Use um vetor de tetraciclina-off induível, como o pTRE-Tight.</li>
	<li>Analisar a sequência do ID e o site de clonagem múlti...

<ol>
	<li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay.">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li><li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+stress+response.">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li><li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+in+mammalian+cells.">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone.">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li><li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+GADD45+and+JNK/SAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1.">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li><li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+isoforms+of+the+Na+/Ca2++exchanger,+NCX1+and+NCX3,+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt/protein+kinase+B+pathway.">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li><li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells.">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li><li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL:+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival.">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li><li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells.">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li><li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis.">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide.">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway.">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li><li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype.">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).</li><li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness.">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li><li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+functions+of+3'UTRs.">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li><li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lengthening+of+3'UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution.">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li><li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease.">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li><li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells:+involvement+of+purinergic+signaling.">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li><li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs.">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells.">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li><li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+'megaprimer'+PCR+method.">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li><li>Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).</li><li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells:+Involvement+of+its+3'+Untranslated+Region.">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li><li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modulation de la stabilit&#233; de l'ARNm alphaENaC dans les cellules &#233;pith&#233;liales alv&#233;olaires: d&#233;termination du r&#244;le des s&#233;quences 3' non traduites. , (2015).</li><li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection.">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li><li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells.">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li><li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide.">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).</li><li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+doxycycline,+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis.">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li><li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+pathways+of+RNA+degradation.">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals.">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li></ol>

A baixa taxa de transfecção de células epiteliais alveolares na cultura primária tem sido uma séria limitação para o uso do sistema Tet-Off para avaliar a estabilidade do mRNA nessas células. No entanto, essa limitação foi superada pela eletroporação da pipeta, permitindo uma eficiência de transfecção de 25-30%(Figura 1 e Figura 3)26.
A medição da estabilidade da transcrição é fundamental pa...

Várias técnicas foram desenvolvidas para determinar a meia-vida dos mRNAs. A técnica de decaibilidade de perseguição de pulso, que utiliza mRNAs rotulados, permite a avaliação simultânea de uma grande piscina de mRNAs com perturbação celular mínima. No entanto, essa abordagem não permite uma estimativa direta da meia-vida de uma única transcrição genética e não pode ser implementada para estudar a modulação pós-transcricional de um mRNA após a estimulação com fatores de crescimento, ROS, alarminas ou inflamação1.
O uso de inibidores de transcrição, como actinomicina D e α-amanitina, é um método relativamente simples para medir a cinética da degradação do mRNA ao longo do tempo. Uma das principais vantagens dessa abordagem em relação à das técnicas anteriores, (ou seja, perseguição de pulso) depende da capacidade de estimar diretamente a meia-vida de uma determinada transcrição e comparar como diferentes tratamentos poderiam afetar sua cinética de degradação. No entanto, o impacto deletério significativo dos inibidores de transcrição na fisiologia celular representa uma grande desvantagem da abordagem2. De fato, a inibição de todo o transcriptome celular com essas drogas tem o efeito colateral negativo de perturbar a síntese de elementos-chave envolvidos na estabilidade do mRNA, como microRNAs (miRNAs), bem como a expressão e síntese de proteínas de ligação de RNA, que são importantes para a degradação e estabilidade do mRNA. A perturbação severa da transcrição genética por essas drogas poderia, portanto, modificar as curvas de degradação das transcrições.
O sistema de indução do promotor representa uma terceira abordagem para medir a meia-vida de um mRNA específico. Este método mede a degradação de um mRNA específico de forma semelhante aos métodos que utilizam inibidores de transcrição. Dois tipos de sistemas de indução são frequentemente utilizados: o promotor c-fos induzido pelo soro3 e o sistema induível Tet-Off4. Com o sistema c-fos, o uso de inibidores de transcrição que podem ser tóxicos para a célula não é necessário. No entanto, este método requer a sincronização do ciclo celular, o que impede a avaliação da estabilidade real de uma transcrição durante a interfase5. Em contraste, o sistema Tet-Off permite a forte expressão do gene de interesse (GOI) o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requer a presença de dois elementos que devem ser cotransfecdos na célula para serem funcionais. O primeiro plasmídeo (pTet-Off) expressa a proteína regulatória tTA-Adv, um fator híbrido de transcrição sintética composto pelo repressor procariótico TetR (de Escherichia coli) fundido a três domínios de transativação de transcrição da proteína viral HSV VP16. O GOI é clonado no plasmídeo pTRE-Tight o controle de um promotor sintético (PTight),compreendendo a seqüência mínima do promotor citomegalovírus (CMV) fundido a sete repetições da seqüência do operador tetO. A transcrição do gene a jusante de PTight depende da interação de TetR com tetO. Na presença de tetraciclina ou sua derivada, doxiciclina, o repressor TetR perde sua afinidade com o operador de tetO, levando a uma cessação da transcrição4. As características do sistema Tet-Off tornam-no um modelo ideal para o estudo da expressão específica do mRNA em células eucarióticas, evitando potenciais efeitos pleiotrópicos que são secundários à ausência de seqüências regulatórias procadroticas em células eucarióticas6. Normalmente, linhas de células Tet-Off duplamente estáveis (HEK 293, HeLa e PC12) são usadas com este sistema para integrar cópias do regulador e plasmídeos de resposta para acesso conveniente à expressão genética controlável7,8,9.
Vários modelos de células epiteliais aláslaras na cultura têm sido usados para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. Durante anos, os pesquisadores utilizaram extensivamente células primárias humanas ou roedores10,11, bem como linhas celulares imortalizadas, como células Humanas A549 ou RLE-6TN de rato12,13. Embora geralmente sejam menos proliferativas e mais difíceis de cultura e transfect, as células epiteliais aleláscas na cultura primária continuam sendo o padrão-ouro para o estudo da função e disfunção do epitélio alveolar em condições fisiológicas e patológicas. De fato, linhas celulares imortalizadas como as células A549 não exibem as características complexas e fenótipos das células primárias, enquanto as células epiteliais alveolares na cultura primária recapitulam as principais propriedades do epitélio alveolar, em particular a capacidade de formar uma barreira polarizada e apertada14,15. Infelizmente, essas células são muito resistentes às técnicas convencionais de transfecção, como aquelas que utilizam liposóis, tornando muito difícil o uso de um sistema induzido pelo promotor, como o Tet-Off.
A modulação pós-transcricional de mRNAs é um dos métodos mais eficazes para modular rapidamente a expressão genética de uma transcrição16. A região não traduzida do mRNA 3 'UTR' desempenha um papel importante nesse mecanismo. Foi demonstrado que, ao contrário do UTR de 5', há uma correlação exponencial entre o comprimento do UTR de 3' e as complexidades celular e morfológica de um organismo. Essa correlação sugere que o UTR de 3'', como as regiões de codificação mRNA, tem sido submetido à seleção natural para permitir uma modulação pós-transcricional cada vez mais complexa ao longo da evolução17. O UTR de 3' contém vários locais de ligação para proteínas e miRNAs que afetam a estabilidade e a tradução da transcrição.
No presente trabalho, desenvolvemos uma ferramenta para investigar o papel de domínios altamente conservados no UTR de 3' de um GOI para o controle da estabilidade da transcrição. Focamos no canal epitelial de sódio, subunidade alfa (αENaC), que desempenha um papel fundamental na fisiologia epitelial aveolar18. As células epiteliais alveolares na cultura primária foram transfecentes com sucesso com os dois componentes do sistema Tet-Off, o que permite o estudo do papel do UTR de 3' na estabilidade do mRNA com um sistema que afeta minimamente a fisiologia celular e o metabolismo em comparação com o uso de inibidores de transcrição com outros protocolos. Uma estratégia de clonagem foi desenvolvida para diferenciar a expressão do GoI da do gene endógeno utilizando um epítopo não totalmente expresso (V5). A resposta e os plasmídeos regulatórios foram então transferidos para células epiteliais aláscas usando uma técnica de eletroporação de pipeta. Posteriormente, a expressão da transcrição foi medida pela incubação das células com doxiciclina em diferentes intervalos de tempo. A meia-vida da transcrição foi avaliada por RT-qPCR com um método Cq modificado utilizando o produto transfeccionado tTA-Ad mRNA para normalização. Através do nosso protocolo, oferecemos uma maneira conveniente de estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em diferentes condições e definir o envolvimento das regiões não traduzidas com mais detalhes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-LineHemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>1220G76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7.3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51026420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol - Molecular biology grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61100103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51025413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupid-exU electrophoresis system</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>AD140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System Starter Pack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C854003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3 vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V790-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA3-EGFP plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTet-Off Advanced vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTRE-Tight vector</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified alveolar epithelial cells</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAEX II Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>20021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4485697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat TNF-alpha Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>510-RT-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18090010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tet System Approved FBS</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Molecular biology Grade</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>809-115-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient transcriptionally controlled plasmid expression system for investigation of the stability of mrna transcripts in primary alveolar epithelial cells

Estudar a regulação pós-transcricional é fundamental para compreender a modulação de um determinado RNA mensageiro (mRNA) e seu impacto na homeostase celular e no metabolismo. De fato, flutuações na expressão da transcrição poderiam modificar a eficiência de tradução e, finalmente, a atividade celular de uma transcrição. Várias abordagens experimentais foram desenvolvidas para investigar a meia-vida do mRNA, embora alguns desses métodos tenham limitações que impedem o estudo adequado da modulação pós-transcricional. Um sistema de indução de promotores pode expressar um gene de interesse o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite a estimativa de meia-vida de um determinado mRNA qualquer condição experimental sem perturbar a homeostase celular. Uma grande desvantagem desse método é a necessidade de transfect as células, o que limita o uso dessa técnica em células primárias isoladas que são altamente resistentes às técnicas convencionais de transfecção. Células epiteliais alveolares na cultura primária têm sido usadas extensivamente para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. As características únicas e o fenótipo das células alveolares primárias tornam essencial estudar as modulações pós-transcricionais de genes de interesse nessas células. Portanto, nosso objetivo era desenvolver uma nova ferramenta para investigar as modulações pós-transcricionais de mRNAs de interesse em células epiteliais aerarelaras na cultura primária. Projetamos um protocolo de transfecção transitória rápido e eficiente para inserir um sistema de expressão plasmídea controlada transcricionalmente em células epiteliais alveolarprimárias primárias. Essa estratégia de clonagem, utilizando um epítopo viral para marcar o construto, permite a fácil discriminação da expressão construtiva a partir da de mRNAs endógenas. Usando um método modificado de ciclo de quantificação ΔΔ (Cq), a expressão da transcrição pode então ser quantificada em diferentes intervalos de tempo para medir sua meia-vida. Nossos dados demonstram a eficiência dessa nova abordagem no estudo da regulação pós-transcricional em várias condições fisiopatológicas em células epiteliais alveolarprimárias primárias.

Este protocolo foi utilizado com sucesso para gerar um sistema de expressão plasmídea controlado transcriptalmente tet-Off para avaliar a importância de diferentes porções do ΑENaC 3' UTR na modulação da estabilidade da transcrição em células epiteliais alveolarprimárias primárias.
O primeiro passo na implementação desse sistema foi estabelecer uma técnica de transfecção rápida, fácil e eficiente para célula...

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Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Aqui, apresentamos uma ferramenta que pode ser usada para estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em células epiteliais alveolares primárias usando um sistema de expressão indutível acoplado a uma técnica de eletroporação de pipeta.

Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Assim, nosso modelo permite o estudo da modulação pós-transcricional de uma transcrição específica em células epiteliais alveolares na cultura primária e suas condições fisiológicas e fisioterícias. Assim, a transfecção transitória das células epiteliais alveolares primárias tem efeito mínimo sobre a fisiologia celular e metabolismos, o que representa uma clara vantagem sobre protocolos clássicos usando inibidores de transcrição. Para a geração de uma resposta plasmid expressando um gene de interesse, a sequência do gene e os múltiplos locais de clonagem do vetor indutível devem ser analisados para identificar as sequências de reconhecimento nos múltiplos locais de clonagem que não estão presentes internamente no gene.Usando técnicas de polimerase taq de alta fidelidade e técnicas de PCR de sobreposição padrão, flanqueie o gene de interesse com dois sites de reconhecimento de enzimas de restrição selecionadas usando primers de designer. Uma sequência na codificação do epítope V5 a montante do gene de interesse deve ser incluída para distinguir a expressão do gene transfectado da expressão endógena. Mutantes podem ser gerados por exclusão sequencial para estudar os efeitos de diferentes três regiões não traduzidas na estabilidade do mRNA do gene usando primers reversos codificando um local de poliadenilação que gradualmente exclui as três extremidades principais da região não traduzida.Em última análise, a inserção do gene de interesse pode ser confirmada pela análise de restrição. A orientação genética e a ausência de mutações potencialmente introduzidas durante o RTR podem ser confirmadas por sequenciamento. Para a transfecção do pulmão primário do pulmão de rato tipo duas células epiteliais alveolares, semeou as células em uma única vez 10 para a sexta células por centímetro quadrado em placas de Petri de 100 milímetros na presença de meio essencial mínimo completo.Cultura por 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono com umidade. No dia seguinte, adicione 500 microliters de meio completo sem antibiótico a cada poço de uma nova placa de 12 poços e pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante esta incubação, adicione um micrograma do plasmídeo de resposta e um micrograma de vetor regulatório a um tubo de 1,5 mililitro por poço.Lave as células epiteliais alveolares com 10 mililitros por poço de 37 graus Celsius PBS sem cálcio ou magnésio e trate as células com cinco mililitros por poço de 37 graus Celsius 0,05% trypsin por dois a quatro minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células se separarem, neutralize a trippsina com 10 mililitros por poço de meio completo sem antibiótico e colete as células em um novo tubo de 50 mililitros. Lave o prato com quatro mililitros de meio fresco para coletar quaisquer células restantes e sedimentar as células por centrifugação.Resuspend a pelota em um mililitro de PBS para contar e centrifugar as células novamente. Resuspense a pelota a uma densidade de quatro vezes 10 a sete células por mililitro de tampão de resuspensão e adicione quatro vezes 10 às quintas células a cada tubo de plasmídeo e vetor com mistura suave. Coloque um tubo no dispositivo de eletroporação e encha o tubo com 3,5 mililitros de tampão eletrolítico.Deprimir completamente o pistão para inserir uma ponta de eletrodo banhado a ouro em uma pipeta e misturar suavemente o conteúdo do tubo. Aspire cuidadosamente as células com uma pipeta e insira a pipeta na estação de eletroporação até que um som de clique seja ouvido. Selecione o protocolo de eletroporação apropriado para células epiteliais alveolares e pressione Iniciar na tela sensível ao toque.Imediatamente após a transfecção, remova a pipeta e transfira as células para um poço da placa pré-aquecida de 12 poços. Quando todas as células tiverem sido eletroporadas e banhadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular, substituindo o supernaente em cada poço por meio completo por antibióticos após dois dias. O sucesso da transfecção pode ser confirmado pela expressão de EGFP, como observado pela microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo usando um vetor de controle.Para inibir a transcrição do gene de interesse, 72 horas após a transfecção substituem o supernatante por um mililitro por poço de meio completo suplementado com um micrograma por mililitro de adoxiciclina recém-preparada. Para avaliar a meia-vida mRNA do gene de interesse, devolva a placa à incubadora de cultura celular de 15 minutos a seis horas. Lavar um poço com um mililitro de PBS gelado antes de lise as células com 500 microliters de tampão de lise de um kit de extração de RNA fenol phenol disponível comercialmente e agitação suave em cada ponto de tempo experimental.Em seguida, isole o RNA de acordo com as instruções do kit e determine o rendimento e pureza do RNA por espectrofotometria em 230, 260 e 280 nanômetros. Para determinar a estabilidade do RNA isolado, primeiro trate um micrograma do RNA total de cada amostra com DNase livre de RNase para remover quaisquer traços de DNA plasmídeos. Use um kit de síntese cDNA comercialmente disponível com uma mistura de oligo dT e primers hexomer aleatórios para melhorar a eficiência de transcrição reversa para reverter transcrever o RNA total esgotado de DNA em cDNA de acordo com as instruções do fabricante.Adicione 180 microliters de água de grau de biologia molecular aos 20 microliters da mistura de reação para diluir a reação de CDNA a um nanograma de cinco nanogramas por concentração de microliter e diluir imediatamente a mistura de cDNA com água de grau de biologia molecular fresca para atingir um nanograma de 1,25 nanograma por concentração de microliter. Combine cinco microliters de mistura mestre de corante verde cibernético com 0,1 microlitr de água de grau de biologia molecular, 0,45 microliters de 7,5 micromolars para a frente, 0,45 microlitres de 7,5 micromolar reverso primer, e quatro microliters de 1,25 nanograma por microlitra de cDNA para obter um volume total de reação de 10 microliters. Coloque as amostras em um termociclador qPCR e amplify o gene de interesse da tag V5 e os amplificadores de avanço do transactivador de tetroclina utilizando as condições qPCR conforme indicado e gere uma curva de fusão de alta resolução para avaliar as temperaturas específicas de fusão dos amplicons desejados e garantir a ausência de picos de amplicon de ruído.Esta técnica de eletroporação pipeta facilita uma taxa de eficiência de transfecção de 25 a 30%, conforme observado pelas razões das células EGFP detectadas por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. O tratamento de células epiteliais alveolares com um micrograma por mililitro de doxiciclina não tem impacto significativo na expressão do endogênio alfa ENaC mRNA a qualquer momento durante o período de tratamento. Usando um sistema de expressão plasmídeo controlado transcricionalmente, como demonstrado, o sinal V5 alfa ENaC poderia ser normalizado de acordo com o sinal avançado do transactivador de tetraciclina para determinar a eficiência da transfecção usando o método de ciclo de quantificação delta duplo.A meia-vida do alfa ENaC mRNA é até sete vezes menor na presença da tetraciclina fora do sistema do que na presença de actinomicina D, confirmando que a actinomicina D leva a uma estabilização artefato alfa ENaC mRNA. Além disso, o tratamento alfa do fator ciclohexamida e necrose tumoral diminuiu significativamente a estabilidade da transcrição, enquanto lipopólises não. Mudanças significativas na modulação da estabilidade do ENaC alfa V5 podem ser induzidas dependendo das regiões excluídas e incluídas das três principais regiões não traduzidas.Além disso, a expressão sobre de proteínas específicas de ligação de RNA diminui a estabilidade de 5 alfa ENaC mRNA em comparação com a transfecção com um pcDNA vazio três plasmídeos. Esta ferramenta será útil para consultar novas percepções sobre a regulação pós-transcrição dos genes-chave envolvidos na função do epitélio alveolar e suas condições fisiológicas ou patológicas.

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JoVE Core

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Genetics

Unit 1

Additional Roles of RNA

SCIENTISTS IN ACTION

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Genética

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

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In Vitro Ensaio de bioluminescência para caracterizar o ritmo circadiano em células epiteliais mamárias

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

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Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

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Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...