Name: analysis of side population in solid tumor cell lines
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 og 81972787; Naturvidenskab Stiftelsen af Tianjin City (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundforskningsfonde for de centrale universiteter, Nankai-universitetet 63191153.

1. Celleforberedelse
<ol><li>Celle fordøjelse og neutralisering<ol>
<li>Frø tumorceller (såsom MDA-MB-231 celler) i en 6 godt plade, og kultur dem i en 37 ° C inkubator leveres med 5% CO2.</li>
		<li>Høst celler, når deres tæthed når omkring 90%. Aspirér dyrkningsmediet grundigt og vask cellerne 2x med 3 mL fosfat buffered saltvand (PBS). BEMÆRK: For at undersøge virkningerne af signalvejshæmmere (f.eks. FRA1-hæmmer) eller aktivatorer (f.eks. STAT3-aktivator) på tumorcellers stæsseegenskabe...

<ol>
	<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Batlle, E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+revisited.">Cancer stem cells revisited.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133/CD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component.">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).</li><li>Bailey, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCLK1+marks+a+morphologically+distinct+subpopulation+of+cells+with+stem+cell+properties+in+preinvasive+pancreatic+cancer.">DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).</li><li>Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44++CD24(-)+prostate+cells+are+early+cancer+progenitor/stem+cells+that+provide+a+model+for+patients+with+poor+prognosis.">CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis.</a> British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90++cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Schulenburg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+basic+science+and+in+translational+oncology:+can+we+translate+into+clinical+application.">Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application.</a> Journal of Hematology &amp; Oncolcology. 8, 16 (2015).</li><li>Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Antigen-1+Enriches+for+a+Cancer+Stem+Cell-Like+Subpopulation+in+Mouse+Gastric+Cancer.">Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer.</a> Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+identification+and+sorting+using+the+Hoechst+33342+side+population+(SP).">Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP).</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).</li><li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABC+Transporters+in+Cancer+Stem+Cells:+Beyond+Chemoresistance.">ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).</li><li>Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumitremorgin+C+reverses+multidrug+resistance+in+cells+transfected+with+the+breast+cancer+resistance+protein.">Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein.</a> Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).</li><li>Takara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+calcium+antagonists+on+ABCG2/BCRP-mediated+drug+resistance+and+transport+in+SN-38-resistant+HeLa+cells.">Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells.</a> Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).</li><li>Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+specific+and+general+inhibitors+of+the+three+major+human+ATP-binding+cassette+transporters+P-gp,+BCRP+and+MRP2+among+registered+drugs.">Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs.</a> Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).</li><li>Challen, G. A., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+side+order+of+stem+cells:+the+SP+phenotype.">A side order of stem cells: the SP phenotype.</a> Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).</li><li>Wu, C., Alman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+in+human+cancers.">Side population cells in human cancers.</a> Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+Colivelin+treatment+ameliorates+memory+impairment+related+to+Alzheimer's+disease.">Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).</li><li>Marotta, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK2/STAT3+signaling+pathway+is+required+for+growth+of+CD44(+)CD24(-)+stem+cell-like+breast+cancer+cells+in+human+tumors.">The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).</li><li>Zhang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Lead+to+Drug+Candidate:+Optimization+of+3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine+Derivatives+as+Agents+for+the+Treatment+of+Triple+Negative+Breast+Cancer.">From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer.</a> Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).</li><li>Tam, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+alpha+is+a+central+signaling+node+and+therapeutic+target+for+breast+cancer+stem+cells.">Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).</li><li>Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analyses+as+a+critical+parameter+in+defining+the+side+population+(SP)+phenotype.">Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype.</a> Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).</li><li>Petriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+the+side+population+(SP).">Flow cytometry of the side population (SP).</a> Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).</li><li>Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+MDA-MB-231+human+breast+cancer+cells+exhibits+cancer+stem+cell-like+properties+without+higher+bone-metastatic+potential.">Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential.</a> Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).</li><li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM3+mediates+inflammatory+signaling+to+promote+cancer+cell+stemness.">ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness.</a> Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).</li><li>Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baicalein+Suppresses+Stem+Cell-Like+Characteristics+in+Radio-+and+Chemoresistant+MDA-MB-231+Human+Breast+Cancer+Cells+through+Up-Regulation+of+IFIT2.">Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2.</a> Nutrients. 11 (3), 624 (2019).</li><li>Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapped+doxorubicin+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+anoikis-resistant+cancer+cells.">Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells.</a> Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).</li><li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells.">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+for+lung+cancer+risk+of+PM2.5+:+Induction+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+properties+in+human+non-small+cell+lung+cancer+cells.">The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).</li><li>Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Modeling+of+ABCG2+Transporter+Heterogeneity:+A+Quantitative,+Single-Cell+Analysis+of+the+Side+Population+Assay.">Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay.</a> PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+inhibitor+of+angiogenesis+inversely+correlates+with+side+population+phenotype+and+function+in+human+lung+cancer+cells.">An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells.</a> Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).</li><li>Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAIL-expressing+mesenchymal+stem+cells+kill+the+putative+cancer+stem+cell+population.">TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population.</a> British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).</li><li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties.">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+minor+groove-binding+ligands:+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors.">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li></ol>

Der er flere vigtige punkter at huske på for SP assay. Den første er valget af en korrekt blokker, såsom Verapamil eller Reserpine, for hver cellelinje, fordi SP-cellernes "gate" placering bestemmes i henhold til den position, hvor et stort antal SP-celler forsvinder efter tilføjelsen af blokkeren. For MDA-MB-231 cellelinjen fungerer Reserpine godt. For andre cellelinjer kan forskellige blokkere dog fungere bedre.
Den anden er koncentrationen af Hoechst 33342. Procentdelen af SP-celler ste...

Kræft stamceller (CSC'er) er delmængder af celler med selvfornyelse evne og flere differentiering potentiale, som spiller en afgørende rolle i tumor vækst, metastaser, og gentagelse1,2. I øjeblikket, CSC'er er blevet identificeret til at eksistere i en række ondartede tumorer, herunder lunge, hjerne, bugspytkirtel, prostata, bryst, og leverkræft3,4,5,6,7,8,9. Identifikation af CSC'er i disse tumorer er hovedsageligt baseret på tilstedeværelsen af overflademarkørproteiner, såsom højt og / eller lavt udtryk for CD44, CD24, CD133 og Sca-19,10, men en unik markør, der kan skelne CSC'er fra ikke-CSC'er, er ikke blevet rapporteret indtil videre. I øjeblikket er flere teknikker bruges til at identificere og rense CSC'er i tumorvæv eller tumor cellelinjer. Disse teknikker er designet ud fra CSC'ernes specifikke egenskaber. Blandt dem er assays og sortering af sidepopulation (SP) celler to af de almindeligt anvendte metoder.
SP celler blev oprindeligt opdaget af Goodell et al.11, når de karakteriserede hæmatopoietiske stamceller i mus knoglemarvsceller. Når musen knoglemarvsceller blev mærket med fluorescerende farvestof Hoechst 33342, en lille gruppe af Hoechst 33342 svagt farvede celler dukkede op i de to-dimensionelle prik plot af en flow cytometri assay. Hoechst 33342 er et DNA-bindende farvestof og har mindst to bindende tilstande, der fører til forskellige spektralegenskaber. Ved visning af fluorescensemission ved to bølgelængder på samme tid kan flere populationer afsløres12. I deres analyse, var Hoechst 33342 ophidset på 350 nm og fluorescens blev målt ved hjælp af 450/20 nm band-pass (BP) filter og 675 nm kant filter long-pass (EFLP)11. Sammenlignet med hele populationen af knoglemarvsceller blev denne gruppe celler beriget med hæmatopoietiske stamceller kaldet SP-celler11. SP celler er i stand til hurtigt at udvise Hoechst 33342. Efflux af dette farvestof er relateret til ATP-bindende kassette (ABC) transportører13, som kan hæmmes af nogle stoffer som Fumitremorgin C14, Verapamil og Reserpine15,16. Derefter blev forskellige proportioner af SP-celler påvist i en række væv, organer, tumorvæv og tumorcellelinjer17,18,19. Disse SP-celler har mange karakteristika ved stamceller17,19.
Dette manuskript beskriver Hoechst 33342 mærkning og farvning af dyrkede tumorceller og analyse af SP-celler ved flowcytometry. Desuden er optimering af Hoechst 33342 koncentration og den korrekte blocker udvælgelse til en bestemt tumor celle linje ved hjælp af denne fremgangsmåde vist. Endelig er virkningerne af stemness fremme eller hæmning signaler på andelen af SP i tumorceller er påvist. De eksperimentelle eksempler viser, at analyse af SP kan bruges til at udforske virkningerne af forskellige signaler, såsom genekspression, små hæmmere, aktivatorer, cytokiner og kemokiner, på tumorstilke. Sammenlignet med andre metoder til isolering og rensning af CSC'er, såsom sortering af CD44+/ CD24- befolkning, aldehyd dehydrogenase (ALDH) analyse, og tumor kugle dannelse assays, denne metode er lettere for manipulation og er omkostningseffektiv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3516</td>
			<td>9.5 cm2 (approx.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colivelin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-P1061A</td>
			<td>Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (BIOIND)</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSDiva</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>352054</td>
			<td>12 x 75 mm, 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td>(3&#946;, 16&#946;, 17&#945;, 18&#946;, 20&#945;)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKLB816</td>
			<td>Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of side population in solid tumor cell lines

Kræft stamceller (CSC' er) er en vigtig årsag til tumor vækst, metastaser, og tilbagefald. Isolation og identifikation af CSC'er er af stor betydning for tumorforskning. I øjeblikket er flere teknikker, der anvendes til identifikation og rensning af CSC'er fra tumorvæv og tumor cellelinjer. Adskillelse og analyse af sidepopulationer (SP) celler er to af de almindeligt anvendte metoder. Metoderne er afhængige af CSC'ernes evne til hurtigt at udvise fluorescerende farvestoffer, såsom Hoechst 33342. Farvestoffets efflux er forbundet med de ATP-bindende kassettetransportører (ABC) og kan hæmmes af ABC-transporterhæmmere. Metoder til farvning af dyrkede tumorceller med Hoechst 33342 og analyse af andelen af deres SP-celler ved flowcytometry er beskrevet. Denne analyse er praktisk, hurtig og omkostningseffektiv. Data genereret i denne analyse kan bidrage til en bedre forståelse af effekten af gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler på tumorcellernes stængelegenskaber.

Der blev udført fire eksperimentelle SP-analyser efter denne metode. I den første opdagede vi andelen af SP-celler i MDA-MB-231, som er en tredobbelt negativ human brystkræftcellelinje under normale forhold. Efter celletælling blev Hoechst 33342 tilsat et rør, der indeholdt 1 x 106 celler, til en endelig koncentration på 3 μg/mL. Reserpine og Hoechst 33342 blev tilsat et andet rør til de endelige koncentrationer på henholdsvis 40 μM og 3 μg/mL. PI blev tilføjet til begge rør. Prikplottet af FSC-A ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines at JoVE.com

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

En bekvem, hurtig og omkostningseffektiv metode til at måle andelen af sidepopulationceller i faste tumorcellelinjer præsenteres.

Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Analyse af sidepopulation celler er en af de almindeligt anvendte metoder til at isolere og identificere kræft stamceller fra tumor væv og tumor cellelinjer. Denne analyse er praktisk, hurtig og omkostningseffektiv. Denne metode kan bidrage til en bedre forståelse af effekten af gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler om tumorcellers støseegenskaber.Mange faktorer kan påvirke procentdelen af SP-celler i denne analyse, så det er vigtigt at udforske de rette forhold før det formelle eksperiment. Frø tumorceller i en seks-godt plade, og inkubere dem i en 37-graders Celsius inkubator leveres med 5% kuldioxid. Når celletætheden når omkring 90%, suges kulturmediet og vaskes cellerne to gange med tre milliliter PBS.Derefter tilsættes 500 mikroliter på 0,25% trypsin-EDTA til hver brønd og inkubere pladen ved 37 grader Celsius i et til tre minutter. Bank forsigtigt på pladen for at løsne cellerne, tilsæt tre milliliter PBS suppleret med 2%FBS til hver brønd, og pipette cellerne op og ned tre til fem gange for at sprede celleklump. Undersøg celleaffjedringen under mikroskopet.Hvis der er celleklumper til stede, skal suspensionen passeres gennem en 70-mikrometer si. Overfør cellerne til et 15-milliliter centrifugerør, og centrifuge dem ved 200 gange g i fem minutter. Fjern supernatanten, og ophæv cellerne i tre milliliter PBS suppleret med 2%FBS, pipetter cellerne op og ned tre til fem gange for at blande.Tæl celler under mikroskopet ved hjælp af et hæmocytometer, og fortynd dem i PBS suppleret med 2%FPS til en endelig koncentration på en gange 10 til de seks celler pr milliliter. Forbered to fem-milliliter, polystyren, rundbunds reagensglas, og tilsæt en milliliter af celleaffjedringen til hvert rør. Mærk det ene rør som reagensglas og det andet som et blockerkontrolrør.Forbered en opløsning af blokker ved at fortynde den til den relevante koncentration. Tilsæt det til blokkerkontrolrøret og bland godt, og inkubter derefter røret ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Ryst røret hvert 10. minut.Der fremstilles en opløsning af Hoechst 33342 ved at fortynde den til den relevante koncentration. Tilsæt det til reagensglasset og blokeringskontrolrøret separat og bland godt, og inkubter derefter rørene ved 37 grader Celsius i 60 minutter. Ryst rørene hvert 10. minut.Efter inkubationen centrifuges cellerne i fem minutter ved 200 gange g og fire grader Celsius, og derefter forsigtigt suge supernatanten. Resuspend cellerne i hvert rør med en milliliter iskold PBS suppleret med 2% FBS, derefter pipette cellerne op og ned for at blande. Tilsæt en mikroliter af en milligram-per-milliliter propidium jod, eller PI, til hvert rør og bland.Klik på fanen Parametre i flowcytometersoftwaren. Vælg først parametrene for henholdsvis FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red og PI. Vælg for det andet den logaritmiske skala for PI-parameteren.Endelig skal du vælge areal- og breddeskalaer for parametrene FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red og PI. Kør først cellerne fra reagensglasset, og kør derefter cellerne fra blokeringskontrolrøret ved hjælp af de samme spændinger og porte. Indsaml 20 til 100.000 hændelser fra hver prøve for at analysere procentdelen af SP-celler.Denne metode blev brugt til at påvise andelen af SP-celler i MDA-MB-231 humane brystkræft celle linje. Prikplottet af FSC-A versus PI-A viste en population af døde celler, cellerester og hovedpopulationen af PI-negative celler, som blev udsat for yderligere analyse. En enkelt cellepopulation, der var lukket fra prikplottet mellem FSC-A versus FSC-W og prikplottet af SSC-A versus SSC-W, blev brugt til at analysere andelen af SP-celler, som var omkring 0,9% i ubehandlede celler og ca. 0,09% i celler behandlet med reserpine.Forskellige farvningskoncentrationer af Hoechst 33342 blev testet på MDA-MB-435 celler, og det blev fastslået, at to mikrogram pr. milliliter var optimalt til SP-analyse. Lave koncentrationer gjorde det vanskeligt at skelne SP-celler fra andre populationer, mens høje koncentrationer fik SP-celler til at forsvinde. Verapamil og reserpine blev testet for at bestemme den korrekte blocker for MDA-MB-435 celler.Omkring 0,4% af cellerne udvist farvestoffet efter verapamil behandling, men forholdet faldt til omkring 0,1% efter reserpine behandling, viser, at reserpine er en mere passende blocker for denne celle linje. Denne protokol blev også brugt til at bestemme andelen af SP-celler i A549 humane lunge adenocarcinom celler behandlet med STAT3 aktivator colivelin og i T47D humane brystkræftceller behandlet med FRA1 hæmmer SKLB816. Denne analyse giver fingerpeg om den lovgivningsmæssige virkning af signalering veje på funktionerne i kræft stamceller og letter opdagelsen af nye mekanismer, som i sidste ende kan guide den målrettede behandling af tumorer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Udnyttelse af DNA-farve-udløst sidebefolkningens fenotype til at detektere og rense kræftstamceller fra biologiske prøver

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown af genekspression i kræft cellelinjer til at studere ansættelse af monocytter/makrofager at Tumor mikromiljø

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet Tumor DNA fra klinisk-patologisk prøvemateriale ved hjælp af Touch aftryk cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Røntgen følsomhed af kræft stamceller i lungekræft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellering af primære knogletumorer og knoglemetastase med implantation af fast tumortransplantat i knogle

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Cirkulerende tumorcellelinjer: et innovativt værktøj til grundlæggende og translationel forskning

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...